絲裂原活化蛋白激酶

1、絲裂原活化蛋白激酶 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK) Ser/Thr蛋白激酶 受細胞外刺激而激活 在所有真核細胞中高度保守 通路組成 三級激酶模式 調(diào)節(jié)多種重要的細胞生理/病理過程,本章主要內(nèi)容： MAPK 信號通路的成員 MAPK的蛋白結(jié)構(gòu) MAPK通路模式 MAPK的激活 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的關(guān)系,一、MAPK 信號通路的成員 MAPK是信號從細胞表面核內(nèi)的重要轉(zhuǎn)遞者。 已鑒定的 (據(jù)1999的統(tǒng)計)： MAPK激酶激酶 (MKKK) 14種 MAPK激酶 (MKK) 7種 MAPK 12種,MKKK(MA

2、P Kinase Kinase Kinase) 亞族,MKK (MAP Kinase Kinase)亞族,MAPK (MAP Kinase)亞族,二、MAPK的蛋白結(jié)構(gòu) （一）MAPK的一級結(jié)構(gòu) 蘇氨酸磷酸化位點與其他蛋白激酶同源，酪氨酸磷酸化位點是MAPK獨特的。 磷酸化位點的三肽模體 TXY ERK和ERK5 TEY p38 TGY JNK TPY,三肽模體位于L12 各亞族L12長度不同 活化唇 (activation lip) 各亞族都具有12個保守亞區(qū) 真核細胞蛋白激酶超家族區(qū)分標(biāo)志之一 家族成員之間具有較高的同源性,哺乳動物MAPK,哺乳動物MAPK,二）MAPK的二級結(jié)構(gòu)和超二級

3、結(jié)構(gòu) 以ERK2為例 N端域 主要由折疊和2個螺旋組成 （1109和320358位氨基酸殘基） C端域 螺旋，含磷酸化唇和MAPK插 入，催化環(huán)（Arg-147152) （110319位氨基酸殘基） 交界處的裂隙 ATP結(jié)合位點,三）MAPK的空間結(jié)構(gòu)特征 大體結(jié)構(gòu)：非常相似 底物結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)特征： 無活性時被阻斷，有活性時暴露出。 ATP結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)特征： 大小、形狀、疏水性和電荷等不同 磷酸基團結(jié)合位點： 4個保守位點,三、MAPK通路模式,四、MAPK的激活 MAPK激活機制的發(fā)現(xiàn) 重要的實驗觀察： 20世紀(jì)80年代，觀察到當(dāng)GF刺激時，Tyr被磷酸化的主要蛋白為42kDa 佛波酯醇

4、刺激時，產(chǎn)生同樣的蛋白 胰島素RTK催化Ser/Thr蛋白激酶 胰島素刺激，產(chǎn)生Thr和Tyr雙磷酸化的42kDa蛋白,MAPK的激活機制 活性部位位于兩個折疊域的界面 是通過Thr和Tyr的雙位點同時磷酸化而被激活 例：ERK2 Tyr-185 , Thr-183 pY185 解除L12對底物結(jié)合的阻斷 MAPK是Pro指導(dǎo)的蛋白激酶,對于ERK2來說，其底物的一般保守性序列為 Pro-X-Ser/Thr-Pro 活化環(huán)中Tyr-185 和Thr-183的磷酸化， 引起該環(huán)重新折疊，與Arg結(jié)合位點相互作用 酸性氨基酸替代，不導(dǎo)致組成性活化 MAPK的點突變不影響其活性,五、酵母MAPK通路

5、 釀酒酵母 已鑒定出5條 單倍體的交配途徑 浸潤性生長通路 細胞壁重構(gòu)通路 雙組分滲透壓感受器通路 Sho1滲透壓感受器通路,一）酵母菌中MAPK模式的組成和作用 釀酒酵母：4種MKKK 4種MKK 6種MAPK 其中，4種參加明確的5種MAPK通路 2種 (SMK1, YKL161C)參加未知的MAPK通路 3個成員通過與支架蛋白結(jié)合而聯(lián)在一起,二）單倍體酵母與交配有關(guān)的通路 釀酒酵母的2種交配型(單倍體)： a細胞型和 細胞型 2種性信息素：a因子和 因子 7次跨膜受體：Ste3和 Ste2 異三聚體G蛋白： Gpa1 亞基 Ste4 亞基 Ste18 亞基,Ste2 receptor,釀

6、酒酵母的交配通路,ste： 不育基因 Ste5： 支架蛋白 Ste12： 轉(zhuǎn)錄因子,支架蛋白 ( Scaffold protein) 其主要功能是將其他蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，促進它們相互作用。 將細胞信號通路中的各種信號分子結(jié)合在一起，形成復(fù)合物 起生理性隔室化的效應(yīng),從而防止該通路與其他通路發(fā)生交聯(lián) 含有許多蛋白結(jié)合域,三）浸潤通路 缺乏氮源 形態(tài)改變 假菌絲： 缺乏氮源時，橢圓型的雙倍酵母進行不對稱的細胞分裂以產(chǎn)生一個細而長的子細胞，后者又不斷產(chǎn)生長的子細胞。由于母細胞與子細胞仍然相連，因此這種單級分裂方式的不斷重復(fù)將產(chǎn)生由延長的細胞組成的絲狀物,KSS1： 絲狀生長所需要 (單倍體，雙倍體)

7、 注： 未被Ste7激活時，是浸潤生長的抑制物，被Ste7激活時，刺激浸潤生長,FUS3和KSS1的鑒別： 刺激激活的條件不同 FUS3 信息素 KSS1 缺乏氮源 表達不同 FUS3 單倍體細胞中 KSS1 單倍體細胞和雙倍體細胞中 對浸潤生長的調(diào)節(jié)作用 FUS3 抑制 KSS1 刺激,四）細胞壁重構(gòu)通路,酵母的生長依賴于有效的細胞壁重構(gòu) PKC1：MKKKK MKK1和MKK2的重疊作用意義不清,五）滲透壓感受器和應(yīng)激通路 釀酒酵母的2種滲透壓感受器： “雙組分”滲透壓感受器 低滲透壓條件下激活 膜滲透壓感受器 高滲透壓條件下激活 2種滲透壓感受器對MAPK通路的調(diào)節(jié) 作用不同,1. “雙

8、組分”滲透壓感受器 “雙組分”轉(zhuǎn)導(dǎo)體系通常見于原核細胞 “雙組分”轉(zhuǎn)導(dǎo)體系的組成 感受器分子 胞外區(qū) + 胞質(zhì)His激酶域 + 反應(yīng)-調(diào)節(jié)分子 接受域 + DNA結(jié)合域 是一種His-Asp磷酸化體系 “雙組分”轉(zhuǎn)導(dǎo)體系在哺乳類尚未鑒定出,“雙組分”轉(zhuǎn)導(dǎo)過程 感受器蛋白活化 胞質(zhì)激酶域的His磷酸化 反應(yīng)-調(diào)節(jié)分子接受域 的Asp磷酸化 啟動輸出功能，即轉(zhuǎn)錄激活作用,酵母 “雙組分”滲透壓感受器： 由3種蛋白組成 Sln1 + Ypd1 +Ssk1 兩個相連的“雙組分”體系 第一個 Sln1(His激酶域和接受域) 第二個 Ypd1 (His激酶域) + Ssk1 (接受域,在低滲透壓條件下

9、Sln1 是有活性的 Ssk1是無活性的 HOG1也無活性 在高滲透壓條件下 Sln1 是無活性的 Ssk1是有活性的 HOG1也有活性,2. Sho1依賴的滲透壓感受器 Sho1：跨膜蛋白滲透壓感受器 結(jié)構(gòu) ：4個跨膜區(qū) + C-末端胞質(zhì)區(qū) ( 含SH3域,在高滲透壓條件下 Sho1 感受高滲透 Sho1激活Ste11 Pbs2發(fā)揮支架蛋白的作用 Pbs2含有多聚脯氨酸富集區(qū),3. 裂殖酵母菌中的滲透壓感受通路和 應(yīng)激通路 環(huán)境應(yīng)激時激活2個相關(guān)的MAPK通路 WIK/WIS/SPC1通路 WIN1/WIS/SPC1通路 (在滲透壓應(yīng)激時起主要作用) 上游調(diào)節(jié)因子Mcs4是Ssk1蛋白的同源

10、物 ATF1是SPC1的主要核內(nèi)底物,SPC1只有經(jīng)磷酸化后才能入核 熱休克和氧應(yīng)激時SPC1磷酸化激活，但不需要WIS的作用。 Pyp1使SPC1脫磷酸化,六）芽孢形成通路 芽孢形成：是指將單倍體核包裝入芽孢的過程 包括減數(shù)分裂。 僅發(fā)生在雙倍體 由饑餓誘發(fā) 芽孢形成過程： 減數(shù)分裂 雙層膜的原孢子壁包裹單層核膜的4個單倍體 從原孢子壁的雙層間隙沉積孢子壁,孢子壁的組成：共4層： 第一、二層：同植物細胞壁 第三層：孢子特異性的結(jié)構(gòu) 聚乙酰氨基葡糖 + 聚氨基葡萄糖 第四層：電子密集層 雙酪氨酸包被,從以上酵母MAPK通路的研究中看到: MAPK通路是一個連續(xù)的蛋白激酶激活的途徑 MAPK的主

11、要底物為轉(zhuǎn)錄因子 MAPK通路受不同的上游因子調(diào)節(jié) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是高度特異的 某一種蛋白成員存在于數(shù)種通路時,支架蛋白起著隔室化的作用,六、哺乳動物MAPK通路 哺乳動物MAPK通路不同于酵母: 多種MAPK通路可被一種受體型所激活 MAPK的主要底物包括轉(zhuǎn)錄因子、 胞 質(zhì)蛋白質(zhì) 、細胞骨架、蛋白激酶和磷脂酶 已鑒定出4條MAPK通路 MAPK有多種亞族和多種不同的剪接體,一）ERK通路 研究得最為透徹 ERK的MAPK有5種 (15) 它們分屬于不同的亞族 ERK1和ERK2(ERK1/2)研究得最為透徹 為細胞內(nèi)主要的MAPK ERK3存在于細胞核 ERK4通過Ras依賴性通路而被激活,1.

12、ERK1/2通路中MKKK 許多受體通過活化Ras激活ERK1/2通路 Raf: 是該通路中的重要的MKKK 亞型: 有3種 A-Raf 、 B-Raf 、 Raf1 組成: 含3個結(jié)構(gòu)域 C-末端的激酶域 富含Cys的調(diào)節(jié)域 含Ras結(jié)合位點的調(diào)節(jié)域,表達: Raf1在體內(nèi)廣泛表達 而A-Raf 和B-Raf表達方式嚴格 如B-Raf 主要在神經(jīng)組織中表達 激活: 酶水平的調(diào)節(jié)較復(fù)雜 主要包括2個過程: 一是結(jié)合于GTP- Ras 二是 磷酸化 ( 一簇 Ser338, Ser339, Tyr340, Tyr341,Raf1對于H-、K-和N- Ras顯示應(yīng)答 B-Raf 可被Rap1a活化

13、 TC21能夠與Raf1和B-Raf相互作用，激活它們。 上游激酶的調(diào)節(jié): 已知磷酸化Raf1的激酶有Src 、PAK、PKC及其他蛋白激酶,其他的磷酸化位點 Ser259和Ser621 調(diào)節(jié)Raf1與14-3-3蛋白結(jié)合，穩(wěn)定其活性。不過， 14-3-3蛋白也可能抑制Raf活性。抑制性的磷酸化位點是由Akt (Ser259)和PKA催化的。 抑制：RKIP可干擾Raf-MEK的結(jié)合，抑制后者磷酸化和活化,2. ERK1/2通路中MKK (MEK) MEK1和MEK2是該通路主要的MEK 為雙特異性蛋白激酶 通過兩個殘基的磷酸化而被激活 ( Ser或Thr) (同MAPK) 突變可引起其活性增

14、加(不同于MAPK) 酸性氨基酸替代，明顯增加其活性 特異性較高，僅磷酸化少數(shù)底物,MEK4可磷酸化非MAPK MEK1和MEK2含3個非酶活性結(jié)構(gòu)域 ERK1/2結(jié)合位點 ( D域 ) 富含Pro結(jié)構(gòu)域 核輸出序列 ( NES,MEK1和MEK2的上游調(diào)節(jié)因子 Raf、RTK、非RTK、GPCR 在轉(zhuǎn)化細胞： Ras Raf1 MEK1 ERK1/2 在心肌細胞 A-Raf MEK1 ERK1/2 在PC細胞 B-Raf MEK1 ERK1/2,3. ERK1/2蛋白激酶的作用底物及滅活 底物的保守性磷酸化位點模體為 Pro-Lue-Ser/Thr-Pro 底物蛋白 胞質(zhì)蛋白: p90S6K

15、 、cPLA2 、EGF 受體 細胞骨架: MAP1、2 、4 、Tau 轉(zhuǎn)錄因子：Elk-1, Ets-1, Sap1a, c-Myc等 滅活: MKP-1, -3, -4,4. ERK1/2通路的生物學(xué)功能 刺激細胞增殖 抑制細胞生長、分化 細胞周期調(diào)控 調(diào)控MTOC 紡錘體的組裝 促進細胞存活 某些情況下，與細胞死亡有關(guān),二）JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 1991年鑒定出的新的MAPK 與ERK有兩點不同： 被紫外線輻射等細胞應(yīng)激所激活 磷酸化c-Jun的氨基活化位點 故稱之為c-Jun N-terminal kinase (JNK) 鼠的同源物則被命名為Stress activated prot

16、ein kinase (SAPK,之所以稱為SAPK是因為在應(yīng)答各種刺激時，它們的活性增加。這些應(yīng)激包括： 細胞因子 生長因子撤離 干擾DNA和蛋白合成的試劑 UV輻射 熱休克 反應(yīng)活性氧 (ROS) 高滲透壓,JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 是已知的應(yīng)答最多樣刺激的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一 JNK通過Thr-Pro-Tyr模體的磷酸化被激活 由JNK、 MAP2Ks、 MAP3Ks 和MAP4Ks組成 細胞外配體應(yīng)答的JNK通路照比細胞應(yīng)激應(yīng)答研究得較為清楚,JNK： 人的JNK由3個基因 ( jnk1, jnk 2和 jnk3)編碼 3個基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不同剪接產(chǎn)生10個JNK亞型 (46kDa, 55kD

17、a) JNK家族成員間的激酶催化核心的同源性為87% 同一基因編碼的46kDa和55kDa亞型無明顯的功能差異,JNK1和JNK2廣泛地在多種組織表達 JNK3 主要在神經(jīng)組織表達 JNK1和JNK2 在激酶域的不同剪接體可改變JNK與它們底物的相互作用 不同的亞型受不同的調(diào)節(jié),JNK底物包括： 轉(zhuǎn)錄因子 c-Jun, Jun-D, ATF-2, ATF, Elk-1 Sap-1a, GABP, GABP 腫瘤抑制蛋白p53 JNK生理功能： JNK1和JNK2有重疊功能，在免疫應(yīng)答和胚胎發(fā)育中具有重要的調(diào)節(jié)作用。 JNK3在神經(jīng)組織中有特異功能,1. JNK信號通路MKK和MKKK MKK

18、(MAP2Ks) MKK4 ( SEK1/MEK4/JNKK1/SKK1 ) 主要激活JNK，但對p38也有活化作用 可能是個抑癌基因 胚胎發(fā)育所必需 使細胞免于凋亡 不是惟一的激活劑,MKK7 (MEK7/JNKK2/SKK4 ) 特異地激活JNK，而不激活p38或ERK 與MKK4相關(guān)，屬于哺乳動物細胞MAPKK超家族 與果蠅的HEP(DJNK的激活劑)密切相關(guān) MKK7基因編碼6個蛋白亞型 不同亞型應(yīng)答不同的細胞外刺激和上游激酶,MKK4與MKK7在人和鼠組織中廣泛表達，但在不同的組織起表達的豐度不同 MKK4與MKK7介導(dǎo)來自同一細胞外刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但它們被不同MAP3Ks所激活。

19、同MEK1/2，用酸性氨基酸置換磷酸化位點的氨基酸，可增加其激酶活性,MEKK (MAP3Ks) 包括： MEKK14、 ASK1/MAPKKK5 MAPKKK6、 TAK1 Tpl-2 、 MLK2/MSK MLK3/SPRK/PTK1 MUK/DLK/ZPK LZK,MEKKs ( MAPK/ERK kinase kinases ) 因與酵母的STE11同源而被克隆 首先鑒定出的激活JNK的MAP3K是MEKK1 目前已克隆的4種稱為MEKK14 在蛋白C-末端具有同源的激酶域，而它們的N-末端幾乎無同源性,MEKK1和4與G蛋白Cdc42和Rac相互作用 MEKK1還可結(jié)合Ras MEK

20、Ks 也調(diào)節(jié)其他細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 MEKK13激活ERK通路 MEKK34激活p38通路,TAK1 ( TGF-activated kinase) 因其在芽殖酵母中具有回補STE11突變體缺失的功能而被克隆 N-端具有激酶域 C-末端與TAB1/2相互作用 被TGF- 、IL-1、神經(jīng)酰胺、UV激活 可直接激活I(lǐng)KK和NF-B轉(zhuǎn)錄活性,ASK1/MAPKKK5 ASK2/MAPKKK6 ( Apoptosis signal-regulating kinase1) 應(yīng)用PCR技術(shù)而被鑒定出 激酶域位于蛋白分子的中間 ASK1 MKK4 JNK ASK1 MKK3 p38 被TGF- 、FasL激

21、活 誘導(dǎo)凋亡,ASK2/MAPKKK6 ASK1的相關(guān)激酶 (鼠的同源物是ASK2) 應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)而被鑒定出 整個分子與ASK1的同源性為45% 但激酶域的同源性高達82% 與MEKK14的同源性約為40% 僅能較弱地激活JNK，但并不能 激活p38,Tpl-2/cot ( Tumor progression locus 2) 最初作為原癌基因而被克隆 與人的cot基因約有90%的相同性 與其他的MAP3K約有30%的相同性 Tpl-2 MEK1 ERK Tpl-2 MKK4 JNK 參與NF-B的激活,MLKs ( Mixed lineage kinase) 該家族激酶的特點： 催化域

22、具有Tyr和Ser/Thr兩種蛋白激酶的結(jié)構(gòu)特點 N-端含有SH3模體 C-端有Pro富集區(qū) C-端附近有亮氨酸拉鏈,MLK2/MST ( mammalian STE 20-like) MLK2 MEK4 JNK MLK2 MKK7 JNK 對p38和ERK的作用較弱 含有Cdc42和Rac的結(jié)合位點 MLK3/SPRK/PTK MLK3 MKK4 JNK MLK3 MKK3/6 p38 對ERK無作用,MUK/DLK/ZPK/LZK ( MAPK- upstream kinase) ( dual luecine zipper- bearing kinase) (luecine zipper-

23、 protein kinase) (luecine zipper- bearing kinase) MUK MEK7 JNK LZK激活JNK,MAP4Ks STE20相關(guān)激酶 N-端具有STE20樣的催化域 中間至少有2個Pro富集域 C-端有CNH域 是JNK強的特異性激活劑 GCK ( germinal center kinase) KHS (kinase homologous to STE20 ) GCKR (GCK- related kinase) GLK (GCK like kinase,TAO1 ( Thousand and one amino acid protein kina

24、se) 應(yīng)用PCR方法從大白鼠腦的cDNA文庫中鑒定出。 主要在腦和睪丸中表達 激酶域與其他STE20相關(guān)激酶的同源性約45% 主要激活MKK3,HPK1 ( hematopoietic progenitor kinase ) 主要在造血細胞中表達 含有4個Pro富集域 與連接物蛋白相互作用 受酪氨酸蛋白激酶調(diào)節(jié) 主要激活JNK，不是ERK和p38 在TGF- 誘導(dǎo)的JNK激活中是TAK的上游,支架蛋白： 在哺乳動物細胞中了解有限 JIP1 ( JNK-interacting protein 1 ) 應(yīng)用酵母雙雜交篩選出 主要結(jié)合JNK，不是ERK和p38 抑制JNK的核轉(zhuǎn)位 結(jié)合MKK7 與

25、MLK家族、HPK1相互作用,三）p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 p38最初作為LPS刺激產(chǎn)生的酪氨酸磷酸蛋白而被鑒定出 p38與酵母HOG1具有明顯的同源性 p38是細胞抑制性抗炎藥的靶分子 雙磷酸化三肽模體 Thr-Gly-Tyr 不同亞型的表達、激活和特異性不同 亞型之間有重疊的、不同的生理作用,p38的表達： p38 ：白細胞、肝、脾、骨髓中等高表達 p38 ：腦和心中高表達 p38 ：主要在骨骼肌中表達 p38 ：肺、腎、腸及內(nèi)分泌器官中高表達 注： p38 和 p38 具有不同的剪接體 例：Mxi 缺少80氨基酸殘基的p38,p38的結(jié)構(gòu)： N-末端、C-末端延伸短，與已知其他激酶無同源性 (

26、p38家族成員和JNK亞型除外) 相似于ERK2，但活化環(huán)構(gòu)象差異明顯 ATP結(jié)合位點相對開放 磷酸化唇序列比ERK2短6個氨基酸殘基,1. p38 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的MKK和MKKK MEKs: MEK3和MEK6是細胞中p38激活的主要激酶。 不同的MEK選擇性地激活不同的亞型 MEK6 共同的激活劑 MEK3 激活 p38 , ,MEKKs: MEKK13參與p38激活 MEKK1MEK4 p38 (3T3細胞) MEKK3MEK3 p38 (轉(zhuǎn)化細胞) MLK家族的4個成員參與p38激活 其他激酶 Tp12 ASK TAK,MLK家族成員含有3個結(jié)構(gòu)域： SH3域 亮氨酸拉鏈 小分子G蛋白

27、結(jié)合域 參與p38激活的4個成員是： MUK/ZPK/DLK MTK1/MEKK4 MLK2/MST MLK3/PTK/SPRK,上游調(diào)節(jié)因子： Rac、Cdc42、Rho家族的小分子GTPase是p38途徑的較強的調(diào)節(jié)因子。 Rac/Cdc42 PAK p38,來自細胞表面的活化： 異三聚體G蛋白可激活p38途徑，但激活機制因細胞不同而異。 M1-乙酰膽堿受體-Gq/11 M2-乙酰膽堿受體-Gi -腎上腺素受體-Gs (HEK293細胞) 1A-腎上腺素受體-Gs (PC12細胞) -腎上腺素受體-Gi (ARVM細胞,激活p38途徑的物理、化學(xué)應(yīng)激： 氧化應(yīng)激 (巨噬細胞 ) 低滲壓 (

28、HEK293細胞 ) 紫外線輻射 (PC12細胞 ) 低氧 (牛肺動脈成纖維細胞 ) 循環(huán)擴張 (腎小球膜細胞,亞細胞定位： 細胞核、胞質(zhì) (免疫熒光顯微鏡) 應(yīng)激反應(yīng)，如心肌缺血、低氧時， 胞質(zhì) 核 p38的抑制劑： 吡啶咪唑 結(jié)合于ATP結(jié)合位點延伸袋 p38 , 敏感 p38 , 不敏感,2. p38蛋白激酶的作用底物和滅活 作用底物: 細胞骨架 細胞應(yīng)激 微管相關(guān)蛋白(tau) stathmin ( 癌蛋白18） 細胞質(zhì)蛋白 刺激血小板 cPLA2 血管緊張素 Na+/H+交換體,轉(zhuǎn)錄因子 ATF1/2 (activation transcription factor 1/2) CHOP10 (C/EBP-homologus protein 10 ) MEF2C (myocyte enhancer factor 2C) Max (myc associated factor X ) MAPKAPK 2/3 MNK1/2 (MAPK-interacting kinase 1/2 ) PRAK (p38-regulated/activated kinase,p38蛋白激酶滅活： 蛋白激酶磷酸酶M3/M6 3. p38 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路