葡萄糖酸氧化桿菌產(chǎn)木糖醇發(fā)酵條件優(yōu)化及關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá)

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文葡萄糖酸氧化桿菌產(chǎn)木糖醇發(fā)酵條件優(yōu)化及關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá)姓名林燕清申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師張建國20120309化疾咎譴嫉姆吞跫杏嘔覩中克隆得紀(jì)亞餉珹基因及木糖醇脫氫酶疞，裝液量，接種量詬梅吞跫攏珼木酮糖的產(chǎn)率就L塹牟看锏木糖醇對(duì)木糖醇脫氫酶活性有明顯的抑制作用。在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，用事短橋嘌腉轉(zhuǎn)化率低這一難題提供了線索?？寺∽缘哪咎谴济摎涿概c已報(bào)道的序列相似性僅為，是一個(gè)新的木糖醇脫氫酶基因。酶學(xué)性質(zhì)研究鷈猘瑆，甇瑆甌痬瑀甌瑀痭痳；籇籜感謝潘海峰師兄、宋衛(wèi)斌師兄和鮑文娜師姐，在我剛開展課題時(shí)給予各方面的引導(dǎo)和幫助，使我能快速并順利的開展課題研究。感謝程永青、王莉、蘭翔、李博義對(duì)我學(xué)習(xí)和生活的關(guān)心和幫助。感謝杭州寶晶生物公司的工作人員胡海燕、楊丹燕和范嬌陽在我科研工作和生活上提供的幫助和支持。感謝兩年多來與我朝夕相處的同窗舍友，正因有她們的陪伴，我的研究生生活才如此多姿，與她們共同經(jīng)歷的這段美好回憶，將是我一生的財(cái)富。感謝生化所研究生班的同學(xué)們?cè)谖胰温毎嗉?jí)團(tuán)支書期間給予的全力支持和配合。感謝浙江大學(xué)生化所其余實(shí)驗(yàn)室的老師、學(xué)長學(xué)姐和同學(xué)在這兩年多的工作學(xué)習(xí)中對(duì)我的幫助和鼓勵(lì)。最后，感謝我的父母、男朋友余美瓊及其他親人，感謝你們默默的關(guān)心、包力，不辜負(fù)你們的期望。林燕清英文縮寫詞表瓸木糖醇簡介全球糖尿病患者約為億，占總?cè)丝诘模麄儾灰藬z入食糖，但又喜生長、不影響體內(nèi)胰島素水平】。此外，研究表明，食用木糖醇能增加骨鈣水平而有效防止骨質(zhì)疏松】。在各類糖醇中，木糖醇甜度最高，與蔗糖相當(dāng)，且能量比蔗糖低；感好，表木糖醇與蔗糖理化性質(zhì)比較微生物轉(zhuǎn)化法目前，絲狀真菌如疞木糖的培養(yǎng)基中疞木糖醇】。真菌中，利用木糖產(chǎn)木糖醇的菌主要是酵母，假絲酵母屬鏑，屬冒屠轄湍甘如疞，木糖醇轉(zhuǎn)化率，木糖醇的體積細(xì)菌可將木糖還原為木糖醇，如腳諍疞木糖產(chǎn)生木糖醇的路徑同酵母。年，和提出以葡萄糖為底物產(chǎn)生木糖醇【】。將就L親D咎譴肌俊捎詬米婕叭治錚肪噸芷誄每偎拷湍甘、德巴利氏酵母屬、的葡萄糖培養(yǎng)基中發(fā)酵跡珼阿拉伯醇的轉(zhuǎn)化率為【】。一諍的葡萄糖培養(yǎng)基中發(fā)酵阿拉伯醇，阿拉伯醇的體積產(chǎn)率達(dá)糖為原料生產(chǎn)木糖醇可由兩步法實(shí)現(xiàn)，即葡萄糖先轉(zhuǎn)化成技癉一阿拉訢阿拉伯醇轉(zhuǎn)化成木糖醇。年，等報(bào)道了畂木糖醇涉及兩個(gè)催化反應(yīng)即紀(jì)亞餉呋疍阿拉伯醇脫毛籜苯又至課痸保等報(bào)道的畂阿拉伯醇的培養(yǎng)基中發(fā)酵隕轄霾行初步研究。锪浚核淙籊獶阿拉伯醇轉(zhuǎn)化為木糖醇的產(chǎn)率從等對(duì)就L遣撓跋臁緣詼階究翁庖環(huán)矯嬋疾熗頌莢炊訥】尤新我國甜味劑生產(chǎn)發(fā)展和研發(fā)方針】食品工業(yè)科技，甁，琀細(xì)蘊(yùn)鋘瓵珿，【縈甈，珼甅，甅緽，縀珻現(xiàn)甈猘甁伯醇條件的優(yōu)化【浚镅縕，珼，【】，篶產(chǎn)木糖醇發(fā)酵條件優(yōu)化前言的培養(yǎng)條件進(jìn)行初應(yīng)中，輔酶被還原，第二步反應(yīng)中，輔酶被氧化。本章的出發(fā)點(diǎn)首先，用微生實(shí)驗(yàn)材料型高速離心機(jī)上海培清科技有限公司型蒸發(fā)光散射檢測器上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司上海精科實(shí)業(yè)有限公司型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱型漩渦混合器瑞士梅特勒托利多集團(tuán)上海生工生物技術(shù)有限公司北京鼎國生物技術(shù)有限公司北京鼎國生物技術(shù)有限公司北京鼎國生物技術(shù)有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司浙江省建德市蓮花化工有限公司國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司購自中國微生物菌種保藏中心。疞，酵母抽提物疞，碳酸鈣疞，瓊脂種子培養(yǎng)基甘油疞，酵母抽提物疞，蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)基疞，。疞，培養(yǎng)條件，劃實(shí)驗(yàn)方法轉(zhuǎn)化液或發(fā)酵液中的木糖醇、己虳。木酮糖采用高效液相色譜法猵定量】。具體分析方法如下販治鑾按恚喝庋穕“，流動(dòng)相為魎賚。漂移管的溫測活體系、贠和的變化量。培養(yǎng)基對(duì)菌生長的影響在不同生長培養(yǎng)基中的增值情況。各溫度對(duì)菌體生長的影響由于該菌的生長對(duì)溫度敏感，為了促進(jìn)菌體生物量的增長，本課題對(duì)不同溫養(yǎng)基嘌耙毫恐峙嘌露熱鮒馗礎(chǔ)又至。根據(jù)培養(yǎng)由于該菌嚴(yán)格好氧，為了找到適合菌體生長的裝液量，對(duì)不同裝液量條件下菌體生物量的增長情況進(jìn)行考察，裝液量、。接種量門嘌于痬條件下培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)缶旱腛判斷最適裝液量。、吶嘌械納榭觶菖嘌痬條件下培養(yǎng)扛鯟濃度三個(gè)重復(fù)。根據(jù)培養(yǎng)皃卸獻(xiàn)釷蔆濃度。生長曲線測定滌細(xì)胞，并用轉(zhuǎn)化液阿拉伯醇濃度為，于。，于，疞。制，在發(fā)酵的前中肌木酮糖及木糖醇的濃度。碳源等因素對(duì)菌體生長及轉(zhuǎn)化可能有重要影響，因此對(duì)這些因素進(jìn)行的影響進(jìn)行舛及。，發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基中置于發(fā)酵舛鴕褐械納锪考癉木酮糖及寂取渲蟹團(tuán)嘌蠨阿拉伯醇初始濃度為。每組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。結(jié)果與討論培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)菌生長的影響在不同生長培養(yǎng)基中的增值情況。具體在各種生長培養(yǎng)基中的生長情況見圖魯量薔培養(yǎng)物的酸化將降低菌的轉(zhuǎn)化活性，因此本課題采用培養(yǎng)基魑狦溫度對(duì)茵體生長的影響本課題考察不同溫度條件下菌體生物量的增長情況，結(jié)果如圖所示。由長最好，且在培養(yǎng)了笈嘌旱膒，酸化程度有限。因此在后續(xù)鲞疞，經(jīng)比較當(dāng)酵母抽提物為疞時(shí)，疞，甘油疞，蛋白胨痳跫屢嘌鳪疞，甘油疞，蛋白胨生長曲線養(yǎng)條件培養(yǎng)畂，歷畂的休止細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；其次，用畂試驗(yàn)的結(jié)果如表所示。從表可知，菌體在發(fā)酵過程中，以阿拉伯醇為底物產(chǎn)表發(fā)酵與休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化對(duì)產(chǎn)木糖醇的影響發(fā)酵過程凸拗校，發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的過程曲線珼，獂瑇畂揮贕由于隚酶偕虼薌由圖可以看出在這整個(gè)發(fā)酵過程中，分成兩個(gè)階段，第一個(gè)階段，菌體獶高木糖醇的產(chǎn)率。因此提高木糖醇的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)關(guān)鍵在于找到限制甲狣木酮糖的最適培養(yǎng)通過影響生物膜兩側(cè)的氧化還原電位從而影響能量代謝，從而影響菌體較高，綜上；為較適合的發(fā)酵條件。琷鼉羞諞訢阿拉伯醇為底物進(jìn)行培養(yǎng)及氧化發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液的迅速酸化，導(dǎo)致菌體生長及發(fā)酵反應(yīng)被抑制，甲狣木酮糖的最適培養(yǎng)溫度微生物的生長和產(chǎn)物的形成是一系列化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，像其他化學(xué)反應(yīng)一甲狣木酮糖的最適裝液量溆嘧櫚姆褪奔湮甲狣木酮糖的最適接種量種量為?，D木酮糖的產(chǎn)量、得率及轉(zhuǎn)化效率最高。蛉狽晁嵬亞餉付荒芙腥人嵫吠揪的氫酶的活性有抑制作用。圖莢炊訥鶧木酮糖的影響?yīng)x轉(zhuǎn)化能力的影響碳源不僅可以作為微生物生長的物質(zhì)和能量來源，在微生物代謝中也起著重獶木酮糖轉(zhuǎn)化所示，推測包括莢諛詰娜縞纖鎏莢矗訥不同碳源中菌體生長情況、菌破胞液木糖醇脫氫酶活性及細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)甘油、木糖醇支持菌體生長，而乳糖，木糖及果糖對(duì)菌的生長有明顯的抑制作用。將用各種碳源培養(yǎng)的菌，加入轉(zhuǎn)化，測定轉(zhuǎn)化率圖甀所示。在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，用事短橋嘌腉的轉(zhuǎn)寂嘌腉的轉(zhuǎn)化能力最低，僅為對(duì)照的。暑移移锪沁夠峨咖小幢童毛垂姜琲小結(jié)發(fā)酵過程曲線，根據(jù)發(fā)酵過程曲線，再影響甲狣木酮糖的效率。木糖醇脫氫酶的活性有明顯的促進(jìn)的抑制作用。在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，用事短橋嘌腉中木糖醇琀琇【縋，甅【啃燁煅簦脛?lì)i螅鎘窕醵簦履苧醵訪蘇氨酸發(fā)酵的影響】微生物學(xué)通報(bào)，琀琇，一一七中紀(jì)亞餉復(fù)呋疍阿拉伯醇脫氫快速生成就L牽褼木酮糖的率高，而木糖醇的產(chǎn)率卻很低，的阿拉伯醇脫氫酶【】；有來源于細(xì)菌的，如，其中酵母來源的阿拉伯醇脫氫酶屬于紀(jì)亞餉福呋疍一阿拉伯醇脫氫生成送L荹】，而細(xì)梢砸訢阿拉伯醇為底物生產(chǎn)木酶屬于短鏈脫氫酶家族，但短鏈脫氫酶家族各成員間，氨基酸序列相似性很低的來自包括醋酸桿菌在內(nèi)的細(xì)菌的木糖醇脫氫酶則相對(duì)較少。中紀(jì)亞餉復(fù)呋疍醇脫氫酶和木糖醇脫氫酶進(jìn)行研究。為了該轉(zhuǎn)化路徑中的脫氫酶，通過查閱已報(bào)道的與本研究所用菌親緣關(guān)系較純化出重組蛋白，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。材料敲顧氐腖嘌柿甌，的固體培養(yǎng)基中，倒置培養(yǎng)過夜浚羧糶鑰寺贚腖嘌校媯痬。提物疞，甘油疞，蛋白胨、質(zhì)粒抽提試劑盒阿拉伯醇脫氫酶基因引物設(shè)計(jì)的紀(jì)亞餉富蛐蛄屑襖醋訟虹木糖醇脫氫酶基因引物設(shè)計(jì)通過的菘饣竦糜隚親緣關(guān)系較近計(jì)引物疪現(xiàn)疪。根據(jù)拼接所獲得的木糖醇脫氫酶編碼基因開放性閱讀框，籵鯨，；從逑擔(dān)富撼逡錶“竘，無菌水，總體積為“渲心邐狦注和延伸時(shí)問根據(jù)情況調(diào)整。菌液，在冰上放置痬，離心甅重懸細(xì)胞沉淀?；蛴糜谥苯幼鲛D(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，或存于冰箱。培養(yǎng)基，痬培養(yǎng)坎加諍溴齲吲哚瓺半乳糖苷甤猤，和異丙基硫代吡喃半乳糖苷甌簡稱腖狝平板上，于生長，部分茵液送上海生工公司測序。和分別帶砒，和識(shí)別位點(diǎn)訥基因組為盡棟裝呱稈竦么鴓甌腅將帶有刈櫓柿捅澩鎦柿腅羧洌又鐘，。于蓋瓊脂糖凝膠電泳檢測，肛琹康幕蚰咎譴紀(jì)亞餉負(fù)蚿連接產(chǎn)物命名為構(gòu)建木糖醇脫氫酶工程菌用氯化鈣介導(dǎo)法將連接產(chǎn)物疎將菌涂布槳澹生長訤疪R锝幸鷴銹驗(yàn)證。痬條件下培養(yǎng)部分菌液送測序。將測序驗(yàn)證沒有突變的菌液保存于及進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。感受態(tài)細(xì)胞，木糖醇脫氫酶表達(dá)條件羧浣又鐘培養(yǎng)痬培養(yǎng)罯為，分別加入“罶上樣緩沖液，于沸水中煮輝俳酚將帶有腅，痬將帶有腅將帶有腅，痬條件淀兩次，再在痬的條件下離心痬的條件下離心鎳柱與榘彼岬那綴托源炕渲心咎譴紀(jì)亞餉窩端帶一個(gè)六組氨酸標(biāo)簽。疞洗雜緩沖液疞，疞，觳庠擁鞍紫闖鑾榭觶為以下，停止洗雜。渲帽曜嫉鞍字嗜芤海康吶G逖5鞍祝肙譜鞅曜記擼喝綾曜嫉鞍字嗜芤河疞配制成不同的濃度，并測定，以W葑輳曜嫉鞍綴課嶙六個(gè)點(diǎn)為疞考馬斯亮藍(lán)試劑換乖從逑檔某煞鄭獂酶活定義一個(gè)酶活力單位邐蒷或所對(duì)木糖醇脫氫酶酶活性及穩(wěn)定性的影響的生成量。其中，通過不同的緩沖液調(diào)節(jié)應(yīng)條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，測定殘余酶活。不做任何處理的酶液于最適條件下將酶液分別于、。、中保溫偃敢杭尤胱釷飾露忍跫路從金屬離子對(duì)木糖醇脫氫酶酶活性的影響結(jié)果與討論阿拉伯醇脫氫酶基因片段獲得阿拉伯醇脫氫酶的基因片段，用碇悄旱纈痙治鯬產(chǎn)物，結(jié)果如圖基因氫酶的基因片段，用碇悄旱纈痙治鯬產(chǎn)物，結(jié)果如圖所示，產(chǎn)中的紀(jì)亞餉贛隚基因組中克隆因。甲狣木酮糖的轉(zhuǎn)化效率最高。能將伎燜俚難躉蒁木酮糖。的條帶，測序及通過根據(jù)上述所獲得的序列及基因組序列設(shè)計(jì)引物疪現(xiàn)疪，以蜃槲D澹寺咎譴紀(jì)亞餉和說幕蚱危瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖所示。其中包含木糖圖中木糖醇脫氫酶撕端基因片段的電畂霾木糖醇脫氫酶說幕蚱；為引物研咖咎譴紀(jì)亞餉端的基因片段電泳圖，其中直鷂A礁鼉銹產(chǎn)物的使用鮮鏊竦玫娜魴蛄薪釁唇櫻竦靡桓的開放的開放性閱讀框的序列相似性為沒虻牡鍬己臛行分析，發(fā)現(xiàn)本課題從中所獲得的木糖醇脫氫酶基因與虻南嗨菩宰罡摺】，為圖中木糖醇脫氫酶基因的克隆注珼；瞻錐哉眨，利用引物，以覩從覶圖木糖醇脫氫酶基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)起始密碼子。膞嗨菩暈的琒利用甧痬將木糖醇脫氫酶的氨基酸序列與上述來自短鏈脫氫酶家族的脫氫酶或還原酶的氨基酸糖醇脫氫酶中也是保守的。其中完全保守的氨基酸有個(gè)。七個(gè)甘氨酸事霧刪赫勢爭嘲囊腳狪螴籌籗【鯮鶥鵄錝黟多尉一一蝗镺從闢】婭一一一一蹦鵙，埽一圖的多重比對(duì)中木糖醇脫氫酶與短鏈脫氫酶家族其他成員痳注瑇醋訥籌醋訪籄醋訥在短鏈脫氫酶家族中，有三個(gè)保守區(qū)域在催化過程中與輔酶相互作用的氮新的基因，且所編碼的木糖醇脫氫酶屬于短鏈脫氫酶家族。木糖醇脫氫酶重組菌株篩選，并將陽誘導(dǎo)，總蛋白甈慕峁繽所示。從圖中可以看出，重組木糖醇脫氫酶的條帶在白純化過程中，發(fā)現(xiàn)本課題所獲得的木糖醇脫氫酶主要位于細(xì)胞質(zhì)，是可溶性蛋入賏圖刈檳咎譴紀(jì)亞餉傅腟電泳結(jié)果赴呀庖海，的赴呀庖海，經(jīng)誘對(duì)木糖醇脫氫酶酶活性及穩(wěn)定性的影響糖醇氧化與木酮糖還原的最適分別為痬和活性顯著下降。痬氧痬酶的穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果如圖荊咎譴紀(jì)亞餉岡趐范圍理后，其酶活比未進(jìn)行處理的酶高。本文尚未對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行深入研究。但在緩沖液中的谷氨酸脫氫酶，在條件下所測得的活性高五倍，這種現(xiàn)象被稱為激活鈍化平衡現(xiàn)象。研究人員對(duì)于這種現(xiàn)象的解釋是谷氨酸脫氫酶在響酶活發(fā)生激活鈍化平衡現(xiàn)象。唬對(duì)木糖對(duì)木糖醇脫氫酶穩(wěn)定性的影響還原活性痬圖露榷閱咎譴紀(jì)亞餉富钚緣撓跋乖睢生痬木糖醇脫氫酶的溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如圖荊咎譴紀(jì)亞餉岡保溫螅洳杏嗟幕乖盍源锏階罡呋盍均，殘余的氧化活力達(dá)。說明該酶的還原活性具有良好的溫度穩(wěn)定性。乖钚痬金屬離子對(duì)木糖醇脫氫酶酶活性的影響底物專一性及酶學(xué)參數(shù)測定和分別為能將話伎燜俚難躉蒁木酮糖。被嶁蛄邢嗨菩暈】，而來自的，所編碼。最高活性為獲得的紀(jì)亞餉肝狽依賴型脫由于缺乏糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)途徑及的代謝特點(diǎn)導(dǎo)致產(chǎn)生的很有限，從而導(dǎo)致該路徑中的兩步反應(yīng)在速率及產(chǎn)率的差異，也是木糖醇產(chǎn)率低的原因之一。猘，珻猘【縃琖，川，【甋【縃琒琒，【緾甌，猟緾，縍琓，緾，甅琀琇，琓，琖，【】琍琄，【】，?！尽?，篋】【】，琄，結(jié)論痬，就L親蝕，其發(fā)酵條件為疞，酵母抽提物疞，裝液量，接種量，發(fā)酵時(shí)賋五、克隆自木糖醇脫氫酶與已報(bào)道的序列相似性僅為。是一個(gè)新的木糖醇脫氫酶基因。酶學(xué)性質(zhì)研究