-基因工程的基本操作程序

.,姐的心里不缺人不死唐三藏-高調(diào)艿是姐的風(fēng)格、黑的不是社會(huì)，是心。勞資就是不淑女#奈何橋上唱征服飛車妹子雄起無(wú)敵硬妹拒絕狗友媳婦為王姐我輸?shù)钠?。你若離去丶巴掌扇去*我天生傲骨怎能服輸哥不會(huì)英文，只會(huì)拼音一槍崩了你。帆布鞋也比你高跟鞋優(yōu)雅、未來(lái)學(xué)霸命你！我素學(xué)渣我怕誰(shuí)甩我者亡i婷大爺傷我者亡墳地里唱嗨歌別碰我心#歐霸！時(shí)賤去尼瑪淑女少年就要狂我要當(dāng)學(xué)霸、我行我素。寧無(wú)愛(ài)哥丶看破繁華說(shuō)我拽你能奈我何愛(ài)滾哪滾哪！你快滾！傷我你不配&你拿什么資本跟我傲！|你特么算什么東西不過(guò)如此你已被我out冥花有主絕誘惑矯揉造作無(wú)需挽留莫犯賤。_愛(ài)你等于作孽窮的只有愛(ài)、sorry請(qǐng)滾。氣勢(shì)比天高大陸男神勞資是個(gè)好菇?jīng)鰢?guó)產(chǎn)好姑娘*Rollforme給我滾國(guó)際帥鍋丶直覺(jué)不是理由抱歉。nl、不配若離，必棄。男人拽照樣甩變態(tài)人士強(qiáng)迫癥患者補(bǔ)刀團(tuán)團(tuán)長(zhǎng)你柔弱給誰(shuí)看莫裝純午夜埋葬者霸道姐騷娘們勞資愛(ài)上尼瑪了姐不缺愛(ài),1.2基因工程的基本操作程序,.,基因工程基本操作的四個(gè)步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用,載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。,才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。,.,一、目的基因的獲取,.,1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因,1.基因文庫(kù)的概念:,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。,2.基因文庫(kù)的種類:,基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù),.,基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù),某生物體內(nèi)全部DNA,許多DNA片段,受體菌群體,與運(yùn)載體連接導(dǎo)入,基因組文庫(kù),cDNA,受體菌群體,與運(yùn)載體連接導(dǎo)入,cDNA文庫(kù),某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNA,.,基因的結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),外顯子,內(nèi)含子,終止子,啟動(dòng)子,原核,真核,.,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn):,基因結(jié)構(gòu),.,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),非編碼區(qū),內(nèi)含子,外顯子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(啟動(dòng)子)。,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),基因結(jié)構(gòu),.,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,轉(zhuǎn)錄,翻譯,轉(zhuǎn)錄,翻譯,.,基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,基因組文庫(kù)的構(gòu)建,提取某種生物的全部DNA,用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,重組載體,基因組文庫(kù),導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,.,cDNA文庫(kù)的構(gòu)建-逆轉(zhuǎn)錄法：,提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA,單鏈DNA,雙鏈cDNA片段,重組載體,與載體連接,cDNA文庫(kù),反（逆）轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存,.,思考？,真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？,.,真核細(xì)胞的cDNA的獲取,編碼區(qū),非編碼區(qū),非編碼區(qū),DNA聚合酶,剪接有關(guān)的酶,RNA聚合酶,mRNA前體,mRNA,單鏈DNA,cDNA,逆轉(zhuǎn)錄酶,轉(zhuǎn)錄,剪接,逆轉(zhuǎn)錄,復(fù)制,啟動(dòng)子,終止子,基因,不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子,.,基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較,小,大,無(wú),有,無(wú),有,某種生物的部分基因,某種生物的全部基因,可以,部分基因可以,.,2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,.,PCR技術(shù)的操作過(guò)程,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加_倍,一,.,PCR技術(shù)的操作過(guò)程,.,PCR技術(shù)的操作過(guò)程,PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴(kuò)增,.,PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP,四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化解旋,半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制,半保留復(fù)制、全解旋再?gòu)?fù)制,體外復(fù)制,主要在細(xì)胞核內(nèi),大量的DNA片段,形成整個(gè)DNA分子,熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等,.,3.人工合成法,在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化學(xué)合成,推測(cè),推測(cè),思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子嗎？,.,人工合成法（真核生物）,反轉(zhuǎn)錄法,目的基因的信使RNA,目的基因,化學(xué)合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,推測(cè),推測(cè),單鏈DNA,合成,.,課堂小結(jié),目的基因的獲取,1、從基因文庫(kù)中獲取,2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,3、人工合成,種類,基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù),.,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心,.,表達(dá)載體,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái),.,基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程,質(zhì)粒,DNA分子,限制酶處理,兩個(gè)切口獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同一種,一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端,.,注意：,載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。,.,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,.,1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。,原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,.,三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,構(gòu)建基因表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入,農(nóng)桿菌,植物細(xì)胞,導(dǎo)入,穩(wěn)定維持和表達(dá),過(guò)程：,.,1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法,（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞,操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。,鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.64um。,適用：?jiǎn)巫尤~植物,.,1、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法,（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞,特點(diǎn):十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。,例：轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉,.,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,方法：顯微注射法,程序,目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物,.,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少常用菌：大腸桿菌常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞過(guò)程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細(xì)胞,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,.,小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,.,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,導(dǎo)入過(guò)程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？,1,真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。,2,目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？,不一定，需要檢測(cè),.,1、鑒定分子水平的鑒定,轉(zhuǎn)基因生物的DNA,探針,15N,15N,14N,14N,（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,基因探針：,放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子,方法,DNA分子雜交技術(shù),變性,變性,.,1、鑒定分子水平的鑒定,變性,方法,分子雜交技術(shù),（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,探針,15N,15N,轉(zhuǎn)基因生物的mRNA,14N,14N,.,1、鑒定分子水平的鑒定,提取,（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法抗原-抗體雜交,Bt毒素蛋白,將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi),從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體,抗體,蛋白質(zhì),出現(xiàn)雜交帶,脫分化,組織培養(yǎng),.,2、鑒定個(gè)體水平的鑒定,抗蟲(chóng)、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn),例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)。,.,思考？,不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)。,受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)嗎？,.,課堂練習(xí),1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是()A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái)B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,.,課堂練習(xí),2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫(kù)中提取從受體細(xì)胞中提取利用PCR技術(shù)利用DNA轉(zhuǎn)錄人工合成A.B.C.D.,D,.,課堂練習(xí),3、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,【拓展深化】工具酶只有兩種：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一種，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端；DNA連接酶只在操作程序2中用到。,.,課堂練習(xí),4、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是（）A、人工合成目的基因B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C、將目的基因