石蠟和冰凍切片檢測牛蛙肝糖原的染色效果比較

1、石蠟和冰凍切片檢測牛蛙肝糖原的染色效果比較肝糖原是人和動物體內(nèi)的貯備多糖，有動物淀粉;之稱，肝糖原在酶促作用下合成和分解以維持血糖濃度穩(wěn)定。檢測肝糖原含量變化在醫(yī)學病理學上可用于糖原累積病糖尿病和某些腫瘤的診斷，在養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中可用于了解動物的營養(yǎng)狀況以指導合理飼喂。高碘酸希夫氏 （′，）染色法是檢測糖原的經(jīng)典組織化學方法，該法先用高碘酸將糖類相鄰兩個碳上的羥基氧化成醛基，再用試劑（無色品紅）和醛基反應產(chǎn)生紅色或紫紅色物質(zhì)，紅色的深淺反映組織細胞中糖原的含量。目前對肝糖原染色過程中樣品固定、染色試劑的配制與儲存、染色時間等方面研究報道較多，切片方法均為石蠟切片，冰凍切片制作過程時間

2、短、效率高，但尚未見有關(guān)用冰凍切片檢測肝糖原的研究報道。牛蛙屬經(jīng)濟養(yǎng)殖型蛙類，具有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值，也是重要的科研和教學用實驗動物。本試驗分別制作了牛蛙肝組織石蠟和冰凍切片，采用染色法檢測肝糖原，通過光密度分析測定糖原含量，比較了兩種切片的染色效果，供相關(guān)教學與科研技術(shù)人員參考。材料和方法材料成體牛蛙只，重，購自蕪湖市黃山菜市場，穿刺脊髓處死，迅速解剖，取出肝臟，用吸水紙輕輕拭干，勿用水或生理鹽水清洗。實驗方法石蠟切片將肝臟切成約××的小塊，用固定液于低溫固定約，分別用乙醇和無水乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，常規(guī)切片厚μ，水中展片。冰凍切片將肝臟切成約

3、××的小塊，放在組織支撐器上，滴加冷凍包埋劑后放入冰凍切片機中低溫固化后切片，切片厚μ。染色對照組取石蠟切片常規(guī)脫蠟至乙醇后稍水洗，與冰凍切片同時滴加唾液淀粉酶溶液于溫箱中消化處理，消化過程中實驗組石蠟切片脫蠟至乙醇后稍水洗，將實驗組、對照組的石蠟、冰凍切片入高碘酸氧化，流水沖洗再用蒸餾水浸洗兩次；冰箱取出無色品紅待至室溫后避光染色；用的偏重亞硫酸鈉漂洗兩次，每次約，流水沖洗，蒸餾水洗 后蘇 木 精 染 色 ；自 來 水 洗，的鹽酸乙醇分化 ，水洗充分后溫水返藍，流水沖洗，溫箱烘干，中性樹膠封固。光密度測定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在型顯微鏡下觀察拍照，采用圖像分析軟件對染色

4、陽性部位進行光密度分析，測出切片中陽性部位的累積光密度（，）和面積，算出平均光密度（，）。采用單因素方差分析（）進行差異顯著性比較，為差異顯著。結(jié)果染色后糖原顆粒呈紅色或紫紅色，石蠟切片染色后肝臟組織結(jié)構(gòu)較為清晰，但肝細胞內(nèi)有較多空泡，糖原流失較多，且偏向了細胞的一側(cè)（圖），冰凍切片肝細胞形態(tài)保持完好，糖原顆粒明顯比石蠟切片中大，且糖原保持較好的原位狀態(tài)（圖）。光密度分析顯示冰凍切片糖原含量顯著高于石蠟切片（）（表），與冰凍切片相比，石蠟切片中糖原流失了左右。討論取材與固定制作石蠟切片時，不同的固定方法對肝糖原的顯示影響較大，采用固定液固定可較好地保存糖 原，此 外，低 溫下 固 定 也 可

5、防 止 糖 原 丟失；冰凍切片無需對材料進行固定處理，直接取材冷凍包埋后切片即可。切片與展片王玨等認為肝臟的石蠟切片厚度一般在μ為宜，組織太厚或太薄均不利于觀察。制作μ冰凍切片材料極易破碎，本實驗冰凍切片厚度為μ，染色后效果亦較為理想。有報道認為在酒精中展片可防止糖原流失染色效果較好，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)在酒精中和清水中展片染色效果無明顯差異，可能是由于材料經(jīng)石蠟包埋，短時間水中展片不會導致糖原的流失。試劑配制實驗采用無色品紅染色，本試劑因配制需活性炭吸附過濾，配制耗時較長，可適量多配制一些后在冰箱避光保存。另外，本實驗在配制無色品紅時發(fā)現(xiàn)若未經(jīng)活性炭吸附時溶液已基本無色，則該試

6、劑與經(jīng)活性炭吸附后的試劑染色效果相同。有研究認為，對于失效無色品紅溶液，在約每試劑中加入偏重亞硫酸鈉，可恢復其染色能力，其他試劑均可現(xiàn)配現(xiàn)用。對照實驗可用淀粉酶與保溫箱中反應左右，本實驗發(fā)現(xiàn)將唾液稀釋倍于雙層紗布過濾兩次后在保溫箱中反應左右，效果亦較為理想。不過，反應時間應把握較為準確，時間太短糖原未分解徹底，時間太長又易致其它組織結(jié)構(gòu)分解，且染色沖洗時易掉片。實驗組兩種切片經(jīng)高碘酸氧化后均不易掉片，但對照組由于經(jīng)過酶消化易掉片，沖洗時應小心，對照組染色后陰性，證明實驗組陽性物質(zhì)為糖原。染色結(jié)果石蠟切片染色后肝臟組織結(jié)構(gòu)雖然較為清晰，但肝細胞內(nèi)有較多空泡，可能是由于制片脫水過程中糖原溶解流失形

7、成的。糖原偏向了細胞的一側(cè)，有報道認為這是由于固定劑把細胞內(nèi)的糖原推向固定劑對組織浸透的方向而造成；冰凍切片為切片后直接染色，因此可很好地保留糖原及其在細胞中的位置?？傊?，石蠟和冰凍兩種切片方式均可用于糖原染色，由于糖原易溶于水，兩種切片材料未經(jīng)高碘酸氧化前均不宜與水接觸，但制作石蠟切片時脫水脫蠟過程中不可避免要與水接觸，必然會造成不同程度的糖原流失，而冰凍切片可直接切片染色，無需與水接觸，不會造成糖原流失；石蠟切片制作實驗環(huán)節(jié)較多，耗時較長，通常要，而冰凍切片制作實驗環(huán)節(jié)較少、耗時短，只需。但冰凍切片需要冰凍切片機，價格較昂貴，沒有石蠟切片機那么普及。本研究結(jié)果顯示，在條件許可的情況下，臨床病理診斷和生產(chǎn)實踐中檢測糖原含量變化時，應選用制作方便、耗時短且糖原不易流失的冰凍切片。參考文獻付銀鋒染色方法及應用河南科技大學學報（醫(yī)學版），