生物材料的預處理、細胞破碎和液固分離

1、第三章 生物材料的預處理、細胞破碎和液-固分離,第一節(jié) 生物材料的預處理 第二節(jié) 細胞破碎 第三節(jié) 液-固分離,生物活性物質(zhì)的存在特點,1）生物材料組成非常復雜，有些化合物在生物材料中含量極微，分離操作步驟多，不易獲得高收率。 （2）生物分子對環(huán)境反應十分敏感，結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系比較復雜，生物活性物質(zhì)離開生物體后，易變性，破壞，必須十分小心的保護這些化合物的生理活性。 （3）操作過程中受到影響因素多,第一節(jié) 生物材料的預處理,一、預處理的目的和要求生物材料中的生化組成數(shù)量大、種類多，目的物與雜質(zhì)的理化性質(zhì)十分接近，分離純化較困難 目的改變料液的流變特性，以及除去對后面純化有影響的雜質(zhì) 要求防止目的

2、物的失活,根據(jù)生物活性物質(zhì)存在方式與特點 胞外： 由細胞產(chǎn)生再釋放出來的 無活性的酶原需活化： 先活化再提取 先提取再活化,二、確定預處理方法的依據(jù),胞內(nèi)： 需先破碎細胞后提取 膜上的需先溶解下來,2.后續(xù)操作的要求 一般要求：澄清、pH、一定的濃度 不同后續(xù)操作有不同的要求 離子交換-高價無機離子、澄清度等嚴格控制 溶劑萃取-蛋白質(zhì)含量較低，防乳化,3.目的物穩(wěn)定性 不穩(wěn)定的：要防失活 青霉素-pH4.8-5.2，低溫 蛋白類-高級結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定的：可采用較劇烈的變性和處理條件，沉淀雜質(zhì)蛋白,三、動物材料的預處理,絞肉機絞碎 勻漿和組織搗碎,四、細胞培養(yǎng)液的預處理,為什么需要預處理？ 可溶性粘膠

3、狀物質(zhì)：雜蛋白、不溶性多糖等 粘度增加、影響提取操作 無機鹽 在采用離子交換提取時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量,1）加入凝聚劑 凝聚作用： 指在某些電解質(zhì)作用下，使膠體粒子的擴散雙電層的排斥電位降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒子聚集的過程,1.細胞及蛋白質(zhì)的處理,膠體粒子穩(wěn)定的原因： 帶同種電荷靜電排斥作用 表面水化作用，形成水化層 無機鹽促凝聚作用： 加入相反電性電解質(zhì)，中和膠體表面電荷，降低了雙電層的排斥力 無機鹽在水中的水化作用，破壞了膠粒水化層,影響凝聚作用的主要因素有無機鹽的種類、化合價以及無機鹽的用量等。 通常培養(yǎng)液中細胞或菌體帶負電荷，常采用高價陽離子促其凝固。 陽

4、離子對帶負電荷的膠粒凝聚能力的次序為：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+ 常用的凝聚劑有：Al2(SO4)318H2O、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等,2）加入絮凝劑 絮凝劑：有機高分子，易溶，鏈長，活性功能基團多 絮凝作用： 當往膠體懸浮液中加入絮凝劑時，膠?？蓮娏椅皆谛跄齽┍砻娴墓δ軋F上，而且一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的顆粒的表面上，形成架橋聯(lián)接，形成粗大的絮凝團沉淀出來，有助于過濾,影響因素： 分子量：大，效果好；過大，溶解度 用量：低濃度增加用量有助架橋，濃度過高吸附飽和失去架橋作用，降低了效果。 pH：影響功能團電離度，電離

5、度，鏈伸展， 效果 操作條件： 攪拌：初期，快好；后期，會破壞絮凝團,3）變性作用 天然蛋白質(zhì)分子受到某些物理因素（如熱、紫外線照射、高壓和表面張力等）、化學因素（如有機溶劑、脲、胍、酸、堿等）影響時，生物活性喪失，溶解度降低，不對稱性增高以及其他的物理化學常數(shù)發(fā)生改變。 用途： 雜蛋白質(zhì)變性沉淀析出 方法： 加熱、大幅度改變pH，加有機溶劑、重金屬鹽或表面活性劑,4）吸附 方法： 加入吸附劑：活性碳除熱原 加入反應劑：相互作用形成沉淀吸附蛋白質(zhì) 四環(huán)素發(fā)酵液：黃血鹽+硫酸鋅 亞鐵氰化鋅鉀K2Zn3Fe(CN)62的膠狀沉淀，能將雜蛋白質(zhì)和菌體等黏附在其中而除去。 枯草桿菌的堿性蛋白酶發(fā)酵液：

6、 氯化鈣+磷酸鹽 磷酸鈣鹽沉淀（吸附、助濾,5）等電沉淀 常與其他方法合用 （6）加各種沉淀劑沉淀 沉淀劑與蛋白質(zhì)形成復合物沉淀,2.多糖的去除 酶：轉(zhuǎn)化為單糖 如發(fā)酵液中殘留的淀粉：淀粉酶 粘多糖與一些陽離子表面活性劑如十六烷基溴化銨（CTAB）形成沉淀,Ca2+ 草酸、草酸鈉形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸） Mg2+三聚磷酸鈉(Na5P3P10)形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物 Fe2+ 黃血鹽(K4Fe(CN)6) 普魯士藍沉淀,Ca2 ，Mg2 ， Fe3等 （1）離子交換法 （2）沉淀法,3.高價金屬離子的去除,微生物細胞和植物細胞外層均為細胞壁，細胞壁里面是細胞膜 動物細胞沒有細胞壁，僅

7、有細胞膜。 通常細胞壁較堅韌，細胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細胞破碎的阻力主要來自于細胞壁,第二節(jié) 細胞破碎,一、機械法 1、勻漿法 2、珠磨法 3、超聲波,三、化學法 1.化學試劑 2.制成丙酮粉,二、物理法 1.干燥 2.凍融 3.滲透壓沖擊,四、生物法 1.酶解法 2.自溶,一、機械法 1 高壓勻漿法 定義利用高壓細胞懸浮液因減壓所產(chǎn)生的剪切力而達到細胞破碎的過程 工作原理：液液剪切力、壓力差等 特點： 適用對象廣 工業(yè)化、實驗室中應用 細胞完全破碎,1.高壓勻漿器 原理：進入高壓室的細胞懸浮液被強迫通過一個狹窄的小孔，產(chǎn)生液相剪切力引起細胞破碎,易造成堵塞的團狀或絲狀真菌， 較

8、小的革蘭氏陽性菌， 含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥,不宜采用高壓勻漿法的微生物,2 高速珠磨法 定義利用由高速轉(zhuǎn)動的珠子所產(chǎn)生的剪切力而達到細胞破碎的過程 工作原理：固固剪切力、液固剪切力等 特點： 適用對象較廣 工業(yè)化、實驗室中應用 細胞完全破碎 需冷卻,2.高速珠磨機 原理：玻璃小珠與細胞懸液一起快速攪拌，研磨作用，細胞破碎,WSK臥式高效全能珠磨機,ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機,3 超聲波法 定義利用超頻率聲波（15-25kHz）在液體介質(zhì)中傳播所產(chǎn)生的剪切力而達到細胞破碎的過程 工作原理：空穴現(xiàn)象 特點： 適用對象一般 主要于實驗室中應用 細胞完全破碎 需冷卻，噪音

9、,3.超聲波振蕩器 原理：利用超聲波的空穴作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎,影響因素：超聲波的聲強、頻率、破碎時間、介質(zhì)的離子強度、pH、菌體的濃度和種類。 一般桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G+細菌易破碎，對酵母菌的效果較差。超聲破碎時細胞濃度一般在20左右。 超聲波破碎法在實驗室和小規(guī)模生產(chǎn)中應用較廣。操作時常應把懸浮液預先冷卻到05，并且還應在夾套中連續(xù)通入冷卻劑進行冷卻,二、物理法 1.干燥法 原理：干燥后，細胞膜滲透性變化，部分菌體自溶，溶劑抽提得胞內(nèi)物質(zhì)。 分類:空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥，冷凍干燥 氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在2530的氣流中吹

10、干；真空干燥多用于細菌；冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的物質(zhì),2.反復凍融法 將細胞放在低溫下冷凍（約-15），然后在室溫中融化，反復多次而達到破壁作用。 原理： 細胞膜疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，增加細胞親水性 冰晶粒使細胞破裂 適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性,3.滲透壓沖擊法 原理： 細胞在濃鹽中平衡，再投入水中膨脹破裂,三、化學法,1.加入化學試劑 采用化學法處理可以溶解細胞或抽提胞內(nèi)組分。 堿：溶解除細胞壁外大部分組分，改變pH，改變蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì) 有機溶劑：溶解細胞膜上脂質(zhì)，破壞細胞，但易引起變性 表面活性劑：改變膜的通透性，細胞溶解 胞內(nèi)異

11、淀粉酶：0.1%SDS，30振蕩30h,2.丙酮粉 保存+破碎 脫水脫脂，細胞結(jié)構(gòu)松散 方法： 組織或勻漿懸浮0.01mol/LpH6.5的磷酸緩沖溶液中，0 一邊攪拌，一邊徐徐倒入10倍體積的-15 丙酮內(nèi)，10min后離心過濾取其沉淀，反復用冷丙酮洗幾次，真空干燥得,四、生物法 1.酶解法： 機理：利用酶反應分解破壞細胞壁上特殊的化學鍵,常用的溶酶,G+ 溶菌酶 G- 溶菌酶、EDTA 放線菌 溶菌酶 酵母菌 -葡聚糖酶 霉菌 幾丁質(zhì)酶、 植物 纖維素酶、半纖維素酶,細胞壁溶解酶是幾種酶的復合物,加入酶：溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等,酶解法的優(yōu)點,發(fā)生酶解的條件溫和 能選擇性地釋放產(chǎn)物

12、 胞內(nèi)核酸等泄出量少，細胞外形較完整，便于后步分離等 但酶水解價格高，故小規(guī)模應用較廣,2. 自溶： 誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達到細胞自溶的目的。 微生物細胞的自溶常采用加熱法和干燥法。 酵母細胞：4550，12-24h,1.規(guī)模及成本 大規(guī)模：高壓勻漿、珠磨 實驗室規(guī)模：超聲波振蕩 2.目的物的穩(wěn)定性 干燥法、有機溶劑對活性影響大 保護性措施 3.破碎效果和產(chǎn)物釋放率 動物細胞：滲透壓沖擊、凍融法 微生物細胞：結(jié)合酶法 高釋放率又不能使細胞碎片太小,適宜的操作條件應從高的產(chǎn)物釋放率、低的能耗和便于后步提取這三方面權(quán)衡,五、選擇破碎方法的依據(jù),機械法與非機械法破碎的

13、比較,第三節(jié) 液固分離,過濾 定義在一定的壓力差下，將固液懸浮液通過一多孔性介質(zhì)而實現(xiàn)固液分離的過程 原理篩分 過濾類型常規(guī)過濾、錯流過濾 常規(guī)過濾：料液流動方向和過濾介質(zhì)垂直 錯流過濾：濾液給過濾介質(zhì)表面一個平行的大流 量沖刷，多用薄而多孔的膜 優(yōu)點：收率高，質(zhì)量好，減少處理步驟,錯流過濾： 料液與過濾介質(zhì)表面平行的大流量沖刷,過濾收率高 濾液質(zhì)量好 減少處理步驟,2.過濾設(shè)備 板框過濾機,真空鼓式過濾機,3.過濾介質(zhì)和助濾劑 （1）過濾介質(zhì) 濾布或膜 耐酸堿、高溫、化學試劑、抗拉性能好、有一定的機械強度和孔隙度等,2）助濾劑 要求為惰性物質(zhì)、無毒、有一定細度及硬度，成本低廉。 加入方法： 預鋪法：預鋪在過濾機上 混合法：與發(fā)酵液一起加入 生成法：反應中生成沉淀 新生霉素發(fā)酵液： 常用有：硅藻土、紙漿、石棉、纖維素等,二. 離心分離,定義在離心場作用下，料液中固體依據(jù)其與介質(zhì)密度的不同達到固液分離的過程