第01章基因操作原理的理論基礎(chǔ)

1、第一章 基因操作原理的理論基礎(chǔ)第一節(jié) 基因操作原理1第二節(jié) 基因的結(jié)構(gòu)理論基礎(chǔ)2第一節(jié) 基因操作原理 基因操作（Gene Manipulation）的核心部分為分子克?。╩olecular cloning）。由于政府對基因操作有一定的法律約束，大多數(shù)國家對此都有一個(gè)精確的法律定義。比如在英國將基因操作定義為將在細(xì)胞外產(chǎn)生的核酸（物質(zhì)）分子插入到病毒、質(zhì)?；蚱渌d體系統(tǒng)中，再整合到那些本來不含該類物質(zhì)的宿主中，從而形成一種新的可連續(xù)繁殖的有機(jī)體。（引自 Principles of Gene Manipulation ，Black well Scientific Publications , RW

2、. OLD & SB Primrose , 1985）。強(qiáng)調(diào)外源核酸分子（一般情況下都是 DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然種的界限，將來自不相關(guān)物種的基因放入一個(gè)宿主中是基因操作的重要特征。另一個(gè)特征是繁殖。這里所說的基因操作并不是一個(gè)法律概念，除了包括基因克隆外，還包括基因的表達(dá)、調(diào)控、檢測和改造等與基因研究相關(guān)的內(nèi)容。本課程就是為了講述在核酸水平上對基因進(jìn)行研究所涉及的方法、技術(shù)和策略的原理，主要是基本的、通用的原理，對于涉及到具體的學(xué)科或領(lǐng)域的原理不在此范圍內(nèi)?；虿僮髟碓谏飳W(xué)科發(fā)展中具有重要地位。這門課以前叫“分子克隆”，“分子克隆”為實(shí)驗(yàn)課。但無論叫什么，本門課程到底要講些什

3、么，它的地位如何？20 世紀(jì)是生物學(xué)發(fā)展最為迅速的時(shí)期， 1953 年由于認(rèn)識了 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而揭開了分子生物學(xué)研究的熱潮。在整個(gè)生物學(xué)研究進(jìn)程或研究層次來說，其發(fā)展過程涉及到個(gè)體、組織器官、細(xì)胞、亞細(xì)胞水平，同時(shí)由于遺傳學(xué)的興起與發(fā)展， DNA 作為生命遺傳信息的物質(zhì)基礎(chǔ)被確定下來，從而導(dǎo)致分子生物學(xué)的誕生。分子生物學(xué)嚴(yán)格來說應(yīng)是從分子水平或核酸水平上進(jìn)行研究的生物學(xué)，研究生物的生物學(xué)現(xiàn)象和本質(zhì)，如DNA的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、表達(dá)、調(diào)控、遺傳、變異等。由于分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，生物學(xué)的各個(gè)分枝學(xué)科都延伸到了分子水平，在這種情況下，傳統(tǒng)分子生物學(xué)就是一個(gè)包羅萬象的學(xué)科，大的可以說動(dòng)、植、

4、微生物的分子生物學(xué)，小的可以說某些物種的分子生物學(xué)，如水稻的分子生物學(xué)、鏈霉菌的分子生物學(xué)、芽胞桿菌的分子生物學(xué)。在這種情況下，傳統(tǒng)的分子生物學(xué)就好象是高級生物化學(xué)，闡述基因或者說 DNA（核酸）的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)化學(xué)本質(zhì)。目前的分子生物學(xué)，朝著發(fā)育、結(jié)構(gòu)和遺傳生物學(xué)的方向發(fā)展。如果說傳統(tǒng)的分子生物學(xué)是靜態(tài)分子生物學(xué)的話，那么這些學(xué)科可以說是動(dòng)態(tài)分子生物學(xué)，即在分子水平（核酸）上，研究生物的生長、分化、死亡以及遺傳和變異的內(nèi)在規(guī)律。在以上這些研究中，均涉及在 DNA 水平的操作，本門課程就是要講述這相關(guān)的原理，為分子生物學(xué)的研究服務(wù)。通過分子生物學(xué)內(nèi)在的原理，如 DNA 結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、調(diào)控

5、等，講述研究方法和技術(shù)的設(shè)計(jì)原理。第二節(jié) 基因的結(jié)構(gòu)理論基礎(chǔ)1基因及其產(chǎn)物的共線性 基因決定蛋白質(zhì)的序列組成，是由密碼子對應(yīng)特定氨基酸所決定的。當(dāng)一個(gè)基因的核苷酸序列與其產(chǎn)物的氨基酸序列是一一對應(yīng)時(shí)，則表明它們是共線性的。例如，由 N 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其基因由對應(yīng)的基因編碼區(qū)的 3N 個(gè)堿基組成。在原核生物中，基因與其產(chǎn)物是共線性的。這在基因克隆中有重要意義。2基因及其產(chǎn)物的非共線性70 年代以來，在真核生物中發(fā)現(xiàn)了間斷基因（interrupted genes），后來發(fā)現(xiàn)這種間斷基因在真核生物中普遍存在，也就是后來所說的基因間存在著內(nèi)含子（intron）。 內(nèi)含子指真核生物基因中不能翻譯

6、成蛋白質(zhì)的 DNA 片段，但可被轉(zhuǎn)錄，當(dāng)兩側(cè)序列（外顯子）的轉(zhuǎn)錄 RNA 被剪接在一起時(shí)，就將內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的 RNA 從整個(gè)轉(zhuǎn)錄物中除去。外顯子是指能夠翻譯成蛋白質(zhì)的任一間斷的基因片段，一個(gè)基因可有多個(gè)外顯子。內(nèi)含子并不是一成不變的，具有相對性，對一個(gè) DNA 片段來說，在某個(gè)基因中是內(nèi)含子，但在另一個(gè)基因中卻可作為外顯子。圖 1-1 是從 DNA 到蛋白質(zhì)的流程。實(shí)際上內(nèi)含子與外顯子的概念是相對而言的。有些內(nèi)含子可作為其它基因的外顯子，它們是彼此不相關(guān)的基因，如 Yeast 線粒體中的某些基因。另外基因本身有可變換的表達(dá)途徑，在一條途徑中作為內(nèi)含子的片段，在另一途徑中可作為外顯子。這兩條途徑產(chǎn)

7、生兩種蛋白質(zhì)，它們的末端是相同的，但其中之一在中央部分有額外的序列，因而這一 DNA 區(qū)段可以為一種以上的蛋白質(zhì)編碼。 DNAexon1 intron 1 exon 2 intron 2 exon 3 intron 3 exon 4轉(zhuǎn)錄Pro-mRNA exon1 intron 1 exon 2 intron 2 exon 3 intron 3 exon 4mRNA 翻譯蛋白質(zhì) 圖1-1：真核生物中蛋白質(zhì)合成過程中外顯子和內(nèi)含子的關(guān)系3基因的重疊與可變性 DNA 序列在代表蛋白質(zhì)方面的功能不是單一的，單個(gè) DNA 序列可編碼一個(gè)以上的蛋白質(zhì)，這些蛋白在結(jié)構(gòu)上有的是相同的序列重復(fù)，也可以是全新的

8、蛋白質(zhì)。由單個(gè)基因通過在不同部位的起始（或終止）表達(dá)而形成兩種蛋白質(zhì)，兩個(gè)基因也可通過在不同讀碼中譯讀 DNA 而共用同一序列?；虻闹丿B與可變性也可從重組中得以體現(xiàn)。例如芽胞桿菌的 spo 基因片段分布在兩個(gè)不同區(qū)域，當(dāng)需要發(fā)揮作用時(shí)，便通過重組而連接在一起。另外，抗體基因的重組變換以及表面蛋白的產(chǎn)生也同樣都表明基因的可重疊性與可變性。 4啟動(dòng)子 啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄過程中控制起始的部位，通常一個(gè)基因是否表達(dá)，轉(zhuǎn)錄起始是關(guān)鍵的一步，是起決定性的。對大多數(shù)基因來說，只要轉(zhuǎn)錄起始了，表達(dá)一般是可進(jìn)行的。啟動(dòng)子又是 RNA 聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，不同生物中這個(gè)結(jié)合（識別）位點(diǎn)是有差異的，同一生物的不同基因之間也有差異。 轉(zhuǎn)錄終止子主要有兩種，一種依賴 因子，另一種不依賴 因子。后者主要是能夠形成特定二級結(jié)構(gòu)的 DNA 序列，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)。 5基因克隆的通用策略克隆的概念是廣泛的，但基因克隆在一定程度上被等同于基因的分離。本講義主要采用這一狹義的概念。假如從一個(gè)原核生物中克隆某基因（1-2kb），它的基本步驟是先用限制性內(nèi)切酶切割外源 DNA 和載體（質(zhì)粒 DNA 載體或噬菌體載體），然后連接，轉(zhuǎn)化，構(gòu)建出基因文庫，再篩選?？寺〉暮喴襟E見