載脂蛋白E基因敲除鼠及動(dòng)脈粥樣硬化探究

1、載脂蛋白E基因敲除鼠及動(dòng)脈粥樣硬化探究 摘要載脂蛋白E(apolipoprotein ,APOE)是血漿脂蛋白的重要組成成分,在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用。載脂蛋白E基因的缺失或變異均會(huì)引起體內(nèi)的代謝異?；蚪M織器官的功能障礙,從而導(dǎo)致一系列的疾病和并發(fā)癥。載脂蛋白E基因敲除小鼠是目前研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制的最常用的動(dòng)物模型之一,尤其是用于易損斑塊動(dòng)物模型研究。本文對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠粥樣硬化斑塊病理特點(diǎn)、飲食對(duì)其AS的影響、調(diào)脂藥物的研究情況,及有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)斑塊的作用等進(jìn)行了綜述。 關(guān)鍵詞載脂蛋白E基因; 敲除小鼠; 動(dòng)脈粥樣硬化 中圖分類號(hào) R543.1+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào) 100

2、5-0515(2010)-10-022-02 Effect of APOE-gene Knockout Mice and Research of Atherosclerosis Nie saiZhao shui-ping(auditing) (Cardiology of 2nd Xiangya Hospital of Central South University,Hunan-changsha, 410011) AbstractAPOE is an important component of plasma a lipoproteins, and plays significant role

3、s in lipoprotein metabolism. The absence or mutation of APOE may induce abnormal lmetabolism in vivo and dysfunction of organs, and then lead to a series of diseases and complications. APOE-knockout mice is one of the best models for research on mechanism of atherosclerosis, which became a popular m

4、odel used in studies on vulnerable plaques. This article explore pathologic characteristics of atherosclerotic plaques, high fat diet, aerobic movement and application in pharmacological research about APOE gene knockout mice. Keywords Apolipoprotein E; Gene knockout; Atherosclerosis; Mice 載脂蛋白E(Apo

5、E)于1973年發(fā)現(xiàn),與已知氨基酸序列的載脂蛋白相比,其精氨酸含量較高,故曾稱為富含精氨酸的載脂蛋白(ARP)。1975年,Utermann建議根據(jù)字母順序?qū)⑵涿麨锳poE。1992年美國(guó)洛克菲勒大學(xué)生化遺傳和代謝實(shí)驗(yàn)室和北卡羅來納大學(xué)病理遺傳實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用胚胎干細(xì)胞基因敲除技術(shù),成功培育出載脂蛋白E基因敲除小鼠1。載脂蛋白E作為配體,有助于乳糜微粒和極低密度脂蛋白的清除。因此,缺乏ApoE則會(huì)導(dǎo)致血液循環(huán)中脂蛋白代謝障礙,易于沉積動(dòng)脈壁內(nèi),引起動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊。ApoE基因敲除小鼠易形成嚴(yán)重高脂血癥及AS病灶,所以廣泛應(yīng)用于AS的研究。 1ApoE基因敲除小鼠AS病灶的病理特點(diǎn) 對(duì)正常

6、飲食下的ApoE基因敲除小鼠進(jìn)行觀察2,發(fā)現(xiàn)血漿總膽固醇(TC)含量比同期正常小鼠高4-5倍,隨著時(shí)間延長(zhǎng),可出現(xiàn)不同的病變特征。5-6周時(shí)動(dòng)脈內(nèi)皮上有單核細(xì)胞黏附,并向內(nèi)皮下移動(dòng);10周時(shí)脂質(zhì)條紋形成;15周時(shí)可見斑塊形成,其內(nèi)可見泡沫細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞;20周時(shí)則有膠原和彈性纖維包饒的平滑肌細(xì)胞組成的纖維帽覆蓋在壞死核心表面,形成成熟的斑塊。隨著時(shí)間延長(zhǎng),可出現(xiàn)鈣化、增生的纖維帽,8個(gè)月左右冠脈動(dòng)脈口處由于粥樣硬化斑塊的發(fā)展形成嚴(yán)重閉塞。這種小鼠雖然病變嚴(yán)重,但仍能在一般條件下存活。 將ApoE基因敲除小鼠分為低脂飲食組與高脂飲食組,分別在6、8、10、15、20、30、40周時(shí),觀察血管組

7、織形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)AS各階段的病理表現(xiàn)均存在于這種小鼠,與其他AS小鼠模型比較,ApoE基因敲除小鼠不僅能夠在瓣膜基底,而且能夠在所有胸腹動(dòng)脈中形成廣泛的粥樣硬化病變,如:主動(dòng)脈分支、頸動(dòng)脈、肺動(dòng)脈等。所以,ApoE基因敲除小鼠的AS病變發(fā)展同人類極其相似3。Cullen4研究認(rèn)為,因?yàn)閯?dòng)物本身的特性及誘導(dǎo)斑塊破裂和檢查手段的限制及不確定性,使其不能夠準(zhǔn)確的反映或代表復(fù)雜的人類粥樣硬化斑塊,而ApoE基因敲除小鼠的自發(fā)破裂與人類的形似性更好。 42-60周齡的ApoE基因敲除小鼠,頭臂段動(dòng)脈存在富含膠原的纖維脂質(zhì)斑,斑塊內(nèi)有壞死核和出血及被包埋的多層損傷,認(rèn)為后者是由于反復(fù)斑塊破裂后修復(fù)所致5。

8、早期的鈣化,對(duì)斑塊破裂有促進(jìn)作用,斑塊在不同密度組織的交界面最易破裂;而當(dāng)鈣化融合后,這種交界面減少,破裂發(fā)生率也降低了6。因此,鈣化對(duì)于斑塊破裂是把“雙刃劍”。 2膳食和遺傳背景對(duì)APOE基因敲除小鼠AS病灶的影響 動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中,經(jīng)常用高脂飲食來誘導(dǎo)或加快AS的形成。已知不同劑量或不同類型的脂肪酸、加用或不加用膽固醇等,對(duì)于模型小鼠的血脂水平,或動(dòng)脈粥樣硬化的形成都具有重要的影響。 一般認(rèn)為,動(dòng)物模型發(fā)生和形成典型的AS病變,血膽固醇水平至少持續(xù)保持在300mg/dL以上。應(yīng)用最多的是Getz等7認(rèn)為的西方膳食(Western-type diet),包含有21%脂肪和0.15%膽固

9、醇的膳食,可以使ApoE基因敲除小鼠膽固醇水平短時(shí)間內(nèi)達(dá)到并持續(xù)保持1500mg/dL(38.79mmol/L)以上甚至更高。且研究發(fā)現(xiàn),西方膳食與18%脂肪和0.25%膽固醇的膳食相比,在增高血脂水平及在主動(dòng)脈弓部或無名動(dòng)脈形成動(dòng)脈粥樣硬化損害的作用相似,同時(shí)0.15%和0.5%膽固醇的膳食,在誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化損害形成上沒有差別。 有研究表明,盡管ApoE基因敲除會(huì)導(dǎo)致高脂血癥,但不同基因表型或不同遺傳背景決定ApoE基因敲除小鼠的形成的AS嚴(yán)重程度。給予相同的高脂飲食,雜合子ApoE基因敲除小鼠(apoE+/-)血脂水平與野生型小鼠比較無顯著差別,但AS損害面積是野生型小鼠的10倍左右,而

10、對(duì)于純合子ApoE基因敲除小鼠(apoE-/-),血漿膽固醇水平會(huì)更高(2000mg/dL),大動(dòng)脈的AS損害面積是雜合子apoE+/-的50倍。比較C57BL/6和FVB/NJ來源的ApoE基因敲除小鼠,發(fā)現(xiàn)給與相同膳食,FVB/NJ背景的小鼠血膽固醇濃度相對(duì)較高,C57BL/6背景的小鼠主動(dòng)脈AS損害面積是FVB/NJ背景的8倍8。 3ApoE基因敲除小鼠斑塊產(chǎn)生機(jī)理 ApoE基因敲除小鼠的血漿中總膽固醇濃度明顯增高,三酰甘油水平亦比正常小鼠高68%,并不受年齡和性別的影響;但其高密度脂蛋白(HDL)卻只有正常小鼠的45%。正常小鼠的膽固醇主要存在于HDL中,而ApoE主要存在于乳糜微粒(

11、CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)中;但是敲除ApoE基因后,膽固醇就不再主要存在于HDL中,而是在VLDL9。此時(shí)VLDL中大量的膽固醇就不能從小鼠體內(nèi)降解,而在體內(nèi)蓄積,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。 利用ApoE基因敲除小鼠研究極低密度脂蛋白(VLDL)和中間密度脂蛋白(IDL)的致動(dòng)脈粥硬化作用,并從形態(tài)學(xué)方面證實(shí),該模型易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化,主要是VLDL和IDL從體內(nèi)清除的延緩。并有研究顯示,VLDL和IDL作為導(dǎo)致小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的脂蛋白,以不依賴ApoE的方式直接作用于巨噬細(xì)胞,使之在動(dòng)脈壁損傷處轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。 4ApoE基因敲除小鼠與AS的干預(yù)研究 利用此動(dòng)物模型,可觀察各種抗AS治療措

12、施的療效。已發(fā)表了許多相關(guān)研究結(jié)果,大致可分兩大類干預(yù)方法:降脂和非降脂措施。 4.1 他汀類藥物的作用 利用此動(dòng)物模型,Johnson等10觀察到,普伐他汀(40mg/kg.d)可減少早期(9周)斑塊的破裂,而且在不穩(wěn)定斑塊形成后依然有效,但與降低血漿膽固醇濃度無關(guān)。Taral等11研究顯示, 辛伐他汀具有抗炎、抑制鈣化及穩(wěn)定斑塊的作用。他汀類藥物的調(diào)脂作用仍然具有爭(zhēng)議,不同的研究結(jié)果皆然不同,有解釋認(rèn)為與給藥方式不同有關(guān)。但高、低劑量辛伐他汀的調(diào)脂效果差異不明顯,這可能與應(yīng)用時(shí)間較短有關(guān)12。晏沐陽等13研究顯示,辛伐他汀的應(yīng)用可以小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積減小,降低血清中LDL-C和TC

13、的水平,同時(shí)還有他汀類藥物降低炎性反應(yīng),抑制金屬蛋白酶活性等獨(dú)立于調(diào)脂以外的作用。 4.2 非他汀調(diào)脂藥物的作用 Zhang等14給予ApoE基因敲除小鼠口服普羅布考(0.5%,wt/wt),發(fā)現(xiàn)該藥在降低血漿TC的同時(shí),使高密度脂蛋白(HDL)和ApoAI明顯降低。然而,主動(dòng)脈AS斑塊發(fā)展的速度比非用藥組明顯加快,面積約非組的2-4倍。組織學(xué)分析,普羅布考組小鼠病變以纖維組織增生為主,而非泡沫細(xì)胞,通常認(rèn)為這種現(xiàn)象與局灶性炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈瘤擴(kuò)張有關(guān),而且給予高脂飲食的正常小鼠,普羅布考亦可加快粥樣病變的發(fā)展。提示通過普羅布考降低血漿TC并非抗AS的有效措施。 4.3 非調(diào)脂藥物的作用 Bour

14、assa等15研究?jī)?nèi)源性和外源性雌激素對(duì)ApoE基因敲除小鼠對(duì)AS的影響。發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性雌激素較外源性雌激素能明顯減輕AS病變,這種現(xiàn)象可能與內(nèi)源性雌激素影響血漿脂蛋白的水平有關(guān)。治療糖尿病藥物羅格列酮可以減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn),同時(shí)減少新生內(nèi)膜的形成,具有直接抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用16。鈣離子通道拮抗劑-拉西地平可以通過抗氧化作用和血管活性作用來抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展17。非洛地平及厄貝沙坦可能是通過阻斷氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展18,19。而單獨(dú)運(yùn)用哌唑嗪(7.5mg/kg.d)既未能明顯減緩小鼠AS的發(fā)展,也不能有效降低血壓;氯沙坦(20或30mg/kg.d)除輕微降低血壓外,對(duì)AS

15、基本無影響。然而,兩種藥物同時(shí)使用時(shí)小鼠的AS斑塊和血壓都有了顯著的降低,但以上方法在用藥過程中對(duì)血漿TC都無明顯影響20。 4.4 有氧運(yùn)動(dòng)的作用 Napoli等21研究了中度有氧運(yùn)動(dòng)(游泳)聯(lián)合代謝治療(含1.0%Vitamin E普通飲食、含0.05% Vitamin C和6%L-精氨酸飲水),對(duì)6周齡ApoE基因敲除小鼠長(zhǎng)期的作用,發(fā)現(xiàn),任何一種治療都可以緩慢AS的形成,并聯(lián)合治療與單獨(dú)任意一種干預(yù)方式相比,更能明顯的減少AS損害和自發(fā)斑塊破裂率,以及提高生存率,認(rèn)為早期干預(yù)是必要的,有益的。在跑臺(tái)上進(jìn)行中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)的ApoE基因敲除小鼠的TC、TG和LDL-C和ApoB水平顯著降

16、低,AS斑塊面積明顯減少,有氧運(yùn)動(dòng)和低脂飲食兩種結(jié)合的作用大于單獨(dú)有氧運(yùn)動(dòng)和低脂飲食的作用,兩者可以起協(xié)同加強(qiáng)的作用22。 ApoE在脂質(zhì)代謝、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)病變和糖尿病及其并發(fā)癥等方面的研究已經(jīng)廣泛開展,但是ApoE在這些病理生理過程中發(fā)揮的作用及其機(jī)制并不十分清楚,尚需要進(jìn)一步研究。然而,ApoE基因敲除小鼠所致的AS模型緣于遺傳因素?fù)p傷,其病變更接近人類AS,相對(duì)于進(jìn)食高脂飼料而發(fā)生AS的動(dòng)物具有自然發(fā)生、漸進(jìn)發(fā)展、病理形態(tài)典型等特點(diǎn),為研究AS發(fā)病機(jī)理和干預(yù)措施提供了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái),開拓了廣闊的研究前景。 參考文獻(xiàn) 1 Plump AS, Smith JD, Hayek T et

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