Native-PAGE實(shí)驗(yàn)方法與問(wèn)題及其解答-主要內(nèi)容：-分離酸性蛋白步驟

Native-PAGE實(shí)驗(yàn)方法與問(wèn)題及其解答主要內(nèi)容：分離酸性蛋白步驟分離堿性蛋白步驟問(wèn)題和解答步驟非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性sds-page電泳在操作上基本上是相同的，只是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS等。一般蛋白進(jìn)行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時(shí)候，要利用低pH凝膠系統(tǒng)，分離酸性蛋白時(shí)候，要利用高pH凝膠系統(tǒng)。酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統(tǒng)，蛋白會(huì)帶負(fù)電荷，蛋白會(huì)相陽(yáng)極移動(dòng)；而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，這時(shí)候需要將陰極和陽(yáng)極倒置才可以電泳。酸性蛋白通常在非 變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統(tǒng)，蛋白會(huì)帶負(fù)電荷，蛋白會(huì)相陽(yáng)極移動(dòng)；而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，這時(shí)候需要將陰極和陽(yáng)極倒置才可以電泳分離酸性蛋白。分離酸性蛋白工作液配制1. 40%膠貯液(Acr:Bis=29：1）；2. 4分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用濃HCl調(diào)pH 8.8，加水定容到100ml，4 貯存；3. 4堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用濃HCl調(diào)pH 6.8，加水定容到100ml，4 貯存；4. 10電泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4 貯存；5. 2溴酚藍(lán)上樣Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚藍(lán)，5.5ml dH2O； -20貯存；6. 10%APS；7. 0.25%考馬斯亮藍(lán)染色液:Coomassie red R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8. 考馬斯亮藍(lán)脫色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O電泳膠的配制及電泳條件（上槽電極為負(fù)，下槽電極為正）1. 堿性非變性膠 17%分離膠(10 ml) 4%堆積膠(5 ml)2. 40%膠貯液(40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml3. 4分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8) 2.5ml 4. 4堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10%APS 35 l7. TEMED 15 l8. 10電泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀釋到1L電泳條件 :100V恒壓約20min，指示劑進(jìn)入濃縮膠；改換160V恒壓，當(dāng)指示劑移動(dòng)到膠板底部時(shí)，停止電泳，整個(gè)過(guò)程約80min。染色和脫色:取出膠板于0.25%考馬斯亮藍(lán)染色液中染色約30min，傾出染色液，加入考馬斯亮藍(lán)脫色液，緩慢搖動(dòng)，注意更換脫色液，直至膠板干凈清晰背景。也可以用銀染或者活性染色。分離堿性蛋白要用低pH凝膠系統(tǒng)，并使用以下緩沖液體系：1. 分離膠：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；2. 堆積膠：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；3. 電泳緩沖液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5將正負(fù)電極倒置，用甲基綠（0.002%）為示蹤劑實(shí)驗(yàn)操作同分離酸性蛋白?；厥?native-PAGE結(jié)束以后，采用電泳的方法進(jìn)行回收，方法如下：電泳結(jié)束以后，切取部分染色，然后根據(jù)染色結(jié)果切取含有蛋白質(zhì)的膠帶裝入處理過(guò)的透析袋中，加入適量的緩沖液，最后把透析袋放入普通的核酸電泳槽中，并在電泳槽中加入適量的緩沖液（和透析袋中的緩沖液相同），低溫電泳2-3小時(shí)即可?；厥盏鞍姿玫木彌_液一般和電泳所用的緩沖液相同。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)的分類有三種常用的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native（CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。在一個(gè)典型的native PAGE方法中，復(fù)合物被CN-PAGE或BN-PAGE分離。然后可以用其它分離方法如SDS-PAGE或等電聚焦做進(jìn)一步分離。隨后切割凝膠，蛋白復(fù)合物每一個(gè)部分都被分開(kāi)。蛋白的每個(gè)條帶可以消化后做肽鏈指紋圖譜或重新測(cè)序。這樣就可以提供一個(gè)蛋白復(fù)合物中單個(gè)蛋白的重要信息。1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技術(shù)。是以考馬斯亮藍(lán)作為電泳分離后蛋白質(zhì)鑒定染料的一種電泳方法。這種方法的缺點(diǎn)是：考馬斯亮藍(lán)與蛋白的結(jié)合起到了去垢劑的作用，可能導(dǎo)致復(fù)合物的分離；并對(duì)化學(xué)發(fā)光或蛋白質(zhì)輔基的熒光或熒光染料的標(biāo)記具有潛在的猝滅作用。Blue Native PAGE在分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用以及膜蛋白復(fù)合物方面有很大的優(yōu)勢(shì)，其分離范圍在100KDa-10MDa。在Blue native PAGE過(guò)程中，最重要的化合物就是考馬斯亮藍(lán)，除了增溶作用以外，蛋白質(zhì)表面結(jié)合了大量的考馬斯亮藍(lán)染料而帶上負(fù)電荷，這會(huì)導(dǎo)致即使堿性蛋白在 pH7.5條件下也會(huì)向陰極遷移。但是，蛋白質(zhì)雖然帶有大量的負(fù)電荷，然而其分離依據(jù)的根本還是根據(jù)不連續(xù)的凝膠梯度-凝膠孔徑的逐漸減小，蛋白質(zhì)最終遷移到其自身大小與凝膠孔徑相近似的位置而停止。并且在分離膜蛋白的過(guò)程中，由于帶有負(fù)電荷，而不會(huì)引起蛋白聚合，與酸性染料的結(jié)合，膜蛋白也由疏水性變成親水性，溶解性大大提高。1.2 Clear Native PAGEClear Native PAGE是通過(guò)除染色以的其它方法如SLS鑒定蛋白的電泳技術(shù)。然而，這種方法最大的應(yīng)用還是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，特別是和質(zhì)譜聯(lián)用。Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝膠中分離酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI7）的電泳技術(shù)，分辨率通常比BN-PAGE低。遷移距離決定于蛋白的固有電荷和凝膠孔徑大小。因此，BN-PAGE比CN-PAGE應(yīng)用更廣泛。然而CN-PAGE在考馬斯染料分析天然混合物干擾進(jìn)一步分析時(shí)存在著優(yōu)勢(shì)。如測(cè)定催化活性（例如線粒體ATP合酶）或分離用于熒光共振能量分析的微量膜蛋白，CN-PAGE比BN-PAGE更溫和，特別是使用洋地黃皂苷時(shí)，CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子組合體的結(jié)構(gòu)而B(niǎo)N-PAGE會(huì)導(dǎo)致分解。線粒體ATP合酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE檢出，但BN-PAGE無(wú)法檢出。CN-PAGE起源于無(wú)色非變性PAGE，是BN- PAGE之后出現(xiàn)的技術(shù)。既然CN-PAGE中沒(méi)有帶電荷的染料，蛋白在電場(chǎng)中的遷移完全取決于這個(gè)蛋白的固有電荷。大分子和低聚蛋白必須有合適的物理參數(shù)才能在CN-PAGE中分開(kāi)，特別是PI低于5.4，分辨率低。由此看來(lái)，CN-PAGE除了獲得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中沒(méi)有什么優(yōu)勢(shì)了。優(yōu)點(diǎn)是條件更溫和，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有更大優(yōu)勢(shì)。BN-PAGE和CN-PAGE的緩沖液和電泳條件一致，但是CN-PAGE的陰極緩沖液中不含考馬斯染料，而是將0.025%的洋地黃皂苷加入到凝膠中。1.3 QPNC-PAGEQPNC-PAGE（quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis）是一種應(yīng)用于生物化學(xué)和生物有機(jī)化學(xué)的根據(jù)等電點(diǎn)分離蛋白的高分辨技術(shù)。這種凝膠電泳被生物學(xué)家應(yīng)用于獨(dú)立活性或天然金屬蛋白樣品或正確或非正確折疊的可溶性的與金屬輔助因子結(jié)合的蛋白混合物的鑒定。1.3.1電泳緩沖液QPNC-PAGE是在特殊的裝置里進(jìn)行的分離生物活性分子的電泳過(guò)程。在特殊的電泳緩沖系統(tǒng)（基于Tris-HCl和NaN3）中，一個(gè)生物系統(tǒng)中的大多數(shù)蛋白都會(huì)帶電荷，在電場(chǎng)的正負(fù)極之間遷移。盡管PH（10.00）的電泳緩沖液并不與細(xì)胞或組織中的生理PH相符，但是在生理PH（8.00）的緩沖體系下蛋白會(huì)連續(xù)洗脫并分成不同的部分。分離系統(tǒng)包括電泳槽和分部收集器，這些裝置要置于冰箱中。1.3.2凝膠特征為了得到一個(gè)PAGE所需的聚合完全的凝膠，聚丙烯酰胺凝膠需要在室溫下凝聚69hr。最后，得到均質(zhì)的含機(jī)械穩(wěn)定和自由的單體或原子。凝膠的孔徑很大，因此分子篩作用在電泳分離中最小化?；谏鲜鲈?，凝膠和活性分子之間的相互作用可以忽略。待分離的金屬蛋白（如金屬分子伴侶，蛋白酶感染性初級(jí)因子，金屬運(yùn)輸?shù)鞍祝矸蹱畹鞍?，金屬酶，金屬肽等）不?huì)分解成脫輔蛋白和金屬輔助因子。孤立蛋白的生物活性結(jié)構(gòu)（天然或3D構(gòu)象）在QPNC-PAGE后不會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化。所以，金屬蛋白和蛋白異構(gòu)體在PAGE中被定量的分成高純度的部分。QPNC與其它電泳技術(shù)如SDS-PAGE，2-DE，等速電泳和CN- PAGE等相比被稱為“突破性的方法”。1.3.3 實(shí)驗(yàn)方法（1）儲(chǔ)備液1）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00，室溫2）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH8.00，室溫3）40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺2.67C，4（新鮮）（2）電泳緩沖液20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH10.00（除氣），4電泳槽上部：500ml電泳緩沖液電泳槽下部：2000ml電泳緩沖液（3）洗脫液20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH8.00（除氣），4洗脫室：700ml洗脫緩沖液（4）分離膠丙烯酰胺4%T 體積40ml成分：4ml40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺2.67C4ml 200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.0032 mL H2O200 L 10% APS20 L TEMEDAPS和TEMED最后加入。輕輕攪拌燒瓶中的混合物，注意不能產(chǎn)生氣泡。然后把溶液移入內(nèi)徑為28mm，長(zhǎng)為40mm有刻度的玻璃柱中。加入3ml正丙醇。60分鐘聚合后用電泳緩沖液沖洗凝膠，然后用4ml電泳緩沖液覆蓋凝膠表面。在室溫下凝集69小時(shí)。（5）樣品的準(zhǔn)備和收集保持樣品（生物液體）溫度為4。0.3ml甘油和2.7ml樣品在分離前混合5分鐘。然后把處理好的樣品加入到電泳緩沖液的上層。這些蛋白在此電泳緩沖液中不是帶負(fù)電（PI10.0），因此在電場(chǎng)中不是從正極遷移到負(fù)極就是從負(fù)極遷移到正極。已分離的蛋白分子用特殊的生理洗脫液連續(xù)洗脫，并用分部收集器收集。整個(gè)分離系統(tǒng)必須在4冰箱中進(jìn)行。純化的，半純化的和未處理的樣品都可以用于QPNC。樣品分離純化中應(yīng)該避免類似于蛋白質(zhì)沉淀等過(guò)程以防止蛋白變性。化學(xué)穩(wěn)定的金屬蛋白可以用非變性的凝膠滲透層析來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步純化。1.3.4 定量和鑒定Fe， Cu， Zn， Ni， Mo， Pd， Co， Mn， Pt， Cr， Cd和其它金屬輔因子可以通過(guò)ICP-MS（Inductively coupled plasma mass spectroscopy，電感耦合等離子體質(zhì)譜）來(lái)定性和定量。因?yàn)镻AGE條帶的高純度和選擇性凝集，相關(guān)的結(jié)構(gòu)可以用非變性條件下的NMR來(lái)分析。1.3.5 應(yīng)用QPNC的應(yīng)用對(duì)象為分子量6-200kDa的酸性、堿性和中性金屬蛋白。在測(cè)定血液或其它臨床樣品中獨(dú)立的金屬蛋白結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系方面具有重要應(yīng)用，因?yàn)椴徽_的金屬陪伴蛋白的折疊。例如超氧化物歧化酶（SOD）的銅陪伴蛋白出現(xiàn)在這些基質(zhì)中或許預(yù)示著神經(jīng)病變疾病如肌萎側(cè)索硬化病等。QPNC-PAGE，SEC，ICP-MS和NMR等技術(shù)的連用可以得到病人或潛在的病人液體基質(zhì)中相關(guān)金屬蛋白的生理狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。這一技術(shù)可以提高蛋白錯(cuò)折疊相關(guān)疾病的診斷和治療水平。問(wèn)題和解答1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)預(yù)電泳是怎么回事的？預(yù)電泳時(shí)要加6DNA上樣緩沖液?jiǎn)?？電?2小時(shí)再加結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物嗎？預(yù)電泳是除去凝膠中沒(méi)有聚合的單體和雙體和聚合引發(fā)劑，提高分辨率，不加任何物質(zhì)，一般分鐘后加樣電泳。2. 銀染的步驟是什么？銀染的關(guān)鍵因素是什么？步驟是：（1） 固定：10%冰乙酸min。（2） 清洗：雙蒸水沖洗凝膠次，每次1min。（3） 染色：染色液（1g硝酸銀，.5mL37%甲醛，1L雙蒸水?，F(xiàn)配）染色30min。（4） 清洗：迅速洗凝膠次。（5） 顯影：30g碳酸鈉，1.5mL37%甲醛，200uL 10mg/L硫代硫酸鈉。顯影至清晰帶紋出現(xiàn)。成功銀染的關(guān)鍵因素包括：（6） 用超純水（比如，NANOpure或Milli-Q純化）或者是雙蒸水作銀染。（7） 用提供的碳酸鈉或者ACS試劑級(jí)的碳酸鈉。（8） 在染色后，水清洗所用時(shí)間的長(zhǎng)短很重要，用不超過(guò)5-10秒的時(shí)間清洗膠，然后放入顯色溶液中，一般在水里浸一下就好。（9） 甲醛和硫代硫酸鈉（ul/1ml）在使用前，及時(shí)加入到顯色液中。（10） 在使用前及時(shí)配染色液。3. 變性PAGE的上樣緩沖液配方？如何準(zhǔn)備上樣的蛋白？是將細(xì)胞用超聲破碎,還是用細(xì)胞裂解液,大多細(xì)胞裂解液中均含有SDS,不知有沒(méi)有用于非變性PAGE的裂解液.具有操作步驟是什么?非變性的PAGE buffer就是0.5x