DB21T 1749.3-2009 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗檢測技術規(guī)程

案號： 遼 寧 省 地 方 標 準 2009 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗檢測技術規(guī)程 2009布 2009施 遼寧省質量技術監(jiān)督局 發(fā)布 2009 I 前 言 本標準附錄 A、附錄 B、附錄 C、附錄 D、附錄 E 為規(guī)范性附錄。 本標準由遼寧省農村經濟委員會提出并歸口。 本標準起草單位：遼寧省植物保護站。 本標準主要起草人： 蔡 明、宋雅坤、吳元華、李明福、江 冬、李 眷、李維根。 2009 1 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗檢測技術規(guī)程 1 范圍 本標準規(guī)定了 黃瓜綠斑駁花葉病毒 （ 的檢驗檢測與鑒定方法。 本標準適用于全省各地開展黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢驗檢測工作 。 2 術語和定義 下列 術語和定義適用于本標準。 檢驗 植物 、植物產品或其他限定物進行官方的直觀檢查以確定是否存在有害生物和 /或是否符合植物檢疫法規(guī)。 檢測 確定是否存在有害生物或為鑒定有害生物而進行的除肉眼檢查以外的官方檢查 。 鑒定 可疑的有害生物是否與已知物種同一的鑒別過程 。 發(fā)生 方報道在一個地區(qū)存在著土生或傳入的有害生物 ，和 /或官方未報道在一個地區(qū)存在的有害生物已經被根除。 3 原理 黃瓜綠斑駁花葉病毒 屬煙草花葉病毒屬。 其病原形態(tài)特征見附錄 A，其寄主范圍、地理分布、生物學特性、危害癥狀和傳播途徑見附錄 B，其血清學檢測技術，應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法技術（ 定和分子生物學（ 定，具體檢測方法見附錄 C、附錄 D。 4 材料、儀器、 用具及藥品 料 葫蘆科作物種子 、葉片和果實。 器、用具 電子顯微鏡 、臺式離心機、分光光度計、 箱、酶聯(lián)板、酶聯(lián)讀數(shù)儀、微量加樣 器、洗瓶、載玻片、玻棒、研缽、微量離心管、培養(yǎng)皿、打孔器、滴管、吸管、量筒、三角瓶、水浴鍋、毛細管、針頭、電泳儀、水平電泳槽、膠手套、剪刀 、鑷子、自封袋、油性筆、標簽、記錄本等。 品 ?；钥贵w免疫球蛋白 1度約為 1mg/酶標記羊抗兔抗體球蛋白 1售 )、碳酸鈉 (無水 )、碳酸氫鈉、疊氮化鈉、磷酸氫二鈉 (無水 )、磷酸二氫鉀 (無水 )、氯化鈉、氯化鉀、 蛋清粉、聚乙烯吡咯烷酮、亞硫酸鈉 (無水 )、牛血清白蛋白、二乙醇胺、氯化鎂等。 2009 2 5 現(xiàn)場檢驗鑒定 子檢查 在 11月翌年 2月份對市場銷售的葫蘆科作物種子和砧木種子進行扦樣，每份樣品取 100粒，送指定的有關部門進行檢測。重點檢查用做砧木的種子。 間調查 3月 10月份在黃瓜綠斑駁花葉病毒的發(fā)生期，選擇有代表性地塊，檢查葉片、果梗、果實，看葉片上是否出現(xiàn)黃綠相間斑駁、隆起、皺縮、蕨葉，果梗是否有褐色條斑，果實表面是否有斑駁、凸起，果實內部是否有空洞、黃絲、果肉暗紅倒瓤等。 狀檢驗 從植株上摘取病葉或果實，與附錄 合附錄 在調查現(xiàn)場將病葉取下，用快速診斷試紙條或診斷試劑盒（附錄 E）進行初步診斷。 害發(fā)生分級標準 (以株為單位 ) 0級 ： 無任何癥狀； 1級 ： 心葉明脈，輕微花葉 ，發(fā)病面積占整個植株面積的 5%以下； 3級 ： 心葉及少數(shù)葉片花葉，發(fā)病面積占整個植株面積的 6 15%； 5級 ： 多數(shù)葉片花葉，少數(shù)葉片皺縮、畸形，植株輕微矮化，發(fā)病面積占整個植株面積的 16%30%； 7級 ： 多數(shù)葉片嚴重花葉，多數(shù)葉片皺縮、畸形，植株矮化，或葉柄有褐色壞死斑點，發(fā)病面積占整個植株面積的 31% 50%； 9級 ： 嚴重發(fā)病，葉片嚴重畸形，植株嚴重矮化，莖部有褐色條斑，發(fā)病面積占整個植株面積的 51%。以上。 情指數(shù) 按下式 計算。 100)( IN （ 1） 式中： 病情指數(shù)； n 各級病株數(shù)； N 該病級數(shù)； i 調查總株數(shù)； I 最高級數(shù)。 6 實驗室檢測鑒定 經現(xiàn)場檢驗檢測，不能確定為黃瓜綠斑駁花葉病毒的，取樣帶回實驗室進行檢測鑒定。 樣方法 在發(fā)病植株上，隨機選取發(fā)病葉片或果實（其數(shù)量以滿足檢測鑒定所需 為限），裝入聚乙烯塑料袋中密封，貼好標簽帶回。標簽應注明采集時間、地點、采集人等信息。對所采集的樣本，應放入低溫（ 4 ）密閉保存，要盡早進行鑒定。 毒鑒定 將所采集的樣本進行血清學檢測技術 （ 分子生物學技術（ 定，將檢測結果與附錄合附錄 定為黃瓜綠斑駁花葉病毒。 2009 3 7 標本保存 配有田間調查的植株、葉片、花、果實等資料，癥狀照片 ;當?shù)貙＜业某醪借b定或識別結果。 品采集應以幼嫩葉片為主，特殊材料可以根據(jù)具 體情況靈活掌握，樣品數(shù)量不少于 200g/份，每個標樣 2份，提倡凍干樣品（冷凍樣品），送指定的專家鑒定。 地設法保存活體樣品，以備應急使用。 合壓制的葉片標本，應隨采隨壓于標本夾中。 載寄主名稱、發(fā)病情況、環(huán)境條件、采集地點、采集日期、采集人姓名等。 2009 4 附 錄 A （資料性附錄） 黃瓜綠斑駁花葉病毒分類命名和病原特征 類和命名 名 類地位 煙草花葉病毒屬 (毒異名 , 原特征 毒粒子 直棒狀病毒，長 300 15沉淀系數(shù) 185S。等電點 80 酸 核酸含量 5，單鏈 子量 2106。 G:A:C:U= 蛋白含量 95，分子量 17261。氨基酸 160，其組成為 毒株系 根據(jù)不同分離物的血清學反應及其對 莧色藜和 蔓陀羅的癥狀反應，將其分為以下株系。 主要有 英國和歐洲報道的 典型株系（ 1935） ，日本報道的黃瓜株系（ 、西瓜株系（ 和 系 （ ，以及 印度 C 株系 (et 1975)。 2009 5 附錄 B (資料性附錄 ) 黃瓜綠斑駁花葉病毒的寄主范圍、地理分布、生物學特性、為害癥狀、傳播途徑及鑒別寄主 主范圍 然寄主 西瓜、南瓜、甜瓜、黃瓜、葫蘆、西葫蘆、瓠瓜。 主范圍 莧色藜、 蔓陀羅、 甜瓜、筍瓜、西葫蘆、葫蘆、絲瓜、煙草 。 理分布 目前， 世界已廣泛分布，歐洲的英國、愛爾 蘭、德國、荷蘭、丹麥、俄羅斯、希臘、奧地利、捷克、斯洛伐克、芬蘭、南斯拉夫、羅馬尼亞、摩爾多瓦、波蘭、烏克蘭、拉托維亞、保加利亞、捷克、匈牙利、西班牙、瑞典；南美洲的巴西；亞洲的日本 ( 山、德島、北海道、千葉 )、印度 (韓國、巴基斯坦 (西北部邊境省份 )、以色列、沙特阿拉伯、伊朗、朝鮮及 我國的遼寧、河北、山東、廣東、湖北等省發(fā)生。 物學特性 死溫度 黃瓜綠斑駁花葉病毒的致死溫度為 90 100 釋限 點 黃瓜綠斑駁花葉病毒的稀釋限點 為 10 10-7 外存活期 體外存活期較長， 達 119d 以上 。 在 0 可保持數(shù)年， 20 病毒仍能存活 。 病毒在種子內可存活240d 540d， 病殘體 在土壤內 深埋 420d，病毒仍有侵染活性 。 毒 粒體形態(tài) 電鏡 觀察 病毒粒體為棒狀，長約 300寬 15 害癥狀 瓜染病癥狀 幼葉出現(xiàn)淡黃色花葉，其后出現(xiàn)斑駁、花葉、葉脈綠帶狀、濃綠凹凸斑等，隨葉片老化癥狀減輕。有時也呈葉脈綠帶狀。果實表面濃綠圓斑，果蒂處有時壞 死，種子周圍的果肉呈赤紫色水漬狀，成熟時變?yōu)榘岛稚霈F(xiàn)空洞，并且呈絲狀纖維化， 腐爛變味，不能食用。 瓜染病癥狀 感病后莖端新葉出現(xiàn)黃斑，但隨新葉老化癥狀減輕。 成株側枝葉出現(xiàn)不整形或星狀黃花葉，生育后期頂部葉片有時再現(xiàn)大型黃色輪斑。果實有兩類癥狀，一種在 果實表面出現(xiàn) 綠色斑。另一種在綠色部的中心出現(xiàn)灰白色部分。 瓜染病癥狀 感病初期 新葉出現(xiàn)黃色小斑點 ，以后黃色部分擴展成花葉，并發(fā)生濃綠瘤狀突起，出現(xiàn)葉脈綠帶。發(fā)病輕時 果實只 出現(xiàn) 淡黃色圓形小斑點， 嚴重時 出現(xiàn)濃綠色瘤狀突起變成畸形 。 播途徑 播方法 多種傳播方式 ： 括 植物間接觸、農事操作、汁液 ）； 2009 6 傳毒（如 菟絲子 、 黃瓜葉甲 ）； 嚙齒動物的糞便、栽培營養(yǎng)液、河水、灌溉水、被污染的包裝容器、用作肥料的牛糞 ）。 其中帶毒種子是遠距離傳播主要途徑。接觸性傳染是近距離傳播主要途徑。 染循環(huán) 該病毒在種子、病株殘體 、土壤 中均可越冬，成為第二年的初侵染來源。帶毒種子是主要 初 侵染源。在田間， 很容易地通過病株的汁液接觸 傳播， 人工 嫁接和授粉等方式 易再 傳染 。 因此，田間農事操作如 整枝、上架、摘心、授粉、嫁接、摘果均可 導致該病毒的再次傳播。 行與環(huán)境 發(fā)病受溫度影響，在 16 時 侵染至 發(fā)病 需 2 3周， 顯 病 較 輕 ； 在 28 35 下接種 1周即可發(fā)病，癥 狀 重。 有株系都是極端穩(wěn)定的，其致死溫度 90 100 ，稀釋限點10 10溫下病毒侵染力可保持數(shù)月，在 0 可保持數(shù)年， 20 病毒仍能存活，一旦條件適宜還能繼續(xù)傳播蔓延。田間一旦發(fā)病，如未進行特殊的殺滅處理，病株殘體中的病毒可存活多 年，即便將病根埋在土壤內 365毒仍保持侵染能力。 別寄主 瓜 新葉出現(xiàn)黃色小斑點，后呈花葉并帶有濃綠色突起，葉脈間褪色呈葉脈綠帶狀。 瓜 莖端幼葉出現(xiàn)淡黃色花葉，其后出現(xiàn)濃綠凸凹斑，隨葉片老化癥狀減輕。果實表面濃綠圓斑，中央有壞死點，種子周圍的果肉呈赤紫色水漬狀，成熟時變?yōu)榘岛稚霈F(xiàn)空洞。 瓜 新葉出現(xiàn)黃斑，但隨葉片老化呈葉脈綠帶狀。 瓜 葉片出現(xiàn)花葉，有綠色突起，脈間黃化呈葉脈綠帶狀。 蘆 幼葉出現(xiàn)淡黃色花葉， 其后出現(xiàn)濃綠凹凸斑，隨葉片老化癥狀減輕。 色藜 經西瓜株系、 系和印度 C 株系侵染后出現(xiàn)細小局部壞死斑，而歐洲黃瓜株系不出現(xiàn)這種癥狀；無系統(tǒng)侵染。 陀 羅 系和日本的黃瓜株系在接種后 7d 產生能擴散的局部褪綠斑；無系統(tǒng)侵染。 2009 7 附錄 C (規(guī)范性附錄 ) 黃瓜綠斑駁花葉病毒雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（ 準 器和用具 器設備 離心機、 電子天平 （ 1/10 000g） 、 酶標儀 等。 具 可調移液器 （ 20L 200L、 200L 1000L）及相關吸 頭、 研缽、離心管（ 10量筒、燒杯 等 。 劑 被緩沖液 無水碳酸鈉 碳酸氫鈉 疊氮化鈉 蒸餾水 定容至 1000整 4貯存。 洗滌緩沖液（ 磷酸氫二鈉（無水） 磷酸氫二鈉（十二水） 磷酸二氫鉀（無水 ） 氯化鈉 化鉀 吐溫 餾 水定容至 1000整 溫貯存。 取緩沖液 雞蛋清粉 分子量 2400） 無水亞硫酸鈉 疊氮化鈉 吐溫 解于 10001X ，調整 4 貯存。 標抗體緩沖液 牛血清蛋白 子量 2400） 疊氮化鈉 溶解于 10001X 整 4 貯存。 物緩沖液 二乙醇胺 氯化鎂 疊氮化鈉 蒸餾水 定容至 800 整 4 貯存。 樣方法 子 取 若干 粒種子，去皮，加入樣品提取緩沖液（ W/V=1： 8）研磨勻漿，離心后 4 保存待用。 片 取葉片加入提取緩沖液 （ W/V=1： 8）研磨勻漿。離心后 4 保存待用。 被 將 包被抗體按 照試劑盒指定稀釋比例用包被抗體緩沖液稀釋，混勻 ，加入酶聯(lián)板中 ，每孔內加入 100 L， 放入保濕盒內， 4 冰箱 過夜。 滌 孵育結束后，將反應孔中的試劑倒出，用 滌液沖洗 3 次 4 次，每次 15s，然后將微孔板倒扣在吸水紙上以控干孔中殘留液體。 2009 8 入抗原（待測樣品） 在酶聯(lián)板中加入抗原 (待測樣品 )，同時加入 陽性指控物和空白對照（即樣品提取緩沖液），陽性指控物、空白對照和待測樣品每孔內加入 100 L，待測樣品重復 3 次，恒溫箱中或室溫（ 2025 ）孵育2 h。 滌 按本規(guī)程 行。 入酶標抗體 將 酶標 抗體按 照試劑盒指定稀釋比例用酶標抗體緩沖液稀釋，混勻 ，加入 酶聯(lián)板中 ，混合均勻，于每個反應孔中加入 100L， 放入保濕盒內， 室溫（ 2025 ）孵育 2 h。 滌 按本規(guī)程 行。 入底物試劑 孵育結束前的 15 備 物溶液，加入 色劑，混合均勻，加入酶聯(lián)板，每孔 100 L。放入保濕盒內， 室溫（ 20 25 ）避光 30 60 止反應 于每孔中加入 50 L 終止液，終止反應。 定 用酶標儀在 405 長下測量結果，讀取各孔溶液的光密度值（ ）。 果評定 根據(jù)試劑 盒提供的方法和標準 。在陽性對照光密度值符合試劑盒設定值的前提下， 以微孔中 陰性 對照的 2 倍為標準，大于這個數(shù)值的樣品為陽性結果，小于這個數(shù)值為陰性結果 。 另外各參照孔（包括底物孔、緩沖液孔、陰性對照、陽性對照）測定值要符合試劑盒設定的目標值；重復樣品孔的光密度值一致。 品保存 對于檢測結果顯示為陽性的樣品 ，必須對樣品進行保存。 種子樣品 應保存在 4 冰箱內，葉片和果實樣品應保存在 20 冰箱內。 果記錄與資料保存 完整的實驗記錄包括 ：樣品的來源、種類、接收時間，實驗的時間、地點、方法和結果等，并要有經 手人和實驗人員的簽字。 2009 9 附錄 D (規(guī)范性附錄 ) 黃瓜綠斑駁花葉病毒 增聚合酶鏈式反應測定 (準 器和用具 器設備 泳儀、 凝膠成像分析儀 、 冷凍離心機、 電子天平 （ 1/10 000g） 、 、水浴鍋、 振蕩器等。 具 可調移液器 （ 0L 20L、 20L 200L、 200L 1000L）及相關吸 頭、 、 研缽、離心管（ 10 0.2 量筒、燒杯、鑷子 等 . 試劑 。 其他試劑：液氮、氯仿、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、溴化乙錠。 檢疫程序 器皿前處理 為防止 皿在 試 驗前都要 用 V： V=1： 1000） 進行處理。將研缽 、 槍頭 、離心管等放于 7 ，浸泡 24 h，取出后 121 滅菌 30烘干備用。 總 提取 取 顯癥 的葉片液態(tài)氮 中充分 研磨， 轉入 1.5 離心管中 ，加入 1 劑，室溫下靜置5 加入 200 5 s，室溫下放置 5 12000 r/4 離心 15 移上清于一個新離心管中，加 600 0 12000 r/4 離心 15 掉上清液，在沉淀物中加 1 5%的乙醇清洗 1次，吸掉上清后室溫干燥 35 入 30 L 應體系 引物序列 ( 上游引物 （ ） ： 5 下游引物 （ ） ： 5 驗步驟 成 按下列組分制備 0L， 反應以加入 不含 反應 條件為 42 1 h； 99 5 5 5 反應體系見 表 增 在冰 浴 上依次將下列組分加入 ， 反應采用 50 L 體系 。反應條件為： 94 預變性 3 4 變性 30 s， 53 退火 45s， 72 延伸 1 35 個循環(huán)； 72 延伸 10 應 體系見 表 增產物凝膠電泳檢測 取 5 L 擴增產物用 6解，點樣。電泳檢測，用溴化乙錠（ 液進行染色 30 外成 相系統(tǒng)（ 觀察結果并攝像。 2009 10 表 應體系 表 應體系 結果評定 觀察電泳結果 ， 00斷樣品攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒，否則為陰性。 樣品保存 對于檢測結果顯示為陽性的樣品，必須對樣品進行保存 備查 。 種子樣品 應保存在 4冰箱內，葉片和果實樣品應保存在 箱內。 果記錄與資料保存 完整的實驗記錄包括：樣品的來源、 種類、接收時間，實驗的時間、地點、方法和結果等，并要有經手人和實驗人員的簽字。 反應組成 體積（ L） （ 10M） 10 各 10 1 40 U/L） 0 反應組成 體積（ L） 50 （ 10M） T 產物（ 10 0 2009 11 附錄 E (規(guī)范性附錄 ) 黃瓜綠斑駁花葉病毒 快速診斷試紙條或檢測盒 測定標準 測樣品處理 植物樣品在檢測前需經研磨，并用緩沖液稀釋。植物葉片樣品