轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器-HXY

第9章轉(zhuǎn)基因動物與動物生物反應(yīng)器,1轉(zhuǎn)基因動物的培育技術(shù)2轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用3動物乳腺生物反應(yīng)器,轉(zhuǎn)基因動物,基因工程技術(shù)胚胎工程技術(shù)轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal）是指借助基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胧荏w動物染色體內(nèi)，外源基因與動物基因整合后隨細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增，在體內(nèi)表達(dá)并能穩(wěn)定地遺傳給后代的動物。,轉(zhuǎn)基因動物,轉(zhuǎn)基因動物的命名,原代轉(zhuǎn)基因動物:founderG0G1G2擬人化命名,1982年,Palmiter生產(chǎn)超級小鼠世界上第一只轉(zhuǎn)基因動物:轉(zhuǎn)入了生長激素基因的巨鼠（supermouse）,第一節(jié)：轉(zhuǎn)基因動物的培育,1目標(biāo)基因克隆和體外重組2外源基因的導(dǎo)入3外源DNA整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的分子檢測4轉(zhuǎn)基因動物品系或品種的建立,外源目的基因的制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物品系,轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)路線,哺乳動物生殖生理,哺乳動物受精和妊娠，整個(gè)過程都在母畜體內(nèi)進(jìn)。,一轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制備方法,顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法精子載體介導(dǎo)法YAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,1顯微注射法,雄性原核,受精卵,顯微注射,胚胎移植,后定檢測,顯微注射法操作流程,a、轉(zhuǎn)移率較高、整合效率達(dá)30%；b、外源基因長度可達(dá)50Kb；c、方法簡單，導(dǎo)入過程直觀；,顯微注射法的優(yōu)點(diǎn),a、設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜；b、隨機(jī)整合、首尾相連的多拷貝；c、常造成插入位點(diǎn)附近宿主DNA大片段缺失、重組等突變，出現(xiàn)動物嚴(yán)重生理缺陷；d、外源基因能否穩(wěn)定整合要到子一代中篩選得到。,缺點(diǎn),2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法,原理：當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)錄成DNA，依靠逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合酶及其末端特異的核苷酸序列，轉(zhuǎn)錄出的DNA可整合到染色體上，從而將其所攜帶的外源基因插入到染色體上。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：在各種轉(zhuǎn)基因方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的轉(zhuǎn)基因效率是最高的，且為單拷貝整合。缺點(diǎn)：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在設(shè)計(jì)時(shí)雖然缺失了病毒的復(fù)制功能序列，但是復(fù)制大量載體DNA所需的輔助病毒基因組內(nèi)有可能與目的基因一起整合到同一細(xì)胞核中，就可能大量復(fù)制病毒，造成嚴(yán)重的污染，故不安全。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA（10kb），而且逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)的甲基化狀態(tài)常使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)缺失。,3胚胎干細(xì)胞法,胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES）是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細(xì)胞。,它是一種含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞?？梢栽隗w外進(jìn)行人工培養(yǎng)，擴(kuò)增，并能以克隆的形式保存。,胚胎干細(xì)胞法建立轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)程序,與傳統(tǒng)育種方法相比較，ES細(xì)胞在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物方面表現(xiàn)其獨(dú)特的優(yōu)勢：,（1）打破了物種的界限，突破了親緣關(guān)系的限制，加快了動物群體遺傳變異程度；（2）可以進(jìn)行定向變異和育種，利用同源重組技術(shù)對ES細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，通過細(xì)胞核移植生產(chǎn)遺傳修飾性動物，有可能創(chuàng)造新的物種；（3）利用ES細(xì)胞技術(shù)，可在細(xì)胞水平對胚胎進(jìn)行早期選擇，這樣可以提高選擇的準(zhǔn)確性，縮短育種時(shí)間。近年來的研究表明，利用ES細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物在動物生產(chǎn)中發(fā)揮著極為重要的作用。,4精子載體法,直接用精子作為外源DNA載體的轉(zhuǎn)移方法。主要問題：重復(fù)性不好,精子與外源DNA結(jié)合的機(jī)理,精子直接與外源DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以直接進(jìn)入精子頭部，受精后就可發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。后來Rottman對此方法進(jìn)行了改進(jìn)，將外源DNA在與精子共孵育之前用脂質(zhì)體包埋，使脂質(zhì)體與DNA相互作用形成脂質(zhì)體DNA復(fù)合物。這種復(fù)合體比較容易和精子細(xì)胞融合，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。,5YAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,酵母人工染色體（YAC）載體是近年來發(fā)展的新型載體，具有克隆百萬堿基對的大片段外源DNA能力。流程：ES轉(zhuǎn)染YAC后體外篩選陽性ES細(xì)胞囊胚腔注射，或YAC原核微注射突出的優(yōu)點(diǎn)：保證大片段基因的完整性,6細(xì)胞核移植技術(shù),將體細(xì)胞移植技術(shù)(克隆動物)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合，使轉(zhuǎn)基因的群體能迅速被克隆擴(kuò)大，還能保證目的基因在克隆后代中的穩(wěn)定表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)：后代100%全是轉(zhuǎn)基因個(gè)體，可以選擇后代性別，轉(zhuǎn)基因后代遺傳背景和穩(wěn)定性一致，不需選配，節(jié)省時(shí)間和費(fèi)用。缺點(diǎn)：難度大，成功率低、胎兒成活率不高,第二節(jié)：轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用,（1）動物品種改良；（2）生物制藥(乳腺生物反應(yīng)器)；（3）建立人類疾病的動物模型；（4）生產(chǎn)可移植用的動物器官；（5）基因治療(動物模型)；（6）基因打靶。,（1）動物品種改良,抗病育種生長性狀,（2）生物制藥(乳腺生物反應(yīng)器),如荷蘭的GenPharm公司用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)乳鐵蛋白，預(yù)計(jì)每年從牛奶生產(chǎn)出來營養(yǎng)奶粉的銷售額是50億美元。,（3）建立人類疾病的動物模型,已建立的部分人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型_疾病模型基因轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因_老年性癡呆征顯微注射淀粉樣蛋白基因型糖尿病顯微注射胰島淀粉樣多肽基因地中海貧血癥顯微注射人珠蛋白基因鐮刀形細(xì)胞貧血癥顯微注射人和珠蛋白基因唐氏綜合癥顯微注射Cu/Zn-SOD酶基因卡氏肉瘤反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染HIVtat基因成骨不全癥顯微注射突變的1膠原蛋白前體基因自毀容貌癥ES細(xì)胞同源重組突變HGPRT基因_,4）生產(chǎn)可移植用的動物器官,我國每年有150萬人需要器官移植，但是僅僅不到1萬人能夠得到供體。豬的臟器移植給人，會發(fā)生超急性排斥反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)能降低排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因豬。,Science(2002).295,10891092,（5）基因治療,上世紀(jì)九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脫氨酶)基因缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重免疫缺損的四歲女孩，由美國國立衛(wèi)生研究院用ADA基因治愈?！盎蛑委煛毖芯繜釓拇瞬叭澜纾鸲эA，為保障人類健康展現(xiàn)了美好的前景。,（6）基因打靶,基因打靶(Genetargeting)是一種在胚胎干細(xì)胞(ES)技術(shù)和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)之上,定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段?；蛘先N方式：基因隨機(jī)插入基因敲除基因替換,基因打靶,基因打靶的研究意義,基因功能研究人類疾病動物模型的研制經(jīng)濟(jì)動物遺傳物質(zhì)的改良,胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的基因打靶技術(shù),首先獲得ES細(xì)胞系，利用同源重組技術(shù)獲得帶有研究者預(yù)先設(shè)計(jì)突變的中靶ES細(xì)胞。通過顯微注射將經(jīng)過遺傳修飾的ES細(xì)胞引入受體胚胎內(nèi)。經(jīng)過遺傳修飾的ES細(xì)胞仍然保持分化的全能性，可以發(fā)育為嵌合體動物的生殖細(xì)胞，使得經(jīng)過修飾的遺傳信息經(jīng)生殖系遺傳。,基因敲除的基本程序,打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種,基因打靶流程,應(yīng)用舉例：肌肉生長抑制素基因Myostatin基因敲除,Myostatin基因是一種特異性骨骼肌生長發(fā)育的抑制因子。該基因與動物骨骼肌總量的調(diào)節(jié)有關(guān)，其序列在進(jìn)化過程中高度保守，所有哺乳動物和鳥類均有很高的同源性。Myostatin基因在功能上也是非常保守的，其功能的缺失會造成可導(dǎo)致肌肉異常肥大。,比利時(shí)藍(lán)牛肌肉增加表型,皮埃蒙特牛肌肉增加表型,Myostatin基因敲除“超級鼠”,美培育轉(zhuǎn)基因鱒魚：腹肌有6塊,肉多15%,2007年生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎諾貝爾獎,美國猶他大學(xué)Eccles人類遺傳學(xué)研究所科學(xué)家MarioR.Capecchi、美國北卡羅來納州大學(xué)教會山分校醫(yī)學(xué)院教授OliverSmithies與英國科學(xué)家卡迪夫大學(xué)卡迪夫生命科學(xué)學(xué)院MartinJ.Evans因胚胎干細(xì)胞和基因打靶研究獲得此獎項(xiàng)。,第三節(jié)：動物乳腺生物反應(yīng)器,一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物叫動物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動物乳腺生物反應(yīng)器,動物血液生物反應(yīng)器和動物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。,1987年美國科學(xué)家戈登（Gordon）等人首次在小鼠的奶中生產(chǎn)出一種醫(yī)用蛋白tPA（組織型纖溶酶原激活物），展示了用動物乳腺生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的可能性。利用動物乳腺生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品的方式稱為乳腺生物反應(yīng)器。,1.動物乳腺生物反應(yīng)器的制備,（1）表達(dá)載體的構(gòu)建目前用于表達(dá)載體的啟動子調(diào)控元件選用動物乳蛋白基因啟動子元件，主要有四類乳腺定位表達(dá)調(diào)控元件：第一類是B2乳球蛋白(BLG)，第二類是酪蛋白基因調(diào)控序列：第三類是乳清酸蛋白(WAP)基因調(diào)控序列；第四類是乳清白蛋白基因調(diào)控序列。,（2）目的基因的選擇選擇目的基因的基本要求是，正常情況下濃度低、翻譯后修飾復(fù)雜、其它表達(dá)體系難以表達(dá)或表達(dá)量低、應(yīng)用前景廣闊的蛋白基因。,（3）體外重組選擇好目的基因和啟動子調(diào)控元件后進(jìn)行體外重組，構(gòu)建融合基因。,（4）基因轉(zhuǎn)導(dǎo)將構(gòu)建好的重組基因用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法轉(zhuǎn)移到受精卵。,（5）胚胎移植利用胚胎移植技術(shù)將制備的轉(zhuǎn)基因受精卵植入待孕母體子宮內(nèi)，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，得到轉(zhuǎn)基因乳腺表達(dá)個(gè)體。通過采集轉(zhuǎn)基因動物的乳汁,來獲得目的基因表達(dá)產(chǎn)物。,（6）鑒定轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器可以從分子水平和乳腺分泌物兩個(gè)方面進(jìn)行鑒定。,2.動物乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn),產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定產(chǎn)品成本低研制開發(fā)周期短無污染經(jīng)濟(jì)效益顯著,3.動物乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用,高乳汁營養(yǎng)價(jià)值生產(chǎn)藥用蛋白,患有龐普病的嬰兒體內(nèi)一種可促進(jìn)糖原質(zhì)代謝的酶有缺陷。荷蘭研究人員培育出一種轉(zhuǎn)基因兔，兔奶中表達(dá)這種酶，因此飲用這種奶可以治療這種疾病。,4.動物乳腺生物反應(yīng)器存在的問題（1）外源基因在動物體內(nèi)的位點(diǎn)整合問題（2）乳蛋白基因表達(dá)組織特異性問題（3）目的蛋白的翻譯后修飾問題（4）轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化問題（5）轉(zhuǎn)基因的技術(shù)與方法問題（6）倫理道德問題,前景,轉(zhuǎn)基因動物制藥（乳腺生物反應(yīng)器）是21世紀(jì)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的一種新的藥物生產(chǎn)模式。美國紅十字會預(yù)測：到2010年，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的商品將達(dá)到350億美元的銷售額，生產(chǎn)的藥物將占整個(gè)基因工程藥物的90%以上。,研究展望,轉(zhuǎn)基因技術(shù)是近年發(fā)展很迅速的一項(xiàng)新技術(shù)，尚有許多問題存在，有待進(jìn)一步完善，但是該技術(shù)在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，相信轉(zhuǎn)基因動物研究將極大的推動醫(yī)藥科學(xué)的發(fā)展。,攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀?著名科學(xué)家談家楨院士（