柱色譜分離實(shí)驗ColumnChromatography 教育學(xué)習(xí)

柱色譜ColumnChromatography,1,高等課件,了解：1.柱色譜法分離有機(jī)物的原理。2固定相和流動相的選擇原則。掌握：1.色譜柱的填充方法。2柱色譜分離的基本操作。,一、實(shí)驗?zāi)康?2,高等課件,色譜法簡介,色譜法亦稱色層法，層析法等，是分離，純化和鑒定有機(jī)化合物的重要方法之一，還可定量分析。,3,高等課件,色譜法分類,操作形式,柱色譜法（columnchromatography）,二、實(shí)驗原理,4,高等課件,5,高等課件,柱色譜分離示意圖,二、實(shí)驗原理,6,高等課件,7,高等課件,二、實(shí)驗原理,吸附劑的性質(zhì)：均勻、表面積大、不反應(yīng)、吸附能力不同,化合物的結(jié)構(gòu)：化合物的吸附性和它們的極性成正比,洗脫劑的極性：溶解度適中、不反應(yīng)、易獲取回收,影響分離效果主要因素,8,高等課件,9,高等課件,10,高等課件,11,高等課件,12,高等課件,13,高等課件,14,高等課件,15,高等課件,16,高等課件,17,高等課件,18,高等課件,19,高等課件,20,高等課件,和,和,在氧化鋁柱子上若分離下列各組混合物，哪一個組分先被洗脫下來？,21,高等課件,三、實(shí)驗內(nèi)容,干法：10g硅膠+乙醇,先用乙醇后用水操作,組分顏色,組分顏色,1mL樣品加樣操作0.5mL2乙醇洗滌,柱色譜操作：,實(shí)驗步驟:,22,高等課件,吸附劑裝填緊密，排除氣泡。最終應(yīng)使吸附劑的上端平整，無凹凸面，無斷層。,干法裝柱濕法裝柱,裝柱,三、實(shí)驗內(nèi)容,23,高等課件,裝柱時應(yīng)該注意均勻，不能有氣泡，裂縫，否則樣品可能順縫隙流動而不吸附，影響樣品的分離，應(yīng)用質(zhì)軟的物體如吸耳球等輕輕敲擊柱身，促使吸附劑裝填緊密，排除氣泡。最終應(yīng)使吸附劑的上端平整，無凹凸面,24,高等課件,樣品為液體，可直接加樣；樣品為固體，可選擇合適溶劑溶解為液體再加樣。加樣時，要沿管壁慢慢加入至柱頂部，勿使樣品攪動吸附劑表面。,加樣,三、實(shí)驗內(nèi)容,25,高等課件,洗脫,在柱頂不斷加入洗脫劑，使洗脫劑永遠(yuǎn)保持有適當(dāng)?shù)牧浚灰屜疵搫┍砻媪鞲?，使流動相流速適當(dāng)。,三、實(shí)驗內(nèi)容,26,高等課件,洗脫時應(yīng)注意：（1）向柱內(nèi)加入95%乙醇溶液洗脫（可以通過注射器沿管壁或安裝滴液漏斗）在恒壓或加壓條件下進(jìn)行洗脫?？刂屏鞒鏊俣?滴/秒。逐漸出現(xiàn)色層帶分離。（2）第一色層帶到達(dá)色譜柱底部時，立即用錐形瓶收集第一色層的溶液，直到其完全被洗出。【注意】洗脫時切勿使溶劑流干?。?）然后，改用水溶液作為洗脫劑，當(dāng)?shù)诙珜訋У竭_(dá)色譜柱底部時，立即收集第二色層的的溶液，直到其完全被洗出。（4）用量筒分別量取所分離出來的兩種溶液的體積后，倒入指定的回收瓶中。（5）分離結(jié)束后，應(yīng)先讓溶劑盡量流干，然后倒置，用吸耳球從活塞向管內(nèi)擠壓空氣，將吸附劑從柱頂擠壓出。使用過的吸附劑倒入垃圾桶里。,27,高等課件,試樣有色，在層析柱上可直接觀察。洗脫后分別收集各個組分。,收集,試樣無色，收集洗脫液時，多采用等份收集，每份洗脫劑的體積隨所用吸附劑的量及試樣的分離情況而定。收集的每份洗脫劑的體積越小，分離效果越好。,三、實(shí)驗內(nèi)容,28,高等課件,三、實(shí)驗內(nèi)容,29,高等課件,玻砂防堵塞裝柱需緊密加壓不可大溶劑勿流干,四、注意事項,30,高等課件,色譜法在有機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用:分離混合物精制提純化合物利用比移值(Rf)鑒定化合物跟蹤反應(yīng)進(jìn)程,小結(jié),31,高等課件,色譜法的特點(diǎn):分離效率高復(fù)雜混合物,同系物,異構(gòu)體等。靈敏度高可以檢測出gg-1(10-6)級甚至ngg-1(10-9)級的物質(zhì)量。分析速度快幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣分析。,小結(jié),32,高等課件,柱色譜法分離甲基橙和甲基藍(lán),33,高等課件,實(shí)驗原理,甲基橙和亞甲基藍(lán)均為指示劑,它們的結(jié)構(gòu)式如下所示:,甲基橙,亞甲基藍(lán),由于甲基橙和亞甲基藍(lán)的結(jié)構(gòu)不同,極性不同,吸附劑對它們的吸附能力不同,洗脫劑對它們的解析速度也不同,極性小、吸附能力弱、解析速度快的亞甲基藍(lán)先被洗脫下來，而極性大、吸附能力強(qiáng)、解析速度慢的甲基橙后被洗脫下來，從而使兩種物質(zhì)得以分離。本實(shí)驗以硅膠為吸附劑，95%乙醇作為洗脫劑，先洗出亞甲基藍(lán)，再用蒸餾水作洗脫劑把甲基橙洗脫下來。,34,高等課件,三、實(shí)驗內(nèi)容,干法：10g硅膠+乙醇,先用乙醇后用水操作,組分顏色,組分顏色,1mL樣品加樣操作0.5mL2乙醇洗滌,柱色譜操作：,實(shí)驗步驟:,35,高等課件,儀器和試劑,1.儀器錐形瓶、玻璃漏斗、色譜柱2.試劑柱層析硅膠、脫脂棉、乙醇（95%）甲基橙、亞甲基藍(lán)。H2O95%乙醇=11(A液)0.2molL-1HCl95%乙醇=11(B液),36,高等課件,裝置圖,裝柱,洗脫,37,高等課件,實(shí)驗步驟,裝柱：1、裝色譜柱：（1）取一支色譜柱，在柱子的收縮部塞一小團(tuán)脫脂棉花將色譜柱垂直固定在鐵架臺上。(2)關(guān)閉活塞，向柱中倒入蒸餾水（也是洗脫劑，至柱體積的1/2）（3）填吸附劑：稱取10g硅膠于小燒杯中,加入15mL蒸餾水,用玻璃棒調(diào)好通過漏斗慢慢裝入玻璃柱,使其逐漸沉入底部。用洗耳球敲打柱身使硅膠裝填緊密，打開活塞，用小錐型瓶承接,控制滴速為1滴秒,裝完后在上面加一層脫脂棉（，操作時要注意吸附劑始終不能露出液面）。,38,高等課件,實(shí)驗步驟（續(xù)）,加樣：當(dāng)液面剛好流至脫脂棉平面相切時，立刻關(guān)閉活塞，加入5mL左右的A液,當(dāng)硅膠面又將要露出時,關(guān)緊活塞,用量筒準(zhǔn)確加入0.50mL以A液做溶劑的混合液(含甲基橙和亞甲基藍(lán)各為0.400gL-1)。洗脫：待此混合液將要滲入柱內(nèi)時,立即用A液洗脫,此時可以觀察到有鮮明的黃、藍(lán)兩條色帶形成。黃色的甲基橙色帶隨洗脫劑的加入不斷下