【基金標(biāo)書】2010CB912400-基于冷凍電子顯微鏡學(xué)的生物大分子的高時(shí)空分辨率的結(jié)構(gòu)和功能研究

項(xiàng)目名稱： 基于冷凍電子顯微鏡學(xué)的生物大分子的高時(shí)空分辨率的結(jié)構(gòu)和功能研究 首席科學(xué)家： 高海嘯 清華大學(xué) 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部門： 教育部 一、研究內(nèi)容 本項(xiàng)目將進(jìn)行以下幾個(gè)方面的研究 : 課題一 ，高通量、全自動化的冷凍電鏡數(shù)據(jù)采集和三維重構(gòu)圖像處理方法的研究 a. 開發(fā)高通量、全自動化的電鏡數(shù)據(jù)采集和處理方法 , 以及高性能的三維重構(gòu)算法 在冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析工作中，目前有相當(dāng)大的一部分時(shí)間和人工都消耗在重復(fù)性工作中，例如電鏡膠片的拍攝和掃描，電鏡圖像的預(yù) 篩選，三維重構(gòu)計(jì)算中的某些步驟等。近年來，隨著冷凍電子顯微學(xué)的蓬勃發(fā)展，可以達(dá)到的分辨率越來越高，相應(yīng)地對電鏡數(shù)據(jù)量的需求也越來越大。以核糖體結(jié)構(gòu)解析為例，獲得10 分辨率的核糖體結(jié)構(gòu)需要 10 萬個(gè)冷凍電鏡單顆粒。而在理論上，獲得原子分辨率（好于 3）則至少需要 100 萬個(gè)單顆粒電鏡圖像。如果以目前普遍使用的手動方式來進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理，那么僅僅 電鏡膠片的拍攝、掃描，以及電鏡圖像的預(yù)篩選等工作就需要數(shù)月之久！ 這實(shí)際上已經(jīng)成為阻礙當(dāng)前高分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析的主要瓶頸之一。解決這一問題的有效途徑就是開發(fā)高通量、 全自動化的電鏡數(shù)據(jù)采集和處理方法以及高性能的三維重構(gòu)算法，以最大程度地提高對超大電鏡數(shù)據(jù)量的采集和處理的效率，減少在這些方面耗費(fèi)的人工和時(shí)間。 自動化的電鏡數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)對電鏡的穩(wěn)定性和計(jì)算機(jī)控制下的可操作性要求很高。特別是開發(fā)基于單顆粒重構(gòu)方法的自動化采集系統(tǒng)，要求能夠自動識別大量的適合成像的樣品區(qū)域并長時(shí)間持續(xù)監(jiān)控。由于開發(fā)難度很高，目前國際上在這一前沿領(lǐng)域的工作才剛剛開始，而真正能夠?qū)崿F(xiàn)全自動化數(shù)據(jù)采集的系統(tǒng)更是屈指可數(shù)。由本項(xiàng)目研究人員雷建林教授在過去數(shù)年中主持開發(fā)的其中的佼佼 者 。與傳統(tǒng)的手工采集方法相比， 巨大優(yōu)勢是能夠?qū)蝹€(gè)樣品進(jìn)行長達(dá)數(shù)日甚至數(shù)周的持續(xù)數(shù)據(jù)采集。以多輸出通道的 4機(jī)為例， 24 小時(shí)內(nèi)可至少收集 2000 張電鏡照片，比手工采集效率高十倍以上。此外， 能自動地在低電子輻照劑量下根據(jù)樣品情況選擇在同一個(gè)孔洞中的不同區(qū)域多次拍攝，從而大大提高了樣品的利用率。而這在手工電鏡數(shù)據(jù)采集中是無法做到的。 前已經(jīng)在哥倫比亞大學(xué)、德州大學(xué)休斯頓醫(yī)學(xué)中心、哈佛大學(xué)等多家冷凍電鏡研究機(jī)構(gòu)全面運(yùn)轉(zhuǎn)或試運(yùn)轉(zhuǎn)，并已多次穩(wěn)定地對單個(gè)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集一周以上，迄今共收集十余萬張片。 在本課題中，我們將在 有的核心構(gòu)架的基礎(chǔ)上，開發(fā)一套完備的高通量和全自動化的電 鏡數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)。首先，針對目前只能運(yùn)行在美國 司的 列冷凍電鏡上的限制 ， 將其擴(kuò)展到我們剛剛在清華大學(xué)和中科院生物物理所購置的 凍電鏡平臺上。需要指出的是，目前還沒有任何針對 凍電鏡的自動化數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。我們在這方面的工作將是國際上最前沿的。 其次， 將 展至 具有支持單顆粒采集，傾轉(zhuǎn)系列數(shù)據(jù)采集（包括電子斷層分析和單顆粒傾轉(zhuǎn)）等多項(xiàng)重要冷凍電鏡操作功能。最后，在自動化數(shù)據(jù)采集的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對電鏡數(shù)據(jù)的 預(yù)處理、預(yù)篩選，并由此探索和優(yōu)化電鏡樣品的理想處理和數(shù)據(jù)收集條件，如包埋冰層的最佳厚度、電子束的最佳輻照強(qiáng)度和最佳欠焦范圍等。 冷凍電鏡圖像的三維重構(gòu)有很高的計(jì)算需求，特別是其中 計(jì)算部。在 10 年前，這些計(jì)算任務(wù)主要是在具有共享內(nèi)存架構(gòu)和多處理器的專用計(jì)算機(jī)上完成。隨著對分辨率的要求越來越高，所需要處理的電鏡圖像的數(shù)量呈指數(shù)增長趨勢。因此，過去那種依賴于昂貴的專用計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)處理方式已不再可行，而需要采用以 操作系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)集群。在本課題中，我們將 會針對高性能并行化這一需求對相關(guān)三維重構(gòu)算法進(jìn)行優(yōu)化。以目前在國際冷凍電鏡領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的三維重構(gòu)系統(tǒng) 為核心，開發(fā)自動化的電鏡數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。并將利用數(shù)據(jù)庫集中管理從樣品制備、電鏡數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析、一直到三維重構(gòu)的全套過程，以實(shí)現(xiàn)對一個(gè)完整的電鏡結(jié)構(gòu)解析項(xiàng)目的高效管理和處理。 b. 開發(fā)和優(yōu)化 結(jié)構(gòu)不均一 性存在條件下的高性能分類方法，并應(yīng)用于研究生物大分子復(fù)合體的動態(tài)過程和功能 結(jié)構(gòu)不均一 性是指由于生物大分子復(fù)合體自身結(jié)構(gòu)的內(nèi)在靈活性，在采集到的同一組冷凍電鏡數(shù)據(jù)中經(jīng)常包含著它們不同的結(jié)構(gòu)構(gòu)象。目前 ，結(jié)構(gòu) 不均一 性影響冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的分辨率已是一個(gè)普遍存在的問題 。這主要是由于生物大分子復(fù)合體往往有多個(gè)與功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)共存，通過實(shí)驗(yàn)手段很難將它們分離。 因而在采集到的冷凍電鏡 照片中，不同的單顆?？赡艽聿煌墓δ軕B(tài)結(jié)構(gòu)，它們之間結(jié)構(gòu)的差異將直接降低三維 重構(gòu)密度圖的分辨率。在嚴(yán)重情況下，甚至?xí)?dǎo)致局部密度圖殘缺。 當(dāng)前，冷 凍電子顯微學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究熱點(diǎn) 就是針對結(jié)構(gòu)不均一 性的成熟的、普適的分類方法的研發(fā) 。利用冷凍 電鏡數(shù)據(jù) 中豐富的內(nèi)在結(jié)構(gòu)信息，將存在結(jié)構(gòu)不均一 性的冷凍電鏡數(shù)據(jù)在三維重構(gòu)前進(jìn)行分類。目前采用的分類方法主要分為兩類， 即 監(jiān)督性方法和非監(jiān)督性方法。前者的特點(diǎn)是快速、簡便，但是必須引入合適的參考結(jié)構(gòu)（ 。分類結(jié)果的優(yōu)劣往往取決于參考結(jié)構(gòu)選取的好壞。在冷凍電子顯微學(xué)領(lǐng)域，現(xiàn)有的分類方法的研究工作大都屬于這一類，主要是基于交叉關(guān)聯(lián)函數(shù)的監(jiān)督性分類方法。由于監(jiān)督性分類方法對預(yù)先引入的參照結(jié)構(gòu)要求較高，在使用不當(dāng)?shù)那闆r下常常會導(dǎo)致分類后的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)偏差甚至錯誤，因 此開發(fā)有效的非監(jiān)督性分類方法來解決 冷凍電鏡中的生物大分子結(jié)構(gòu)不均一 性尤為重要。然而，由于冷凍電鏡數(shù)據(jù)的信噪比極低，加之采集到的電鏡照片中的單顆粒的投影方向有待確定，使得分類問題變得非常復(fù)雜。目前，針對非監(jiān)督性分類方法的研究工作大多還只是在嘗試階段。其中，由本課題負(fù)責(zé)人高海嘯教授參與開發(fā)的 基于最大似然法的 分類方 法，是目前唯一一個(gè)在實(shí)踐中得到運(yùn)用的非監(jiān)督性分類方法 。在本課題中， 我們將在過去的 分類 方法的 研究工作基礎(chǔ)上，針對性地選擇具體的生物大分子復(fù)合體作為研究體系，通過提高和完善現(xiàn)有的監(jiān)督性和非監(jiān)督性方法的獨(dú)立性和普適性，包括改善已有監(jiān)督性方法對參照對象的過度依賴，建立有效的分類檢驗(yàn)算法等，進(jìn)一步嘗試開發(fā)全新高效的冷凍電鏡數(shù)據(jù)分類方法。 課題 二， 低對稱或非對稱性的生物大分子復(fù)合體的高分辨結(jié)構(gòu)及其動態(tài)過程的研究 細(xì)胞中所有的重大生命過程都離不開生物大分子的參與。生物大分子發(fā)揮功能需要其它生物分子的協(xié)同作用，形成穩(wěn)定的或者不穩(wěn)定過渡態(tài)的復(fù)合體。這些大分子復(fù)合體通常都處 于一個(gè)動態(tài)的變化過程，為它們的高分辨結(jié)構(gòu)的解析帶來了很大困難。本課題將在課題一的基礎(chǔ)之上，利用單顆粒重構(gòu)技術(shù)解析幾類與重大生命過程相關(guān)的生物大分子復(fù)合體的高分辨結(jié)構(gòu)，包括一些細(xì)胞內(nèi)可溶的大分子復(fù)合體（如核糖體）、膜蛋白或者與膜相關(guān)聯(lián)的蛋白、以及與人類疾病和健康密切相關(guān)的細(xì)胞膜上受體與配基復(fù)合物（如細(xì)胞因子 /受體復(fù)合物）。 a. 細(xì)胞內(nèi)可溶性生物大分子復(fù)合體（核糖體等）的結(jié)構(gòu)和功能的研究 冷凍電子顯微學(xué)在分子機(jī)器的研究中已經(jīng)應(yīng)用得非常廣泛。以 蛋白質(zhì)的過程為例，從 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、 剪切、以至蛋白 質(zhì)的合成這一系列連續(xù)的遺傳信息傳遞過程中，冷凍電子顯微學(xué)都有著重要的貢獻(xiàn)。例如，真核細(xì)胞的 已經(jīng)有中等分辨率（ 1冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。我們將會以核糖體的高分辨功能態(tài)結(jié)構(gòu)為重點(diǎn)，同時(shí)展開對細(xì)胞中其它的一些重要分子機(jī)器的結(jié)構(gòu)解析，如蛋白酶體和各種分子伴侶復(fù)合體等。 自 2000 年核糖體的大小亞基分別被解析以來，在過去的十年中，核糖體的晶體學(xué)研究取得了巨大的進(jìn)展。迄今已經(jīng)有 T. 兩個(gè)原子分辨率的 70S 核糖體被解析。盡管這些晶體結(jié)構(gòu)提供了豐富的核糖體結(jié)構(gòu)信息，目前對詳細(xì)的蛋白合成分子機(jī)理卻仍未完全清楚。這主要是由于蛋白質(zhì)翻譯是一個(gè)高度動態(tài)的過程，每一步都有許多蛋白翻譯因子參與并與核糖體相互作用。迄今為止，只有 三個(gè)因子和核糖體所形成的復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)被解析 。與之形成對照的是，冷凍電子顯微學(xué)已經(jīng)成功解析出原核細(xì)胞的核糖體和所有翻譯因子形成的各種復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)，些冷凍電鏡結(jié)構(gòu)不僅大大地豐富了我們對蛋白合成的動態(tài)過程的理解，而且通過將核糖體高分辨的晶體結(jié)構(gòu) “嵌入 ”到這些不同功能態(tài)下的電鏡三維重構(gòu)圖中，還可以構(gòu)建出一系列準(zhǔn)原子分辨率的功能態(tài)結(jié)構(gòu)模型。 我們擬從以下幾個(gè)方面開展針對核糖體的結(jié)構(gòu)和功能的研究：（ 1）建立一個(gè)高效的、受控的核糖體體外轉(zhuǎn)錄體系。分離純化核糖體的大小亞基以及所有翻譯因子，在體外 模擬體內(nèi)的翻譯過程，精確控制核糖體復(fù)合體停留在指定的功能態(tài)，為下一步的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析提供優(yōu)質(zhì)樣品。并在這一系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，采用生物化學(xué)的方法研究蛋白翻譯過程中幾個(gè)懸而未決的問題，比如在延伸過程中， 解的作用到底是什么等。（ 2）核糖體的多種功能態(tài)的高分辨結(jié)構(gòu)解析。在課題一的研究基礎(chǔ)上，采用高通量的冷凍電鏡方法，解析高分辨率的核糖體的多種功能態(tài)結(jié)構(gòu)，然后通過分子動力學(xué)手段，構(gòu)建準(zhǔn)原子分辨率的各種功能態(tài)模型，從而揭示蛋白質(zhì)翻譯步驟中的分子機(jī)理。（ 3）核糖體的生物起源過程 的相關(guān)功能和結(jié)構(gòu)研究，如原核生物核糖體的組裝過程中的一系列的酶催化反應(yīng)。在這些反應(yīng)中，大小亞基前體中的 修剪和修飾。我們將在體外構(gòu)建包含這些酶因子（如 及 ）的核糖體復(fù)合體，解析它們的三維結(jié)構(gòu)，從而了解這些酶和核糖體亞基之間的相互作用，并根據(jù)獲得的三維信息，進(jìn)一步設(shè)計(jì)生物實(shí)驗(yàn)，以深入開展相關(guān)的功能性研究。 b. 膜蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能的研究 人類的很多重大疾病包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等都和膜蛋白密切相關(guān)。對膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功 能的深入研究是我們進(jìn)一步了解這些疾病的分子成因以及設(shè)計(jì)針對性藥物的基礎(chǔ)。迄今為止，只有大約 300 多個(gè)膜蛋白的結(jié)構(gòu)被解析，還遠(yuǎn)不到已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中收錄中所有結(jié)構(gòu)的 1%。 膜蛋白及其復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)的解析，以及其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究是目前蛋白質(zhì)科學(xué)研究的難題和熱點(diǎn)。 而，多數(shù)膜蛋白是以復(fù)合體的形式發(fā)揮功能，由嵌入膜內(nèi)的疏水部分（或者亞基）和伸在膜外的親水部分（或亞基）組成兼性 蛋白復(fù)合體，如數(shù)量眾多的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體、膜蛋白受體、核膜上的核孔復(fù)合體等。這 些膜蛋白復(fù)合體一般是由幾個(gè)或者幾十個(gè)蛋白組成，而且在執(zhí)行功能的時(shí)候寡聚結(jié)構(gòu)狀態(tài)可能發(fā)生改變。盡管膜蛋白復(fù)合體的局部結(jié)構(gòu)可以通過 是其整體組裝和動態(tài)的結(jié)構(gòu)變化，卻需要借助獨(dú)具手段的單顆粒冷凍電子顯微學(xué)來進(jìn)行研究。國際上綜合運(yùn)用 如對細(xì)胞因子 膜上受體復(fù)合物的研究。 我們擬從以下三個(gè)方面開展工作：（ 1）針對 樣品制備、電鏡圖像處理以及圖像篩選等方面，開展膜蛋白復(fù)合體的單顆粒三維重構(gòu)的方法學(xué)研究。（ 2） 細(xì)胞膜上受體與配基復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能的研究。我們將結(jié)合單顆粒冷凍電子顯微學(xué)及白細(xì)胞介素 族細(xì)胞因子與受體復(fù)合物為目標(biāo)，開展結(jié)構(gòu)解析以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究工作。目前為止，已發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素 族分子有 11 個(gè)，其中研究最為深入的包括 些細(xì)胞因子具有廣泛的生物活性，在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥、自身免疫和組織損傷過程中起著重要作用。它們還與 許多疾病的病理過程相關(guān)，如敗血性休克、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸部疾病、發(fā)熱等 ）。 族細(xì)胞因子的作用是通過細(xì)胞膜上的受體分子介導(dǎo)，進(jìn)而誘發(fā)胞內(nèi)的多條信號傳導(dǎo)通路。目前已知的 體分子包括 。 族細(xì)胞因子與受體組成三元復(fù)合物，例如 作用通過受體 導(dǎo)， 受體分子包括 與 受體分子包括 這些 族細(xì)胞因子 與受體三元復(fù)合物的單顆粒冷凍電鏡及 號從胞外傳導(dǎo)至胞內(nèi)的完整畫面，也為以號通路為靶標(biāo)的藥物設(shè)計(jì)在配基受體結(jié)合點(diǎn)上提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。（ 3）開展對 白復(fù)合體、 白復(fù)合體及鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白寡聚體等膜蛋白復(fù)合體的整體結(jié)構(gòu)的單顆粒解析以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究。其中，白復(fù)合體（約 450逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的出芽中起關(guān)鍵作用，與阿爾茨海默（ 及 毒感染有關(guān)。 白復(fù)合體由 一種典型的急性期蛋白復(fù)合體，參與人的炎癥反應(yīng)，在免疫系統(tǒng)反應(yīng)及抑制動脈粥狀硬化（ 揮重要功能。而鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白寡聚體 參與鎂離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要系統(tǒng)之一，維持細(xì)胞正常的生命活動所必需的。 課題 三， 高對稱性生物大分子復(fù)合體的高分辨結(jié)構(gòu)及其動態(tài)過程的研究 生物大分子復(fù)合體的對稱性在自然界中普遍存在，例如十四次對稱的十六次對稱的真核細(xì)胞核蛋白 二面體對稱的丙酮酸鹽脫氫酶復(fù)合體，八面體對稱的大腸桿菌蛋白 及和二十面體對稱的很多病毒殼等。單 一生物大分子復(fù)合體中也可能存在多種不同對稱性，如噬菌體的頭部呈二十面體對稱性，通過十二或十三次對稱的連接蛋白聯(lián)接六次對稱的尾部。生物大分子復(fù)合體的高對稱性組裝一方面反映了基因信息的高效經(jīng)濟(jì)利用，另一方面也顯示了復(fù)合體功能過程中的協(xié)同作用機(jī)制。在客觀上，這些高對稱性的存在使得高分辨率結(jié)構(gòu)的獲得變得相對容易。例如，具有 n 次對稱的大分子復(fù)合體在某個(gè)取向（如果不在 m 對稱軸線上）的透射電子投影圖像所能獲取的信息也同時(shí)包含了其它 對稱相關(guān)方向取向的電子圖像信息；而通過 m 對稱軸線的成像，也同時(shí)包含有（ n/ 其它 m 對稱軸線方向的信息。在多面體大分子復(fù)合體的取向和中心位置確定上，目前一個(gè)常用方法是通過搜索等價(jià)線（ 位置來實(shí)現(xiàn) 。 高對稱性的存在相應(yīng)增加了與對稱性相關(guān)的等價(jià)線條數(shù)，從而大大提高了等價(jià)線定位的精度。因此，相對于低對稱或非對稱的樣品，高對稱性樣品的電鏡圖像的取向和中心位置的確定過程中誤差大大減少，就有更好機(jī)會獲得更高分辨率三維結(jié)構(gòu)。 本課題的實(shí)施旨在以高對稱性的生物大分子復(fù)合體為研究對象，繼續(xù)提高冷凍電鏡高分辨結(jié)構(gòu)解析的能力，并開展結(jié)構(gòu)和功能相互關(guān)系的研究。 a. 獲得一系列高對稱 性生物大分子復(fù)合體的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并 爭取 獨(dú)立構(gòu)建 近原子級分辨率 模型 （ 1）以腸道病毒 71 型、重組人杯狀病毒殼和重組 毒殼 等 為研究對象，開展對這些具有二十面體對稱性的病毒殼的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的解析。這些都是重要的人類病毒，其中腸道病毒 71 型在嬰幼兒中引發(fā)手足口病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病甚至死亡，人杯狀病毒引起急性傳染性腹瀉，而 毒與中國南方高發(fā)的鼻煙癌緊密相關(guān)。（ 2） 以 狂犬病毒的核殼蛋白十聚體 等為研究對象 ，開展非二十面體的高對稱性復(fù)合體的冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)解析。（ 3）以皰疹病毒 等 為研究對象，對高對稱 性復(fù)合體的局部非高對稱性結(jié)構(gòu)（如皰疹病毒的 開冷凍電鏡三維重構(gòu)研究。當(dāng)重構(gòu)分辨率不足以建立原子模型的時(shí)候，參照同源蛋白和所獲得的三維結(jié)構(gòu) 密度圖進(jìn)行準(zhǔn)原子模型的構(gòu)建。 （ 4） 針對以上具有不同對稱性的結(jié)構(gòu)解析，探索 開發(fā) 高對稱性 復(fù)合體 三維重構(gòu) 的 新方法。如 針對較大尺度的高對稱性大分子復(fù)合體的高分辨率結(jié)構(gòu)研究；還希望 利用不同的對稱匹配函數(shù)（ 如 二十面體、八面體、四面體及二面體對稱匹配函數(shù)），對電鏡數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合 ， 并充分利用生物大分子復(fù)合體的對稱性，達(dá)到有效抑制噪聲，最終提高分辨率的作用。 b. 構(gòu)建具高對稱性的 生物大分子 復(fù)合 體在 不同生理狀態(tài) 或功能狀態(tài) 下的高分辨 時(shí)空模型 利用冷凍電鏡制樣能夠保持生物大分子生理狀態(tài)下結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，通過生物化學(xué)手段，對不同生理狀態(tài)下的同一生物大分子進(jìn)行分離，解析其在不同生理過程中的高分辨三維結(jié)構(gòu)；觀察蛋白結(jié)構(gòu)域的變化，在分子或者氨基酸殘基的水平上研究蛋白結(jié)構(gòu)功能間的相互聯(lián)系；并針對某些氨基酸殘基加以突變，觀察其三維結(jié)構(gòu)變化，研究其在大分子功能中所起的作用。 本研究將以腸道病毒 71 型 等為研究對象，獲得 在不同生理狀態(tài)和 功能狀態(tài) 的三維重構(gòu)，并構(gòu)建它們的高 時(shí)空 分辨率模型。 腸道病毒 71 型是在酸性的腸 道中開始其細(xì)胞感染過程的，但病毒致病和病理發(fā)生很多是在偏中性的神經(jīng)細(xì)胞中進(jìn)行的。因此需要了解不同生理環(huán)境下該病毒的結(jié)構(gòu)變化以及病毒感染和病理發(fā)生的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。另外，目前對該病毒的中和性抗原位點(diǎn)在病毒殼上的定位以及抗體中和的機(jī)制尚不清楚。通過獲取病毒在不同生理狀態(tài)下以及和中和性單抗 復(fù)合體 的高時(shí)空分辨率 結(jié)構(gòu)，就可以準(zhǔn)確定位中和性抗原位點(diǎn)，揭示抗體中和的分子機(jī)制。這方面的研究將為制備廣譜的中和性抗體和優(yōu)化疫苗的設(shè)計(jì)提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 課題 四 , 病毒、亞細(xì)胞器和細(xì)胞的高時(shí)空分辨結(jié)構(gòu)及其功能的在 體 /原位研究 冷凍電子斷層成像方法是目前唯一一個(gè)能在納米水平觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和相互作用的方法，填補(bǔ)了低分辨率的光學(xué)顯微分析以及原子分辨率的 時(shí)，它在保持生物體活性和結(jié)構(gòu)特征細(xì)節(jié)等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。 本課題的主要研究內(nèi)容是 a. 冷凍電子斷層成像的高通量數(shù)據(jù)收集以及電子斷層圖像的自動處理和高精度三維重構(gòu)的方法研究 對于具有結(jié)構(gòu)同一性的蛋白、病毒及其復(fù)合物等的三維重構(gòu)，可采用課題一至三中的單顆粒重構(gòu)方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。但對沒有結(jié)構(gòu)同一性的病毒及其復(fù)合物，以及細(xì)胞器和細(xì)胞水平下的蛋白質(zhì) 相互作用的三維結(jié)構(gòu)解析，只能采用電子斷層成像方法通過獲取同一區(qū)域的多個(gè)角度的投影圖來反向重構(gòu)它們的三維結(jié)構(gòu)。 電子斷層成像數(shù)據(jù)采集時(shí)傾轉(zhuǎn)樣品臺，存在兩個(gè)問題需要解決：第一，由于儀器樣品臺只能傾轉(zhuǎn)到有限的角度 70，導(dǎo)致 （ 70的數(shù)據(jù)缺失，此即所謂 “數(shù)據(jù)失錐問題 “（ 第二，由于樣品臺傾轉(zhuǎn)，導(dǎo)致樣品不同區(qū)域相對于焦點(diǎn)具有不同的高度，因此受不同的襯度傳遞函數(shù)（ 制。目前常用的結(jié)構(gòu)解析方法還沒有很好地處理 這兩個(gè)問題，限制了結(jié)構(gòu)解析的分辨率。我們將在課題進(jìn)行過程中對這兩個(gè)問題進(jìn)行深入的研究，采用雙軸傾轉(zhuǎn)等方法盡量克服“數(shù)據(jù)失錐問題”的影響，并對不同高度的區(qū)域進(jìn)行襯度函數(shù)校正。 同時(shí)，我們將充分結(jié)合電子斷層成像和單顆粒分析的各種優(yōu)勢，在用電子斷層成像方法得到病毒、細(xì)胞器以及細(xì)胞切片等的三維結(jié)構(gòu)后，對其中具有重要生物學(xué)意義的重復(fù)亞單元利用單顆粒分析類似的方法進(jìn)行三維空間中的多顆粒平均以及分類，以得到這些亞單元的高精度三維結(jié)構(gòu)。本部分可以和課題一的團(tuán)隊(duì)進(jìn)行密切配合與交流。 此外，隨著電子顯微鏡硬件設(shè)備的改進(jìn)和電 子斷層成像應(yīng)用的越來越廣泛，冷凍電子斷層成像的全自動、高通量數(shù)據(jù)收集以及圖像的自動處理和高效三維重構(gòu)也有更為迫切的需求。因此，我們在課題進(jìn)行過程中將努力探討新的樣品制備、數(shù)據(jù)采集、圖像處理和三維重構(gòu)方法，與課題一密切配合并積極采用課題一的最新研究成果。同時(shí)，我們將發(fā)展 據(jù)與電子斷層數(shù)據(jù)整合算法，擴(kuò)展數(shù)據(jù)范圍，并提高結(jié)構(gòu)解析的分辨率。 在以上電子斷層的方法學(xué)的研究之上，我們將開展以下方面的應(yīng)用工作： b. 心肌細(xì)胞內(nèi)部及其 “鈣火花 ”分子機(jī)器、肌細(xì)胞興奮 位三維重構(gòu) 心肌細(xì)胞上的鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是調(diào)控心肌細(xì)胞興奮 其基本單元 “鈣火花 ”的發(fā)放過程涉及到多種分子的相互作用，比如細(xì)胞表面質(zhì)膜上有電壓門控 漿網(wǎng)膜上有負(fù)責(zé)鈣釋放的離子通道 體 （ 子排列成二維分子陣列，形成鈣釋放單元 （ 質(zhì)膜 成二聯(lián)體。在心臟收縮期，由 十倍地放大鈣信號，這一過程稱之為 “鈣致鈣釋放 ”。對于這樣一個(gè)復(fù)雜的過程中涉及到的多種分 子的三維結(jié)構(gòu)，特別是在心肌細(xì)胞中的這些分子與分子之間如何進(jìn)行相互作用，目前所知甚少。本課題的研究將揭示這些分子機(jī)器對鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機(jī)理及調(diào)控機(jī)制及其與生理活動和心力衰竭的關(guān)系，為心臟病的預(yù)防及治療提供指導(dǎo)。 c. 利用冷凍電子斷層成像方法研究 毒、 毒和禽流感病毒等包膜病毒的結(jié)構(gòu) 包膜病毒對人體靶細(xì)胞的侵蝕都是通過病毒表面的包膜蛋白（ 位于靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合而引發(fā)的。在針對這些病毒的疫苗開發(fā)中，如何誘發(fā)和白有效結(jié)合的中和抗體（ 需要解決的關(guān)鍵問題。這些包膜蛋白在真實(shí)病毒表面的分布和結(jié)構(gòu)信息，它們和 細(xì)胞生理環(huán)境下如何相互作用，作用位點(diǎn)和方向如何，都所知甚少。本課題將利用冷凍電子斷層三維重構(gòu)方法研究 毒、 毒以及流感病毒等和靶細(xì)胞受體以及不同結(jié)合位點(diǎn)的中和抗體的在體 /原位相互作用。通過解析這些重要疾病相關(guān)的病毒 合體的高分辨三維結(jié)構(gòu)來精確定位靶細(xì)胞受體以及不同的中和抗體在真實(shí)病毒表面的空間位置、作用位點(diǎn)及方向，分析病毒表面抗原的結(jié)構(gòu)組成細(xì)節(jié)。 d. 利用冷凍電子 斷層成像方法研究其它具有重要生物學(xué)意義的大分子及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu) 除了以上心肌細(xì)胞 “鈣火花”分子機(jī)器以及包膜病毒表面結(jié)構(gòu)等，我們還將利用冷凍電子斷層成像方法研究其它具有重要生物學(xué)意義的生物大分子以及復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，如對表觀遺傳起重要作用的核小體 色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)及其調(diào)控的結(jié)構(gòu)機(jī)制等。 e. 開展心肌細(xì)胞鈣釋放以及病毒 結(jié)合定點(diǎn)突變等生化手段和快速冷凍的方法 ， 我們可以將心肌細(xì)胞鈣釋放以及病毒 程的不同時(shí)間階段（如心肌細(xì)胞鈣釋放的不同時(shí)間段、病毒 毒在細(xì)胞內(nèi)的組裝、成熟以及出芽階段等）分別制樣并進(jìn)行冷凍電鏡斷層成像。基于課題一中的方法學(xué)工作，特別是最大似然法等非監(jiān)督性分類方法，對獲取的不同時(shí)間段的樣品數(shù)據(jù)以及同一時(shí)間段內(nèi)可能包含的不同構(gòu)象的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重構(gòu)和分類 ， 由此獲得心肌細(xì)胞的鈣釋放過程和病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合過程在不同時(shí)間段的動態(tài)形態(tài)。通過對這些動態(tài)變化過程的可視化研究，開展對鈣釋放過程以及病毒 二、預(yù)期目標(biāo) 總體目標(biāo) 冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)是當(dāng)今國際生命科學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一 。 本項(xiàng)目將致力于探索相關(guān)生命過程中的重大科學(xué)問題，培養(yǎng)一批冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)人才，推動中國冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進(jìn)入世界領(lǐng)先水平。我們的總體目標(biāo)是集中力量開發(fā)全自動化、高通量的冷凍電子顯微學(xué)方法，并在此基礎(chǔ)上開展對重要生物大分子復(fù)合體（如核糖體、膜蛋白、病毒等）的高時(shí)空分辨的功能態(tài)結(jié)構(gòu)的解析， 同時(shí)開展基于電子斷層成像方法的在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上的實(shí)時(shí)在體研究。 五年預(yù)期目標(biāo) 1. 建立一流的冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)平臺，開發(fā)全自動化、高通量冷凍電鏡數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)、 高性能并行化的圖像處理和三維重構(gòu)方法，以及解決結(jié)構(gòu)不均一性的電鏡數(shù)據(jù)分類方法。 2. 利用單顆粒重構(gòu)方法，解析若干個(gè)與重要生命活動及重大疾病相關(guān)的生物大分子復(fù)合體的高分辨的功能態(tài)結(jié)構(gòu)，包括原核和真核細(xì)胞各功能態(tài)下的核糖體， 膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體等膜蛋白相關(guān)復(fù)合物，具 有 二十面體對稱性的病毒殼（如腸道病毒 71型，重組人杯狀病毒殼等），非二十面體對稱性的病毒蛋白復(fù)合體（如水庖性口炎病毒的核殼蛋白多聚體等），以及 具有局部低對稱 性病毒等。 3. 利用電子斷層成像方法利用電子斷層成像方法，進(jìn)行正常的細(xì) 胞生理環(huán)境下蛋白 毒 及病毒 建一些與重要生命現(xiàn)象或重大疾病相關(guān)的生命過程的高精度三維結(jié)構(gòu)模型。解析心肌細(xì)胞 “鈣火花”分子機(jī)器、包膜病毒表面分子及其復(fù)合物、以及核小體 4. 在冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域培養(yǎng)一支高水平科研隊(duì)伍。培養(yǎng)一批優(yōu)秀的碩士研究生，博士研究生和博士后研究人員。 5. 研究成果主要以研究論文形式公布，擬在一流國際刊物上發(fā)表學(xué)術(shù)論文 30篇以上。 三、研究方案 1、總體思路 本課題的中心學(xué)術(shù) 思想是依據(jù)國家 2006蛋白質(zhì)研究 ”重大計(jì)劃，集中力量發(fā)展冷凍電子顯微學(xué)這一具有高度潛力的結(jié)構(gòu)生物學(xué)新技術(shù)和新方法。對一系列重要的生物大分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能展開研究，力爭獲取它們在各功能狀態(tài)下的冷凍電鏡高 時(shí)空 分辨結(jié)構(gòu)，進(jìn)而闡明這些重要生物大分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。本項(xiàng)目課題 1 致力于突破高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析的限制因素，積極展開方法學(xué)領(lǐng)域的研究，開發(fā)全自動化、高通量冷凍電鏡數(shù)據(jù)采集和三維重構(gòu)圖像處理方法。在課題 1 的基礎(chǔ)上，課題 2將利用單顆粒三維重構(gòu)方法解析若 干個(gè)與重要生命過程相關(guān)的低對稱或非對稱性的生物大分子復(fù)合體（包括細(xì)胞內(nèi)可溶的大分子復(fù)合體，以及一些重要膜蛋白或者與膜相關(guān)聯(lián)的蛋白）的高分辨結(jié)構(gòu)，尤其是與它們的動態(tài)過程直接聯(lián)系的各種功能態(tài)的結(jié)構(gòu)，并同時(shí)開展相關(guān)的生理功能性的研究；課題 3 致力于解析一系列重要的高對稱性病毒大分子的準(zhǔn)原子分辨率結(jié)構(gòu)（ 3并獨(dú)立構(gòu)建分子模型，進(jìn)而揭示這些病毒大分子的動態(tài)結(jié)構(gòu)變化和功能的關(guān)系。課題 4 將利用冷凍電子斷層成像方法，重構(gòu)一系列病毒、亞細(xì)胞器和細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)，開展重要的在體 /原位研究 工作。課題 1 重點(diǎn)是理論方法上的研究和 突破，它的研究成果將為課題 2供方法基礎(chǔ)；課題 2在分子層次上研究；課題 4 是細(xì)胞和亞細(xì)胞層次上的研究。這四個(gè) 課題既相互關(guān)聯(lián)，又相互獨(dú)立。 參與本項(xiàng)目的清華大學(xué)、中科院上海巴斯德研究所、中科院生物物理所、以及北京大學(xué)是我國冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究中心。我們將發(fā)揮各自優(yōu)勢，重點(diǎn)突破，共同協(xié)作，促進(jìn)我國冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)的進(jìn)步，盡快使我國的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究達(dá)到世界領(lǐng)先水平，并培養(yǎng)出一批冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)的杰出人才。 2、技術(shù)途徑 1) 本項(xiàng)目采取多學(xué)科相互交叉、滲透和有機(jī)結(jié)合的途徑，以冷凍電子顯微學(xué)為主，結(jié)合 應(yīng) 用數(shù)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、信息科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等，開發(fā)全自動、高通量冷凍電子顯微學(xué)方法； 2) 本項(xiàng)目采用理論研究與實(shí)驗(yàn)科學(xué)相結(jié)合的策略，理論研究（課題 1）的成果指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)科學(xué)（課題 2實(shí)驗(yàn)科學(xué)中遇到的問題反過來推動理論研究，兩者互相促進(jìn)； 3) 本項(xiàng)目采用一般性與特殊性相結(jié)合的策略，既保證課題的相對獨(dú)立，又保證課題的相互協(xié)調(diào)。對于所有課題都存在的一般性問題，如樣品的冷凍制備和數(shù)據(jù)采集問題，所有課題同時(shí)進(jìn)行，一旦有一個(gè)課題組成功，其它課題組可借鑒成功的經(jīng)驗(yàn)，加快課題的進(jìn)度；而對課題專一的特殊性問題，如圖像處理問題和結(jié)構(gòu) 解析問題，則分別進(jìn)行，各個(gè)擊破； 4) 本項(xiàng)目課題由分子層次到細(xì)胞與組織層次，由簡單到復(fù)雜，循序漸進(jìn)，確保項(xiàng)目成功； 5) 離體（ in 在體（ in 究相結(jié)合。一方面在分子水平離體研究生物大分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)（課題 2另一方面應(yīng)用電子斷層方法在體研究生物大分子復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)及相互作用（課題 4），使離體與在體研究相統(tǒng)一。 四、年度計(jì)劃 年度