【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）催化合成茶氨酸的菌株篩選與重組菌的構(gòu)建生物技術碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩士學位論文 催化合成茶氨酸的菌株篩選與 重組菌的構(gòu)建 of as a of of as a of I 摘 要 茶氨酸（ 1950年首次從綠茶中分離得到的，是茶葉中的特征氨基酸，也是茶葉的呈味物質(zhì)之一，具有很好的生理功能和商業(yè)價值 。其制備研究是目前茶學研究中的一個熱點。由于從茶葉中提取高純度的茶氨酸，成本高昂；化學合成茶氨酸工藝較復雜；組織培養(yǎng)合成茶氨酸產(chǎn)量低。開展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理論意義和實踐價值。本論文針對茶氨酸的微生物發(fā)酵法制備技術，開展了菌株篩選和工程菌構(gòu)建兩方面工作，將生物技術運用到天然產(chǎn)物制備技術中。本論文通過比較不同微生物催化 鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力大小，對微生物進行了篩選，明確了 9 種微生物催化合成茶氨酸的能力；通過基因克隆技術構(gòu)建了重組菌，優(yōu)化了重組菌催化合成茶氨酸的條件，重 組菌株酶活達到出發(fā)菌株的 15 倍，茶氨酸產(chǎn)量達到 。主要研究結(jié)果如下： 1、對 9 種微生物催化 現(xiàn)它們催化合成茶氨酸的能力都很低。茶氨酸的最大生成量僅為 。 2、以培養(yǎng)好的 菌液為模板進行 應，將擴增出的 連接構(gòu)建重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒建重組菌。重組菌株經(jīng) 2誘導后， 酶活性檢測，重組菌株每克濕菌體的酶活達到 右，約是出發(fā)菌株 15 倍。 3、本實驗優(yōu)化了 重組菌催化 組菌經(jīng) 37培養(yǎng) 2h 左右，然后再加 2誘導表達 4h 收集菌體。 1含 谷氨酰胺、 酸乙胺、 70mg/體、 30培養(yǎng) 4 小時， 茶氨酸 的 最大 生成 量為 ，即每克濕菌體可催 化合成茶氨酸的量為 420g/L。 化率為 氨酰胺（ 乙胺合成茶氨酸 的量為 ， 本實驗中的 是 茶氨酸 產(chǎn)量有所提高。 本實驗構(gòu)建的重組菌具有較好的催化 L谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力，可以嘗試用其進行發(fā)酵生產(chǎn)茶氨酸 小試 實驗，可以嘗試將本實驗構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不同表達載體系統(tǒng)中，以尋找更適合 實驗對于微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)茶氨酸等方面的工作具有較 好的指導作用和實際價值。 關鍵詞： 篩選，茶氨酸， 重組菌 ， 催化合成 950， is of of It of is a t is to a of is of by is of is In we to of In of of as a of it of is We a of of is 5 as 1、 of as a of It a of of is 2、 We by 2 g of is .0 it is 5 3、 of 7 h， 2 h ml 70mg/ml 0 h of ，g 20g/L as to by as to 0% a of as a of be be to of a of 錄 第一章 緒論 . 1 氨酸研究的歷史與現(xiàn)狀 . 1 氨酸體內(nèi)生物合成途徑 . 2 氨酸的生理功能研究與開發(fā)利用前景 . 3 . 6 取分離技術 . 6 學合成技術 . 6 織培養(yǎng)技術 . 7 生物發(fā)酵技術 . 8 氨酸測定方法 . 9 第二章 實驗設計方案 . 10 驗目的 . 10 實驗的主要內(nèi)容 . 11 種微生物催化合成茶氨酸能力的測定 . 11 . 11 . 11 組菌催化合成茶氨酸反應條件優(yōu)化 . 11 術路線 . 11 種微生物催化合成茶氨酸能力的測定 . 11 達 . 11 組菌催化合成茶氨酸反應條件優(yōu)化 . 12 第三章 9 種微生物催化合成茶氨酸能力的測定 . 13 料和試劑 . 13 驗方法 . 14 微生物生長曲線制作方法 . 14 體收集方法 . 15 化合成茶氨酸反應方法 . 15 氨酸測定方法 . 15 果與分析 . 16 微生物生長曲線制作 . 16 氨酸標樣 . 19 種微生物催化合成茶氨酸能力測定 . 20 結(jié) . 21 第四章 大腸桿菌 . 22 料和試劑 . 22 驗方法 . 24 物的設計與合成 . 24 菌液為模板進行 . 25 . 25 的片斷和載體雙酶切 . 25 低融點膠電泳回收酶切的目的片斷和載體 并進行產(chǎn)物純化 . 26 接反應 . 26 . 27 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞 . 27 法小批量抽提質(zhì)粒 . 27 酸電泳 . 28 組質(zhì)粒的雙酶切驗證 . 28 組質(zhì)粒的 . 28 因序列測定 . 29 果與分析 . 29 . 29 . 29 組質(zhì)粒的雙酶切驗證 . 31 組質(zhì)粒的 . 32 因序列測定 . 32 結(jié) . 34 第五章 . 35 料和試劑 . 35 驗方法 . 36 組菌生長曲線制作方法 . 36 同誘導劑濃度優(yōu)化實驗 . 36 同誘導溫度優(yōu)化實驗 . 37 達產(chǎn)物 . 37 . 37 果與分析 . 38 組菌生長曲線制作 . 38 同誘導劑濃度優(yōu)化實驗結(jié)果 . 39 同誘導溫度優(yōu)化實驗結(jié)果 . 39 達產(chǎn)物 . 40 . 41 結(jié) . 41 第六章 重組菌催化合成茶氨酸反應條件優(yōu)化 . 42 料和試劑 . 42 驗方法 . 42 同菌量優(yōu)化實驗 . 42 化實驗 . 42 . 42 同反應時間優(yōu) 化實驗 . 43 照處理 . 43 果與分析 . 43 同菌量優(yōu)化實驗結(jié)果 . 43 同 化實驗結(jié)果 . 44 同底物濃度優(yōu)化實驗結(jié)果 . 45 同反應時間優(yōu)化實驗結(jié)果 . 46 照處理結(jié)果 . 47 結(jié) . 47 V 第七章 討論與總結(jié) . 49 參考文獻 . 51 致 謝 . 54 作者簡歷 . 55 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 卞青霉素 苷三磷酸 基 對 化乙錠 二胺四乙酸 效液相色譜法 丙基硫代 B 培養(yǎng)基 克隆位點 密度 合酶鏈式反應 ,N,N,N,N,N,N,中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 氨酸研究的歷史與現(xiàn)狀 茶氨酸（ 茶葉中的特征氨基酸，也是茶葉的呈味物質(zhì)之一。它是 1950年由日本酒戶彌二郎從玉露茶新梢中發(fā)現(xiàn)的，并命 名為茶氨酸 （ 酒戶彌二郎 1950） 。到目前為止，在其它植物中很少有發(fā)現(xiàn)茶氨酸的報道，除了在蕈、茶梅、蘑菇、油茶、紅山茶中已檢測出微量存在外，在其它植物中尚未發(fā)現(xiàn)。茶氨酸是茶樹中含量最高的游離氨基酸，在茶樹的新梢芽葉中， 70%左右的游離氨基酸是茶氨酸。在茶鮮葉中，一般茶氨酸的含量占干重的 1% 2%，有些名特優(yōu)茶含量可超過 2%。在茶湯中，茶氨酸的浸出率可達 80%，對綠茶有重要作用 （ 宛曉春 2003） 。近年對茶葉保健成分的研究中，茶氨酸是比較引人注目的一個化合物，它的許多生理作用被發(fā)現(xiàn)后，合成及提取茶氨酸也成了廣 泛關注的研究課題。 茶氨酸屬酰胺類化合物 ,化學命名為： 結(jié)構(gòu)式如圖 子式為： 子量為 然界存在的茶氨酸均為 品為白色針狀結(jié)晶，熔點 217 218（分解）。 +易溶于水，而不溶于無水乙醇和乙醚，且溶解性隨溫度升高而增大。水溶液成微酸性，具有焦糖的香味和類似味精的鮮爽味，味覺閥值 經(jīng) 6的鹽酸水解后生成 茚三酮反應成紫色。與堿式碳酸銅反應生成淡紫色柱狀銅鹽 （ 陳椽 1983） 。茶氨酸的性質(zhì)較穩(wěn)定。將茶氨酸溶液煮沸5將茶氨酸溶于 5下儲放 12 個月，茶氨酸含量不變。因此在通常的食品加工、殺菌過程中，茶氨酸的性質(zhì)不會發(fā)生變化。 圖 氨酸結(jié)構(gòu)式 of 5作為茶葉的特征氨基酸，茶氨酸幾乎存在于茶樹的所有器官和組織中。經(jīng)大量研究表明，茶氨酸在茶樹的根部形成，然后向新梢積聚，因而茶樹新梢中茶氨酸含量最高，老葉、根部、莖部也有少量分布，而果皮、子葉中含量最少。茶氨酸的形成 是茶樹儲存氮的手段之一，這是因為茶氨酸被茶氨酸水解酶水解為谷氨酸和乙胺，乙胺在胺氧化酶的作用下產(chǎn)生氨和乙醛，氨可作為氮源供茶樹的幼齡組織生長，因此茶氨酸是茶樹幼芽光合作用開始前有機碳骨架合成的起始物，而且也是茶樹中多酚類物質(zhì)的重要前體 （ 張 瑩等 2003） 。茶氨酸在茶樹中的積累與光照、溫度和合成前體密切相關。研究發(fā)現(xiàn)當溫度為 25，黑暗條件下，在培養(yǎng)基中加入鹽酸乙胺能明顯增加茶中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 2 氨酸的積累。 1992年我國學者李榮林等對茶樹新梢中茶氨酸的分布情況及其在不同季節(jié)、不同品種和不同栽培條件下含量的變化作了較全面的研究 （ 李榮林 1992） 發(fā)現(xiàn)，隨著茶樹葉片成熟度的增加，茶氨酸的含量逐漸降低，因此茶氨酸可作為茶鮮葉嫩度的化學指標之一；茶氨酸在新梢中的含量隨季節(jié)的不同存在顯著的差異，其在春茶新梢中的含量是在夏茶中的 4倍，是在秋茶中的 7倍；環(huán)境對茶氨酸含量也有較大的影響，土壤的 利于茶氨酸的積累，而氨態(tài)氮的存在和遮蔭環(huán)境有利于茶氨酸的積累；茶葉制作過程不同，其茶中茶氨酸的含量也有明顯變化。綠茶制造過程中由于谷氨酸的轉(zhuǎn)化使茶氨酸的含量呈增加趨勢；黃茶、青茶、黑茶制造過程中谷氨酸的變化不明顯，茶氨酸呈減少趨勢；白茶制造 過程中茶氨酸變化的特點是長時間的萎凋中蛋白質(zhì)分解，谷氨酸增多并向茶氨酸轉(zhuǎn)化，因此茶氨酸開始表現(xiàn)為增加趨勢直至干燥才有所減少；而紅茶發(fā)酵過程茶氨酸變化復雜，有增有減，總趨勢是減少。 1997年鐘俊輝等研究了不同培養(yǎng)條件、不同碳源和不同環(huán)境對茶愈傷組織培養(yǎng)及其茶氨酸的積累的影響，發(fā)現(xiàn)激素 和 6時對茶氨酸積累最有利；而培養(yǎng)基中碳源不同，愈傷組織的增長速率及其茶氨酸的含量的差異并不顯著，但當用不同濃度的蔗糖作為碳源時發(fā)現(xiàn)，隨著蔗糖濃度的增加茶氨酸的積累呈上 升趨勢 （ 鐘俊輝等 1997） 。 1997年齊桂年等研究表明，不同工藝殺青對氨基酸組分含量有一定的影響，其氨基酸總量和茶氨酸含量均為蒸汽殺青鍋炒殺青滾筒殺青，并且提出可通過工藝技術對茶葉中茶氨酸和其它氨基酸的含量進行調(diào)控 （ 齊桂年等 1997） 。 雖然人們普遍認為茶氨酸可作為評價綠茶質(zhì)量的重要標志之一，但對紅茶茶氨酸的含量與其品質(zhì)的相關性問題有著不同的看法。 7種茶的茶氨酸含量進行分析時發(fā)現(xiàn)，某些紅茶中茶氨酸的含量并不比綠茶和烏龍茶低，有的紅茶 (如中國的云南茶 )中茶氨酸的含量甚至還高于某些綠茶 （ H et 997） 。趙和濤等在研究茶氨酸的生化特性時測定了我國六大茶類中茶氨酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以白茶中茶氨酸的含量最高，為 00次是綠茶和黃茶，在 100茶相對綠茶低一點，為 100g；青茶為 100g；含量最低的是黑茶，只有 100 g，這可能是由于其加工過程中特有的渥堆作用導致了茶氨酸大量損失 (趙和濤 1994)。因此也有學者認為茶氨酸的含量也可 作為紅茶品質(zhì)的重要評價因子之一。 氨酸體內(nèi)生物合成途徑 茶氨酸在茶樹根部由茶氨酸合成酶催化谷氨酸和乙胺反應合成，然后通過枝干送至葉部，并積累在葉中。芽與第一葉中含量最高，往下逐漸降低。在光照射下茶氨酸會分解為谷氨酸和乙胺。谷氨酸成為氮源，乙胺氧化后被用于合成兒茶素 (如圖 這個分解代謝在蔽光條件下受到抑制。因此遮蔭栽培的茶葉中茶氨酸含量較高。 相反則是多酚類含量高 (楊賢強 1982，村松敬一郎1991)。 日本的玉露、碾茶 (抹茶原料 )的栽培就是采用遮蔭法以提高茶葉中茶氨酸含量。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 3 圖 氨酸在茶樹體內(nèi)代謝途徑 in 樹中茶氨酸合成產(chǎn)前體是谷氨酸和乙胺，這一點己用 14C 示蹤的方法得到了證實 （ 1974，竹尾忠一 1981） 。乙胺是由丙氨酸脫羧而來 （ 1974） 。丙氨酸和谷氨酸雖然廣泛存在于各種動植物體內(nèi)，但卻只有茶樹才具有大量合成茶氨酸的能力。這是因為茶樹體內(nèi)具有 胺連接酶 又稱茶氨酸合成酶 )，該酶催化如下反應： 乙胺 + 茶氨酸 +酸。該酶己被 K 證實對谷氨酸、乙胺和 有較高的特異親和力，且僅為茶樹所特有， 但該酶在體外極易失活 （ 1965） 。茶氨酸體內(nèi)合成過程中另一重要的酶是丙氨酸脫羧酶 (， 它催化丙氨酸脫羧形成乙胺，在體外的穩(wěn)定性比茶氨酸合成酶要高得多。 茶氨酸的生理功能研究與開發(fā)利用前景 從 茶氨酸自發(fā)現(xiàn)以來，一直是被作為茶葉的主要品質(zhì)成分廣 為研究。近幾年來，茶氨酸具有的一些特殊生理功能不斷地被發(fā)現(xiàn)和研究，特別是其具有的藥用功能成為研究的熱點。茶氨酸的主要生理功能有： （ 1）降血壓作用。 等報道了茶氨酸對先天性高血壓患者具有降壓作用 （ 1998a） 。血壓是通過人體的中樞及末梢神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)兒茶酚胺和 5 等通過實驗證明，服用茶氨酸后 5增加了 5鼠體內(nèi)的 5給自發(fā) 性高血壓老鼠注射不同劑量的茶氨酸時，血壓也呈下降趨勢，并且下降的程度與注射的劑量呈正比關系，但茶氨酸對血壓正常的大鼠沒有降血壓作用 （ 1998b） 。 （ 2）增強抗腫瘤藥物的療效。近期的研究表明茶氨酸本身雖無抗腫瘤活動，卻能提高多種抗腫瘤藥物的療效?？拱┧幎練⑺兀?茶氨酸配合應用時，可抑制 將茶氨酸與抗癌藥阿霉（ 時使用時，增強了阿霉素抗癌的功效，茶氨