蛋白質(zhì)純化試題整理

1、名詞解釋1. 截留分子量(molecular weight cut-off, MWCO)：不能通過膜的最小分子量2. 超濾：選擇合適孔徑的超濾膜，在離心力或較高壓力下，使水分子和其他小分子物質(zhì)通過超濾膜，而目標(biāo)蛋白樣品分子被截留不能通過超濾膜，從而增加蛋白樣品濃度，達(dá)到濃縮效果的方法3、陶南效應(yīng)：離子交換劑表面pH與溶液pH是不一致的。在陽IE表面的微環(huán)境中，H被吸引而OH被排斥，交換劑表面pH比周圍低1個pH單位；而陰IE表面的微環(huán)境中，H被排斥，交換劑表面pH比周圍高1個pH單位4、離子交換劑的有效（實際）交換容量：指在一定的實驗條件下，每克干介質(zhì)或每毫升濕膠吸附蛋白質(zhì)的實際容量5. 聚沉

2、（coagulation）是指在聚沉劑的作用下，溶液中的蛋白質(zhì)相互聚集為較大在聚沉物（1mm）的過程 常見的聚沉劑：無機(jī)鹽類（如氯化鋅、氯化鐵、氯化鋁、硫酸鋅、硫酸鋁），聚合無機(jī)鹽（聚合鋁、聚合鐵等） 聚沉條件：-20以下，pH36，較高離子強(qiáng)度，高多價金屬離子（Fe3+、Al3+）6. 絮凝（flocculation）是指在絮凝劑的作用下，通過吸附、交聯(lián)、網(wǎng)捕，把蛋白質(zhì)聚結(jié)為大絮體沉降的過程 常見的絮凝劑：淀粉、樹脂、單寧、離子交換樹脂及纖維素衍生物 絮凝作用一般在聚沉作用之后使用；絮凝劑的選擇應(yīng)根據(jù)成本、毒性等具體情況考慮；應(yīng)通過試驗篩選獲得最適合的絮凝劑類型、用量及作用條件7、鹽溶：蛋白

3、質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨著鹽濃度的增高而上升8、鹽析：但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時，其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出 9、透析：利用小分子能通過，而大分子不能透過半透膜的原理，把不同性質(zhì)的物質(zhì)彼此分開的一種方法。對于蛋白質(zhì)樣品，透析過程中因蛋白質(zhì)分子體積很大，不能透過半透膜，而溶液中的無機(jī)鹽小分子則能透過半透膜進(jìn)入水中，因此不斷更換透析用水即可將蛋白質(zhì)與無機(jī)鹽小分子物質(zhì)完全分開。蛋白的分離純化過程中常用此法脫去無機(jī)鹽（如硫酸銨） 10、排阻極限：指不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部網(wǎng)孔的最小蛋白的分子量 11、凝膠顆粒的分級范圍：指能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部網(wǎng)孔的最大分子和最小分子的分子量范圍 12、過濾：利用多

4、孔介質(zhì)（濾紙、濾膜等）阻截大的顆粒物質(zhì)，而使小于孔隙的物質(zhì)通過的一種的分離方法。主要用于懸浮液的分離，最簡單、最常用13、離子交換劑的電荷密度：指IE介質(zhì)顆粒單位表面積的功能基團(tuán)數(shù)量，它決定著離子交換劑的總交換容量14、離子交換劑膨脹度（吸水值）：指干態(tài)的離子交換劑在水溶液中吸水后造成的體積膨脹程度。用每克干離子交換劑吸水膨脹后的體積表示（ml/g）15、梯度洗脫：進(jìn)行梯度洗脫時，洗脫緩沖液的pH或離子強(qiáng)度是連續(xù)發(fā)生變化的，洗脫劑的洗脫能力也是連續(xù)增加的16、階段洗脫：指在一個時間段內(nèi)用一固定pH或I的條件進(jìn)行洗脫，而在下一個時間段內(nèi)用另一固定pH或I的條件進(jìn)行洗脫的分段式洗脫方式也分為pH階

5、段洗脫和I階段洗脫17、親和層析：利用蛋白質(zhì)與其專一性配體之間的特異性生物學(xué)親和力作用，對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化的層析技術(shù)。18、等電聚焦電泳：利用不同蛋白質(zhì)的等電點的不同而使其在pH梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)。等電聚焦過程中，蛋白質(zhì)分子在一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳，結(jié)果導(dǎo)致每種蛋白質(zhì)分子遷移到等于其pI的pH處（此時蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零），最終聚集形成一個很窄的蛋白區(qū)帶。19、雙向電泳（2-dimension Electrophoresis，2-DE）是樣品經(jīng)第一向電泳后，再在垂直方向上進(jìn)行第二向其他類型電泳的電泳方式。目前的雙向電泳一般是：第一向為等電聚焦（IEF），第二向為SDS

6、-PAGE20、蛋白質(zhì)印跡（Western Blotting）是指把從電泳或?qū)游龇蛛x得到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定介質(zhì)上后，再利用特異性“探針”（抗體）檢測固定介質(zhì)上的特定蛋白質(zhì)的方法。它能更有效地分析電泳結(jié)果21、免疫電泳（immune electrophoresis）是基于以及抗原與抗體的特異性免疫沉淀反應(yīng)而應(yīng)用的一項電泳技術(shù)22、毛細(xì)管電泳（CE）：是以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力的一類新型液相分離技術(shù)簡答1. 超濾法濃縮蛋白樣品的基本原理？優(yōu)點？局限性？基本原理：選擇合適孔徑的超濾膜，在離心力或較高壓力下，使水分子和其他小分子物質(zhì)通過超濾膜，而目標(biāo)蛋白樣品分子被截留不能通過超濾膜，

7、從而增加蛋白樣品濃度，達(dá)到濃縮效果的方法優(yōu)點：超濾濃縮技術(shù)的優(yōu)點是操作簡便，不需添加任何化學(xué)試劑，實驗條件溫和，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止蛋白質(zhì)分子的變性、失活。在蛋白質(zhì)分子的制備技術(shù)中，超濾除用于濃縮外，還可用于蛋白樣品的脫鹽和脫水局限性：不能直接得到蛋白干粉制劑。對于蛋白質(zhì)溶液，一般最終只能濃縮到1050的濃度2. 判斷已知等電點的蛋白質(zhì)，在不同PH值溶液中的帶電性3. 手動加樣法的具體操作填裝好的凝膠柱經(jīng)平衡后，用膠頭滴管吸取柱床上層部分多余洗脫液，待洗脫液下降至近床表面2-3mm時，關(guān)閉柱出口（注意不能使洗脫液全部流干）；用膠頭滴管吸取一定體積的樣品液后，貼柱內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)緩緩

8、加入，以防加樣過快導(dǎo)致凝膠床面表面受損；加樣完畢后，打開柱出口，讓樣品液緩慢滲入凝膠床內(nèi)；當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面持平時，貼內(nèi)壁小心加入幾毫升洗脫液沖洗內(nèi)部，并使洗脫液高出凝膠床表面2-3cm，即可進(jìn)行恒流洗脫。4. 手動裝柱，如何檢測裝柱質(zhì)量a、對光檢查。對光肉眼觀察裝填平衡好的凝膠柱，柱內(nèi)凝膠應(yīng)均勻、無紋路、無氣泡b、可通過加樣易于觀測的有色物質(zhì)進(jìn)行洗脫（如藍(lán)色葡聚糖-2000、血紅蛋白等），來觀察洗脫過程中中色帶下降均勻與否，判斷裝柱質(zhì)量。如果色帶歪曲彌散，則需重新裝柱。5、離子交換劑按功能基團(tuán)類型不同可分為？強(qiáng)陽離子交換劑（強(qiáng)酸型） 弱陽離子交換劑（弱酸型） 強(qiáng)陰離子交換劑（強(qiáng)堿型）

9、弱陰離子交換劑（弱堿型）6、疏水作用層析分離蛋白質(zhì)混合物的基本原理？疏水作用層析（HIC）是利用不同蛋白質(zhì)分子表面疏水性的差別，來分離蛋白質(zhì)混合物的一種層析技術(shù) 蛋白質(zhì)分子表面常常暴露著一些疏水性基團(tuán)，這些疏水性基團(tuán)可以與疏水層析的固定相發(fā)生疏水性相互作用（疏水作用力）而結(jié)合7、共價層析分離含半胱氨酸的蛋白或多態(tài)混合物的基本原理？共價層析是利用固定相與目標(biāo)蛋白分子之間共價鍵的先形成、后斷裂過程來實現(xiàn)目標(biāo)蛋白從混合樣品中分離的層析方法。 要求在溫和的條件下，既能與固定相形成穩(wěn)定的共價鍵，又能在釋放蛋白時不破壞蛋白的活性，蛋白質(zhì)分子中通常只有巰基基團(tuán)能滿足這一要求 因此，共價層析主要用于分離和純化

10、含巰基（即含半胱氨酸）的蛋白質(zhì)或多肽8、離子交換層析分離效果用分辨率（RS）來描述，分辨率的定義？決定因素？RS定義為兩個洗脫峰峰頂對應(yīng)的洗脫體積（VR或Ve）之差比上兩峰在基線上峰寬之和的平均值。一個IEC系統(tǒng)能夠達(dá)到的RS取決于該系統(tǒng)的三個層析參數(shù)：容量因子、柱效率和選擇性。k容量因子（保留因子） N柱效率（即理論塔板數(shù)） a選擇性9、凝膠過濾層析特點？用途？特點：（1） 介質(zhì)不帶電荷，不溶于水，親水性好，具化學(xué)惰性，不與被分離蛋白發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，分離條件溫和，不會使蛋白變性失活（2） 分離效率高，回收率較高（3） 廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)混合物的分離純化，脫鹽等（4） 一般采用細(xì)長柱（5） 經(jīng)過凝

11、膠過濾層析分離后樣品將被稀釋，因此上樣前需對樣品進(jìn)行濃縮用途：（1） 蛋白質(zhì)樣品的脫鹽及緩沖液更換蛋白質(zhì)與鹽的分子量差異較大，選用交聯(lián)度高的介質(zhì)（如Sephadex G-25），使蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部網(wǎng)孔，先流出層析柱，而鹽分子能進(jìn)入，后流出層析柱層析過程的洗脫中可使用需更換的緩沖液，從而在脫鹽的同時達(dá)到將樣品的緩沖液也進(jìn)行更換的目的（2） 蛋白質(zhì)的分級分離應(yīng)用不同蛋白分子量的差異進(jìn)行分離，凝膠介質(zhì)和蛋白質(zhì)之間不發(fā)生任何作用，所以層析過程能不改變蛋白的生物學(xué)活性。凝膠過濾層析通常用在離子交換層析或親和層析之后，用以進(jìn)一步分離純化目的蛋白（3） 蛋白質(zhì)分子量的測定10、描述聚丙烯酰胺的電泳

12、（PAGE）中考馬斯亮藍(lán)染色法以及銀染法原理？考馬斯亮藍(lán)染色法原理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭R-250結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物（595nm處最大吸收峰），藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系銀染法原理：銀染時蛋白條帶上的AgNO3被還原成金屬Ag，沉積在蛋白條帶上而顯色顯色方法分為化學(xué)顯色和光顯色11、常規(guī)PAGE和SDS-PAGE使用試劑最主要的差別是？后者加入去垢劑SDS烷基硫酸鈉和強(qiáng)還原劑-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）12、SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)混合物的原理？去垢劑SDS十二烷基硫酸鈉， CH3(CH2)11OSO3Na，破壞蛋白質(zhì)分子的氫鍵和疏水鍵，并與之結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合

13、物；強(qiáng)還原劑-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT），破壞蛋白分子二硫鍵結(jié)果導(dǎo)致：SDS-蛋白復(fù)合物帶上大量負(fù)電荷，且不同蛋白質(zhì)有著相同的荷質(zhì)比（SDS與多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4g SDS/1g 蛋白質(zhì)）蛋白分子變成橢圓棒狀，不同的蛋白分子無形狀差別，棒的長度與其分子量成正比因此，對于SDS-PAGE，蛋白質(zhì)的遷移率僅與分子量有關(guān)。電泳過程中蛋白質(zhì)天然構(gòu)象被破壞，生物學(xué)活性喪失問答題1、蛋白質(zhì)的沉淀法：優(yōu)點？局限性？常用的沉淀法有哪幾種？優(yōu)點：所需設(shè)備簡單，操作方便，在蛋白質(zhì)純化的初期，可以加速減少樣品體積，起到濃縮的作用，便于后續(xù)的純化降低純化成本；還可以盡快將目的蛋白與雜質(zhì)分開提高目的蛋白的穩(wěn)定

14、性；通過該方法，目的蛋白的回收率提高局限性：由于沉淀法對提高蛋白質(zhì)純度的幅度比較有限，該法常只用于蛋白質(zhì)的初步純化常用方法：有機(jī)溶劑沉淀法、等電點沉淀法、結(jié)晶 等電點 聚乙二醇沉淀法選擇沉淀方法時，需要考慮沉淀劑對目的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，沉淀劑的成本及操作的難易程度、沉淀劑的去除及殘留、目的蛋白的純度要求及收率。2、蛋白質(zhì)樣品的濃縮方法？基本原理分別是？ 沉淀：蛋白質(zhì)在水中的溶解度受蛋白質(zhì)分子表面疏水性和親水性帶電基團(tuán)分布的影響，這些基團(tuán)與水溶液的離子相互作用，通過改變pH和離子強(qiáng)度，加入有機(jī)溶劑或多聚物，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分子聚集，形成蛋白質(zhì)沉淀，通過離心或過濾可以獲得沉淀物，然后利用合

15、適的緩沖液清洗，溶解沉淀物，在經(jīng)過透析或凝膠過濾，除去殘留溶劑成分 吸附：吸收水和小分子，當(dāng)凝膠完全膨脹后，用過濾或離心方法除去凝膠，分離出蛋白質(zhì)樣品，適用于穩(wěn)定性較差的蛋白質(zhì)。 超過濾：在離心力和較高壓力下，選擇適應(yīng)孔徑的半透膜，從而使水和其他小分子透過半透膜，而所需的蛋白質(zhì)不能透過膜。 雙水相分離法：利用兩種多聚物或多聚物與鹽在水中的不相容性，可以從細(xì)胞破碎后的細(xì)胞碎片中直接分離純化蛋白質(zhì)，同時起到濃縮作用。 透析：把盛抽提液的透析袋（由半透膜制成）埋在吸水力強(qiáng)的聚乙二醇或甘油中，袋內(nèi)的水分等小分子物質(zhì)可透過半透膜逐漸移至袋外，有效成分則留在袋內(nèi)。 冷凍干燥：在真空狀態(tài)下，置于凍干機(jī)的冰凍

16、抽提液可以由固體直接變?yōu)闅怏w。用此原理進(jìn)行濃縮，有效成分幾乎不被破壞。3、良好的凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足？要求；常用介質(zhì)？（英文名）良好的凝膠過濾層析介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：凝膠顆粒內(nèi)部具有三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)：能使不同分子量的蛋白質(zhì)得以分離親水性高，具有表面惰性：即介質(zhì)與蛋白質(zhì)之間不發(fā)生化學(xué)或物理相互作用穩(wěn)定性強(qiáng)：在較寬的pH和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長機(jī)械強(qiáng)度較高：允許較高的操作壓力（流速）（1）葡聚糖凝膠Sephadex G-數(shù)字（數(shù)字越小，表示介質(zhì)交聯(lián)度越大，分級范圍越?。?）瓊脂糖凝膠Sepharose（2B, 4B, 6B）Sepharose CL（2B, 4B, 6B）Sup

17、erose（6, 12）（數(shù)字表示瓊脂糖含量，數(shù)字越大，瓊脂糖含量越大，分級范圍越?。?）復(fù)合結(jié)構(gòu)凝膠Sephacryl HR（S-數(shù)字 HR）Superdex（peptide, 30, 75, 200）（數(shù)字越小，表示介質(zhì)交聯(lián)度越大，分級范圍越?。?、影響蛋白質(zhì)電泳速度的內(nèi)在因素、外在因素有？常用的電泳技術(shù)？常規(guī)PAGE有哪三大分離效應(yīng)？內(nèi)在因素：蛋白質(zhì)分子所帶電荷的電性和電量：電性決定電泳方向；電量越大，遷移速度越快。蛋白質(zhì)分子的大小和形狀：分子質(zhì)量越小、形狀越接近球形，在電場中遷移速度越快外在因素：溶液pH（決定蛋白質(zhì)所帶電荷的電性和電量）、溶液的離子強(qiáng)度（越低，遷移越快；一般應(yīng)在0.

18、010.2 mol/L之間）、電場強(qiáng)度、電滲現(xiàn)象、電泳支持介質(zhì)、溫度常用電泳技術(shù) 常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳 （常規(guī)PAGE）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE） 等電聚焦 （isoelectrofocusing，IEF） 雙向電泳 （2-D electrophoresis，2-DE） 轉(zhuǎn)移電泳 （westerning blotting，Wb） 免疫電泳 （immunoelectrophoresis，IE） 毛細(xì)管電泳 （capillary electrophoresis，CE）常規(guī)PAGE的三大分離效應(yīng) 濃縮效應(yīng)：蛋白質(zhì)樣品在濃縮膠中被高度濃縮，最終集聚成一條狹窄的高濃度蛋白

19、質(zhì)區(qū) 電荷效應(yīng)：不同蛋白質(zhì)所帶電荷的數(shù)量不同，因此遷移率不相同 分子篩效應(yīng)：凝膠對不同分子量的蛋白分子具有的篩分效應(yīng)。分子質(zhì)量越小，遷移率越大5、雙向電泳定義？相對其他電泳的優(yōu)勢？用途？雙向電泳（2-dimension Electrophoresis，2-DE）是樣品經(jīng)第一向電泳后，再在垂直方向上進(jìn)行第二向其他類型電泳的電泳方式。目前的雙向電泳一般是：第一向為等電聚焦（IEF），第二向為SDS-PAGE優(yōu)勢：2-DE使得分離分辨率大大提高，獲得的信息也明顯增多，是目前電泳技術(shù)中分辨率最高、信息獲得最多的技術(shù)，常用于分析復(fù)雜樣品及繪制蛋白質(zhì)組圖譜，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)用途：利用雙向電泳技術(shù)

20、不僅能了解樣品中各蛋白的等電點、分子量、豐度等信息，更重要的是還可利用比較雙向電泳的方法用于了解樣品中各蛋白的動態(tài)變化情況。進(jìn)一步，還可利用質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索對感興趣的蛋白點進(jìn)行種類鑒定，因此目前是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的核心技術(shù)6、離子交換層析，如何根據(jù)目標(biāo)蛋白與雜蛋白的pI確定起始條件？離子交換層析分離蛋白質(zhì)的大致過程？起始條件：(1) 起始pH 依據(jù)：目標(biāo)蛋白的pI及其穩(wěn)定的pH范圍已了解目標(biāo)蛋白和主要雜蛋白的pI舉例：目標(biāo)蛋白pI=7.0，雜蛋白pI=8.2；那么，起始pH=8.08.5比較合適，由此確定選擇陰離子交換劑只了解目標(biāo)蛋白的pI和pH穩(wěn)定性范圍舉例：目標(biāo)蛋白pI=4.0，在p

21、H=3.68.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，那么應(yīng)當(dāng)選擇起始pH=5.06.0，故應(yīng)選擇陰離子交換劑；舉例：目標(biāo)蛋白pI=8.0，在pH=5.58.5范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，那么應(yīng)當(dāng)選擇起始pH=6.07.0，故應(yīng)選擇陽離子交換劑對目標(biāo)蛋白和主要雜蛋白的pI、pH穩(wěn)定性范圍一無所知鑒于大多數(shù)天然的蛋白質(zhì)pI7，可以優(yōu)先考慮選用陰離子交換劑，起始pH可通過試管小樣法確定(2) 緩沖物質(zhì)的選擇進(jìn)行陽IEC時，應(yīng)選用緩沖離子為陰離子的緩沖物質(zhì)；進(jìn)行陰IEC時，應(yīng)選用緩沖離子為陽離子的緩沖物質(zhì)如果已確定起始pH，應(yīng)根據(jù)緩沖物質(zhì)的pKa值，選用pKa與起始pH很接近的物質(zhì)作為緩沖成分。例如：確定起始pH為8.0，則應(yīng)選擇T

22、ris堿作為緩沖物質(zhì)（pKa8.06）(3) 起始緩沖液濃度(離子強(qiáng)度)的選擇 為保證目的蛋白能吸附于IE，起始緩沖液的離子濃度一般比較低，多介于0.010.05mol/L；洗脫緩沖液的離子濃度應(yīng)逐漸升高；實際操作中往往通過向起始緩沖液中添加中性鹽提高鹽濃度（添加NaCl、乙酸銨） 的方法制備獲得大致過程：平衡階段：此時離子交換劑與平衡離子結(jié)合上樣、吸附階段：混合蛋白質(zhì)分子與離子交換劑發(fā)生吸附結(jié)合開始解吸階段：由于雜蛋白與離子交換劑之間結(jié)合較弱而先被洗脫，目標(biāo)蛋白仍處于吸附狀態(tài)完全解吸階段：目標(biāo)蛋白被洗脫再生階段：用起始緩沖液重新平衡層析柱，以方便下次使用7、舉例5種離子交換劑？各自的特點？（1）離子交換樹脂 樹脂是通過化學(xué)方法合成的具有特殊網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶性高分子化合物。通過化學(xué)方法往樹脂骨架上引入功能基團(tuán)就得到離子交換樹脂。常見的有：聚苯乙烯樹脂、聚異丁烯酸樹脂、聚丙烯酸樹脂等缺點：骨架疏水、介質(zhì)孔徑太小、電荷密度太大，通常不用于蛋白質(zhì)的層析分離（2）離子交換纖維素纖維素分子是由葡萄糖通過(14)糖苷鍵連接形成的大分子。離子交換纖維素是以纖維素凝膠為介質(zhì)，連接功能基團(tuán)形成離子交換纖維素存在著纖維狀和微粒狀兩種不同的物理形態(tài)，前者是將纖維素直接連接功能基團(tuán)，后者是除去了大部分非晶型區(qū)域