腫瘤分子檢測(cè)與質(zhì)量控制課件

1、深圳市人民醫(yī)院病理科 分子實(shí)驗(yàn)室 姜陽(yáng)陽(yáng) 2015-10-27,腫瘤分子檢測(cè)方法與質(zhì)量控制,醫(yī)學(xué)發(fā)展歷程的啟示,經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué),循證醫(yī)學(xué),精準(zhǔn)醫(yī)學(xué),診斷靠治療后期經(jīng)驗(yàn)積累,診斷治療以人群、科學(xué)研究證據(jù)指導(dǎo)臨床實(shí)踐,診斷治療以個(gè)體為基礎(chǔ)，更加提前、具體與精確,分子時(shí)代,肺腺癌：EGFRKRASBRAFALK-ROS1RET等檢測(cè)已是共識(shí)； 肺鱗癌發(fā)生模式不同，檢測(cè)靶標(biāo)以擴(kuò)增為主，同時(shí)EGFR、ALKROS1某些病例也有必要檢測(cè),我們可以用的分子生物學(xué)手段,實(shí)時(shí)熒光PCR方法（擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)法（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、PCR-高分辨

2、溶點(diǎn)曲線分析（HRM）、數(shù)字PCR等） PCR-雜交法（膜上、芯片基因芯片 、乳膠顆粒Luminex） PCR-Sanger測(cè)序 PCR-焦磷酸測(cè)序 新一代高通量測(cè)序 PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等 熒光原位雜交（FISH） 直接雜交 免疫組化,分子病理檢測(cè)的主要方法,檢測(cè)技術(shù),檢測(cè)對(duì)象,檢測(cè)基因,檢測(cè)水平,EGFR，KRAS，BRAF， BRCA, BCR-ABL，JAK2,EML4-ALK，ROS1，HER2， RET,BRCA1，TOP2A，TYMS,EGFR，EML4-ALK， HER2,是RT-PCR平臺(tái)上的特異擴(kuò)增技術(shù)（易開(kāi)展） 共發(fā)表300多篇文獻(xiàn) 著名的大型臨床研究

3、- 如IPASS、INFORM等,國(guó)際肺癌協(xié)會(huì)專(zhuān)家共識(shí)中國(guó)基因突變檢測(cè)專(zhuān)家共識(shí)日本臨床專(zhuān)家共識(shí),ARMS技術(shù)被臨床證明的腫瘤基因突變檢測(cè)技術(shù),DNA 基因重排,融合mRNA或5/3 mRNA差異表達(dá),嵌合蛋白表達(dá),肺癌中ALK基因變異的表達(dá)調(diào)控,FISH/CISH NGS,RT-PCR 5/3比較qRT-PCR RACE-PCR,IHC,熒光原位雜交技術(shù)（FISH,2個(gè)信號(hào)分離直徑的要求，使實(shí)際應(yīng)用中結(jié)果難以判斷 有5-11%出現(xiàn)假陽(yáng)性信號(hào)分離1，2，3 工作強(qiáng)度大，費(fèi)時(shí) 主觀性強(qiáng)，受人為因素影響大,橫向,縱向,1. FISH技術(shù)是美國(guó)藥物臨床試驗(yàn)中所采用的檢測(cè)方法。 2. 采用“分離”分析，

4、基因倒位和ALK重排后，紅色和綠色探針?lè)珠_(kāi) 3. 15%的樣本細(xì)胞中呈現(xiàn)分開(kāi)的紅色和綠色信號(hào)表示陽(yáng)性結(jié)果1,操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短 結(jié)果客觀，易于判讀，減少人為因素的影響 除FFPE樣本外，還適用其他類(lèi)型樣本組織1 與EGFR、RET、ROS1等其他檢測(cè)不沖突，共用相同組織切片和PCR擴(kuò)增程序，節(jié)約有限資源和時(shí)間 中國(guó)熒光PCR儀器普及率更高，更加適合國(guó)情,實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄法（Real Time-PCR,CFDA批準(zhǔn)的基因檢測(cè)產(chǎn)品,基于Real Time-PCR方法檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因的分子診斷產(chǎn)品獲得CFDA批準(zhǔn)最多,2-3 片F(xiàn)FPE樣品 同時(shí)將DNA和RNA分離出來(lái) 同時(shí)獲得EGFR、ALK和ROS1檢測(cè)結(jié)

5、果,節(jié)約樣本、節(jié)約時(shí)間、節(jié)約成本,DNA/RNA,EGFR突變型,ALK陽(yáng)性 或ROS1陽(yáng)性,EGFR野生型 ALK陰性 ROS1陰性,吉非替尼 厄洛替尼 ?？颂婺?阿法替尼,克唑替尼 色瑞替尼,其他治療方式,DNA/RNA共分離劑盒,EGFR/ALK+ROS1,2.5小時(shí)PCR,4.5小時(shí),FFPE切片1-3片 或活檢小標(biāo)本,2015 NSCLC NCCN指南,對(duì)于NSCLC患者建議檢測(cè)EGFR和ALK基因狀態(tài)； 對(duì)于ROS1/MET/RET/BRAF/ HER2等嶄露頭角的靶基因也給予關(guān)注,1.室內(nèi)質(zhì)量控制 2.室間質(zhì)量評(píng)價(jià),分子病理實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制,1.建立標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室 2.具備資質(zhì)且

6、相對(duì)固定的人員 3.性能穩(wěn)定的試劑 4.持續(xù)不斷的學(xué)習(xí)和開(kāi)展質(zhì)控,醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號(hào)） 醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)展檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號(hào),FISH實(shí)驗(yàn)區(qū),臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 標(biāo)準(zhǔn)化操作文件（sop,1.寫(xiě)你所做 2.做你所寫(xiě) 3.實(shí)驗(yàn)室的精髓,可操作性的sop文件,人員資質(zhì),理想的試劑,試劑方法的性能驗(yàn)證及每批試劑的質(zhì)檢 性能指標(biāo)： 重復(fù)性（精密度） 準(zhǔn)確性（定量：回收率、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等；定性：方法學(xué)比較等） 線性范圍（定量） 分析特異性 測(cè)定下限 抗干擾能力,資質(zhì)認(rèn)證 試劑質(zhì)量 試劑反應(yīng)性能 前后批號(hào)結(jié)果一致性 測(cè)定下限 批內(nèi)變異（10%)和批間變異（15-25,你其實(shí)做了這些，但是你有記錄么,1.日常維護(hù) 2.定期保養(yǎng) 3.維修記錄,實(shí)驗(yàn)室最忠實(shí)的員工-儀器,全流程：標(biāo)本接收-石蠟切片-核酸提純-實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增-結(jié)果分析 分析前：標(biāo)本接收、制片、填寫(xiě)檢測(cè)申請(qǐng)單 分析中：核酸提取、擴(kuò)增、產(chǎn)物分析、檢測(cè)有效性判斷 分析后：結(jié)果分析、報(bào)告審核、結(jié)果解釋 標(biāo)準(zhǔn)：重復(fù)，可控，規(guī)范,全流程室內(nèi)質(zhì)控,DNA模板質(zhì)量更重要，建議對(duì)提取的DNA模板進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)： OD260/OD280=1.80.2， OD260/OD2301.7,全流程