培養(yǎng)細胞的基本特征.ppt

1、組織培養(yǎng)教學參考書,組織培養(yǎng)和分子細胞學技術，鄂征，北京出版社 體外培養(yǎng)的原理與技術，薛慶善，科學出版社,細胞培養(yǎng)是動物細胞工程的基礎,Introduction to Cell andTissue CultureTheory and Technique,Section 1：培養(yǎng)細胞的生物學特征,動物細胞與組織培養(yǎng)基本概念 動物細胞與組織培養(yǎng)發(fā)展歷史 動物細胞特點及其體外培養(yǎng)特性,一、動物細胞與組織培養(yǎng)基本概念,通稱的動物組織培養(yǎng)(ATC - Animal tissue culture,1）究竟在培養(yǎng)什么,體外培養(yǎng)（In Vitro） 組織培養(yǎng)（Tissue Culture） 細胞培養(yǎng)（Cell

2、 Culture ） 器官培養(yǎng)（Organ Culture,分類: 組織培養(yǎng)(Tissue Culture) 指的是從體內取出組織，在模擬體內生理環(huán)境，無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結構和功能的方法 細胞培養(yǎng)(Cell Culture) 培養(yǎng)物是單個細胞和細胞群 器官培養(yǎng)（Organ Culture） 培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法,體外培養(yǎng)細胞的目的是什么？應用價值,體外培養(yǎng)細胞與體內細胞有否差異,研究體內相應器官、組織和細胞的正常和異常生命活動,增殖方式相同：有絲分裂 差異的關鍵：細胞的分化,人工模擬條件與體內環(huán)

3、境的差異,失去了神經體液調節(jié)和細胞間相互作用，缺乏動態(tài)平衡,2）傳代與原代培養(yǎng),傳代：（subculture） 體外培養(yǎng)細胞生存空間和營養(yǎng)有限，當細胞增殖達到一定密度后，需要分出一部分細胞或更新培養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。 原代培養(yǎng)（primary culture） 取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng),3）代與細胞周期,代（subculture generation）：指從細胞分離接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間；通常細胞要分裂35次，傳一次即一代。 細胞世代（generation）：一個cell cycle,原代培養(yǎng)細胞的生命歸宿 培養(yǎng)細胞的生

4、命期 (life span of culture cells,原代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期,有限細胞系？ 無限細胞系,原代培養(yǎng)期,也稱初代培養(yǎng)期，指從體內取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的階段，一般持續(xù)14周。此期細胞移動比較活躍，可見細胞分裂，但不旺盛。 初代培養(yǎng)細胞與體內原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質的（Heterogeneous），也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。 初代培養(yǎng)細胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細胞和體內細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象,傳代期,原代細胞生長一定時間后，貼壁型細胞就會連接成片而鋪滿瓶底，需要將原代細胞分開至多個新的培養(yǎng)瓶中

5、，這個過程叫傳代。傳代后的細胞稱細胞系（初代培養(yǎng)細胞一經傳代后便改稱做細胞系（Cell Line） 。 此期的細胞系生長過程中持續(xù)時間最長，細胞增殖旺盛并維持二倍體核型。 為保持二倍體細胞性質，細胞應在原代培養(yǎng)或傳代后早期凍存,此期細胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化（Spontaneous Transformation）。 轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的

6、細胞群體稱無限細胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細胞系（Continuous Cell Line）。 無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）.細胞轉化亦可用人工方法誘發(fā)，轉化后的細胞也可能具有惡性性質,衰退期,培養(yǎng)細胞生命期,每代細胞的生長過程,所有體外培養(yǎng)的細胞包括原代培養(yǎng)和各種細胞系（株），生長達到一定的密度后都要做傳代處理。傳代的頻率和間隔與接種細胞數(shù)量、細胞生物學性質以及營養(yǎng)液性質等有關。 細胞一代指從細胞培養(yǎng)接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。每代細胞一般要經過三個生長階段：潛伏期、指數(shù)生長期和停

7、止期,細胞接種擴新的培養(yǎng)器皿后，胞質回縮，胞體五圓球形，先懸浮于培養(yǎng)液中，稍后開始附著于底物，逐漸恢復原來的狀態(tài)。 此時細胞具有代謝及運動功能，但無增殖發(fā)生。以后出現(xiàn)細胞分裂并逐漸增多而進入指數(shù)生長期,潛伏期,指數(shù)生長期,又稱對數(shù)期，此期細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，適用于進行實驗研究。 一般可持續(xù)35d,停止期,又稱平臺期，此期細胞已將其支持物表面占滿，細胞活力減弱，已不再進行分裂增殖。 此時應進行傳代培養(yǎng)，將細胞接種到新的培養(yǎng)器皿中，開始再次繁殖，進入新的一代,停止期,細胞一代,4）細胞系,細胞系（cell line） 初（原）代培養(yǎng)物第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。 有限細胞

8、系（finite cell line） 細胞系的生存期有限，不能連續(xù)傳代培養(yǎng)，大多為二倍體細胞。（Hayflick界限） 無限（連續(xù)）細胞系（infinite cell line） 已獲得無限增殖能力能持續(xù)生存、連續(xù)傳代的細胞系。大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型,5）細胞轉化（transformation,細胞轉化 正常細胞在致變因素作用下，發(fā)生了遺傳型改變和表型的變化（涉及DNA或基因的改變）。細胞發(fā)生轉化后的性狀可代代相傳。 可分為：自發(fā)轉化（原因不明） 人工誘變（物理、化學、生物誘變劑） 一般轉化：細胞獲得不死性，尚無惡性 惡性轉化：有致瘤性 不僅能自主增殖，還呈現(xiàn)侵襲性生長和轉移性,細胞

9、轉化或基因突變不一定就是癌變,6）細胞克隆與細胞株,細胞克?。╟ell clone） 由單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體。 細胞株（cell strain ） 通過選擇法或克隆形成法，從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的穩(wěn)定的具有特殊性質或標志的培養(yǎng)物。 如：溫度敏感突變株,Section 1：培養(yǎng)細胞的生物學特征,動物細胞與組織培養(yǎng)基本概念 動物細胞與組織培養(yǎng)發(fā)展歷史 動物細胞特點及其體外培養(yǎng)特性,二、動物細胞與組織培養(yǎng)發(fā)展歷史,動物細胞培養(yǎng)之創(chuàng)始,1907，美國的哈里森使用蓋玻片懸滴培養(yǎng)蛙胚神經組織細胞,蛙胚延髓組織 培養(yǎng)在青蛙淋巴凝塊內,1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經

10、板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個術語。 1907年Harrison 和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動物細胞的培養(yǎng)。 由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學研究中的應用，如抗病毒疫苗的生產等，現(xiàn)已經逐漸發(fā)展成為一門精細技術。許多細胞株、細胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細胞系，如HeLa細胞系（Gay，1952），可用來進行一系列研究，更加促進了組織培養(yǎng)技術的發(fā)展,理化環(huán)境可控制。 細胞經培養(yǎng)后形成的細胞系和細胞株，特征均一。 培養(yǎng)物可直接被觀測。 提供大量均一的細胞供制備用。 便于進行人工篩選。 結合電影技術，可觀察細胞代謝活動和反應。 廣泛應

11、用于病毒學，免疫學，遺傳學，腫瘤學，分化及發(fā)育，細胞毒理試驗，生物技術等各個領域,細胞培養(yǎng)的優(yōu)點,細胞培養(yǎng)的缺點,現(xiàn)人工模擬體內環(huán)境的技術已經很高, 但, 人工所模擬的條件與體內實際情況 仍不完全相同. 當細胞被置于體外培養(yǎng)后, 生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中, 久了，必然發(fā)生變化,與體內主要不同 相對孤立、相對單一 缺乏體內的系統(tǒng)作用、失去神經體液的調節(jié) 和細胞相互間的影響,主要表現(xiàn) 失去原有組織結構和細胞形態(tài) 分化減弱或不顯；細胞趨向單一化； 提示 要正確認識體外培養(yǎng)細胞 是一種特定條件下生長的細胞群體,Section 1：培養(yǎng)細胞的生物學特征,動物細胞與組織培養(yǎng)基本概念 動物細胞與組織培養(yǎng)發(fā)

12、展歷史 動物細胞特點及其體外培養(yǎng)特性,三、動物細胞特點及其體外培養(yǎng)特性,1. 體外培養(yǎng)細胞的生長條件,環(huán)境無毒和無菌； 適宜的溫度；人和哺乳動物培養(yǎng)細胞最適溫度均為3537。 氣體環(huán)境和氫離子濃度；需要一定量的O2（19959975pa）和CO2（95空氣+5%CO2）；pH7.2-7.4 滲透壓；260320mOsm/kg適用于大多數(shù)細胞 營養(yǎng)物質；六碳糖是主要的能源物質，還需要12種基本氨基酸和谷胺酰胺等,2.體外培養(yǎng)細胞的分型,根據(jù)形態(tài)特征分類 貼壁型 上皮細胞型 成纖維細胞型 游走細胞型 多形細胞形 懸浮型 懸浮在溶液中,體外細胞培養(yǎng)物的生長類型,按生長方式：主要分兩型 1）貼附型細胞

13、:附著在某一固相支持物表面才 能生長的細胞。 2）懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而 在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。 絕大多數(shù)有機體細胞屬貼附型細胞， 只有少數(shù)細胞類型如某些腫瘤細胞和白細胞 可在懸浮狀態(tài)下生長,貼附是有機體細胞在體內生存和生長發(fā)育的基本方式，包括細胞與細胞之間的相互接觸和細胞與細胞外基質之間的相互接觸兩種方式。體外培養(yǎng)時大多數(shù)細胞仍然保持了這種特性，必須貼附在一定的支持物上才能生長。 根據(jù)體培養(yǎng)細胞在支持物上貼附生長時的形態(tài)，大致分為四種類型：包括上皮細胞型（epithelium）、成纖維細胞型（fibroblast）、游走細胞型（wandering）、多形細胞（poly

14、morphiet,1）貼壁依賴型（貼壁細胞,細胞培養(yǎng)時呈扁平的不規(guī)則多角形，中央有圓形核，生長時常彼此緊密連接成單層細胞片，如皮膚表皮細胞、肝細胞、胰臟細胞和肺泡上皮細胞的培養(yǎng)細胞,上皮細胞,細胞貼壁后呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有圓形核，胞質向外伸出23個長短不同的突起，生長時呈放射狀或火焰狀。除真正的成纖維細胞外，心肌、成骨肌細胞培養(yǎng)時均屬這一類型,成纖維細胞型,細胞質常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，貼附于支持物上散生，一般不連接成片。單核細胞、巨噬細胞及某些腫瘤細胞在體外培養(yǎng)常呈現(xiàn)此種形態(tài),游走細胞型,多形型細胞,生長時像神經細胞呈多角形，并伸出較長的神經纖維，很難確定它們的形狀

15、。體外培養(yǎng)時常見的多形型細胞是神經元和神經膠質細胞,也稱非貼壁型，這類細胞培養(yǎng)時不貼附于支持物上，可在培養(yǎng)液中懸浮生長。來源于血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤細胞等均屬于此類，細胞一般呈球形,2）懸浮型,優(yōu)點 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化)； 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點 觀察不方便； 很多細胞不能懸浮生長,3）兼性貼壁細胞,動物細胞培養(yǎng)中，有些細胞呈現(xiàn)雙重性，既可以貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)，如中國地鼠卵巢細胞、小鼠L929細胞等,貼附生長型細胞的形態(tài)不穩(wěn)定,條件改變，細胞形態(tài)可有變化,培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定 血清 Hela 高血清 低血清 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 pH Hela

16、太酸或太堿 標準pH 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 細胞密度 3T3 低密度 高密度 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 生長狀態(tài)改變 懸浮或貼附 懸浮 貼附 圓形 成纖維或上皮樣 轉化與否 未轉化 轉化后 成纖維樣 可成上皮樣,3、體外培養(yǎng)細胞的生長特點,1）貼附,細胞貼壁過程,2）接觸抑制和密度抑制,定義：細胞從接種到長滿底物表面后，由于細胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加,4、培養(yǎng)細胞的生長與增殖過程,1）單個細胞的生長過程,2）細胞系的生長過程,原代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期,培養(yǎng)群體細胞的生命期,3）每代細胞的生長過程,潛伏期（Latent phase）： 細胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間。 二倍體

17、細胞該期時間長（2496h）； 連續(xù)細胞系時間短（1030min,細胞附著于底物上，游離期 結束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等 血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著,指數(shù)生長期（Logarthmic growth phase）： 細胞增殖最旺盛時期，一般用細胞分裂指數(shù)（Mitotic index，MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)介于0.10.5%，且受細胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響,細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究,指數(shù)生長期是細胞活力最好的時期，在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長期持續(xù)3-5d后，隨細胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制（Contact inhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細胞標志之一。 癌細胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細胞代謝產物的影響而發(fā)生密度抑制（Density inhibition,停止期（平臺期,細胞達飽和密度, 可存活 仍有代謝活動，但基