凝固酶陰性葡萄球菌

1、1,凝固酶陰性葡萄球菌 致病性分子標(biāo)志物的建立與應(yīng)用,2,1、立題依據(jù),凝固酶陰性葡萄球菌（CoNS）廣泛存在于人體皮膚、黏膜等組織表面，常在血液、痰液、尿液、深靜脈置管等各種標(biāo)本中檢出。 文獻(xiàn)報(bào)道，1995-1996年美國(guó)48個(gè)醫(yī)學(xué)中心2596份血標(biāo)本中， CoNS的分離率達(dá)32.2%。 盡管血液等無(wú)菌體液培養(yǎng)出CoNS臨床意義較大，但據(jù)報(bào)道單次血培養(yǎng)CoNS污染的可能性仍高達(dá)85,第一部分 研究背景和意義,3,近年來(lái)由于介入性診療操作、免疫抑制劑及廣譜抗生素的廣泛使用，CoNS已成為院內(nèi)感染的重要病原菌，而且耐藥菌株比金黃色葡萄球菌更為多見(jiàn)。 葉聯(lián)華等報(bào)道人工瓣膜術(shù)后心內(nèi)膜炎中，約有40%

2、-50%由凝固酶陰性葡萄球菌引起； 2009年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果MRCoNS檢出率平均為71.7%,大于MRSA的52.7,研究背景和意義,4,CoNS 作為皮膚黏膜定植菌，在越來(lái)越多的標(biāo)本中被分離出來(lái)，常常引起臨床困惑。其是否能作為感染的病原菌是臨床關(guān)心的問(wèn)題。 有鑒于此，實(shí)驗(yàn)室建立對(duì)CoNS污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是臨床明確診斷和制定合理治療方案的重要前提,研究背景和意義,5,CoNS致病物質(zhì),在 CoNS 感染的發(fā)病過(guò)程中，細(xì)菌先黏附繼而形成難以清除的生物膜是其最為重要的致病機(jī)制 ； 其中CoNS產(chǎn)生的多糖胞間黏附素（polysacchatide intercel

3、lular adhesion，PIA）是細(xì)菌生物膜形成聚集階段所必需的物質(zhì)，在感染過(guò)程中起重要的作用，是鑒定其致病性的物質(zhì)基礎(chǔ)。 Heilmann 等發(fā)現(xiàn) ica 操縱子對(duì)合成 PIA 以及在細(xì)菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用,研究背景和意義,6,ica 基因結(jié)構(gòu),ica 基因座定位于細(xì)菌染色體，全長(zhǎng) 3.4 kb，包括 icaR 調(diào)節(jié)基因及串聯(lián)存在的 icaA、icaD、icaB 和 icaC 結(jié)構(gòu)基因。 其中，icaADBC 4 個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)操縱子，可以通過(guò)檢測(cè) icaADBC 基因來(lái)反映ica 操縱子的存在。 icaB 不直接參與胞間黏附素的合成,因?yàn)橹亟MicaADC 就能使細(xì)胞

4、積聚； icaA 單獨(dú)呈現(xiàn)低的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性； icaC涉及到把不斷合成的多糖物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面； 生物膜的形成要求icaD編碼的產(chǎn)物具有最佳活性。 因此,我們選擇了icaD 作為本試驗(yàn)的目的基因片段,研究背景和意義,7,獲得CoNS特異的致病性分子標(biāo)志物； 確立敏感、準(zhǔn)確、快速的醫(yī)院感染相關(guān)性CoNS特異基因診斷方法； 能夠準(zhǔn)確鑒定致病性與非致病性CoNS,研究背景和意義,2、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?8,研究CoNS的生物標(biāo)志物對(duì)該菌在醫(yī)院獲得性感染中的臨床微生物學(xué)診斷與鑒定，追蹤傳染源，探索其在醫(yī)院感染中的確切作用和地位、傳播與感染規(guī)律，從而對(duì)控制傳播途徑、建立準(zhǔn)確有效的防治措施具有重要實(shí)際意

5、義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,研究背景和意義,3、臨床意義,9,陰性對(duì)照：表皮葡萄球菌ATCC12228，購(gòu)自中國(guó)藥品鑒定所，經(jīng)基因組測(cè)序證明其ica操縱子缺失 ； 陽(yáng)性對(duì)照：表皮葡萄球菌1-97-337，瑞金醫(yī)院倪語(yǔ)星教授惠贈(zèng)，含有完整ica操縱子； 待測(cè)樣本：自2006年1月至2007年9月，收集我院臨床各科室共114例疑是感染性標(biāo)本,第二部分 材料和方法,1、研究對(duì)象,10,2、主要試劑,培養(yǎng)基： 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、 剛果紅瓊脂 培養(yǎng)基、 LB肉湯增菌液。 引物： SodA引物 （ 5-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3 及 5-ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRT

6、C-3）； icaD引物 （5-AGGCAATA TCCAACGGTAA-3及 5-GTCACGACCTTTCTTATATT-3）； 16S rDNA 引物 （5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3及 5-CCGTCAATTCCATTTRAG TTT-3,材料和方法,11,3、主要儀器設(shè)備,PCR儀：PTC100 PCR儀，美國(guó)MJ Research Inc.； 恒壓恒流電泳儀、電泳槽：DF-C型，北京東方特力科貿(mào)中心； 凝膠成像系統(tǒng)：GDS8000 ，美國(guó)UVP Inc.； 核酸/蛋白定量?jī)x：DU640，美國(guó)Beckman； 酶標(biāo)儀：美國(guó)雷杜，深圳組裝； ATB Expressio

7、n：法國(guó)bioMrieux Inc； 生物安全柜：BSC-1500 B2，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司； 全自動(dòng)快速微生物培養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng)：BacT/ALERT 3D 60，法國(guó)bioMrieux Inc,材料和方法,12,4、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法,標(biāo)本采集,陰、陽(yáng)性對(duì)照,菌種鑒定,PIA檢測(cè),PCR擴(kuò)增,icaD基因,sodA基因,16SrDNA序列,生物膜形成實(shí)驗(yàn),DNA測(cè)序、 生物信息學(xué)分析,確定特征片段,臨床驗(yàn)證,比較分析,材料和方法,13,圖2.1： 部分樣品剛果紅試驗(yàn)結(jié)果,3,4,1、剛果紅試驗(yàn),第三部分 結(jié)果和討論,14,表2.1: 114例CoNS的菌種組成及剛果紅試驗(yàn)結(jié)果,結(jié)果和討論,1

8、5,剛果紅試驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)48h后菌落的顏色變化來(lái)反映 CoNS 表達(dá)多糖胞間黏附素的情況，進(jìn)而間接地反映其致病性。 114例樣品中剛果紅試驗(yàn)陽(yáng)性率21.1%，由于CoNS分泌的PIA在培養(yǎng)過(guò)程中可以丟失，使陽(yáng)性結(jié)果偏低；另外，其方法學(xué)本身易于受多種因素影響，比如：蔗糖的濃度、氯化鈉和瓊脂的濃度、氣體條件等，干擾了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性，不能滿(mǎn)足臨床要求,結(jié)果和討論,16,2、ica D基因片段的擴(kuò)增,圖2.2 ：部分樣品的icaD基因片段的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果,結(jié)果和討論,17,表2.2: 114例CoNS不同菌種icaD片段PCR擴(kuò)增的結(jié)果,結(jié)果和討論,18,結(jié)果和討論,19,圖2.3 : 部分樣品的

9、定性黏附性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,3、體外黏附性實(shí)驗(yàn),結(jié)果和討論,20,表2.4 : 9例icaD（ + ）菌株半定量黏附性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,結(jié)果和討論,21,通過(guò)體外半定量黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)得88.9%（8/9）icaD（ + ）菌株是粘附株。 可見(jiàn)以半定量黏附試驗(yàn)結(jié)果作為生物膜形成能力的判定標(biāo)準(zhǔn)，ica 操縱子的存在與CoNS粘附及其生物膜形成密切相關(guān)。 體外黏附性實(shí)驗(yàn)用光吸收原理檢測(cè)生物膜成分，但生物膜本身的結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞；且由于方法比較復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件才能獲得較好的重復(fù)性，不適合臨床常規(guī)應(yīng)用,結(jié)果和討論,22,4、16S rDNA及sodA基因片段擴(kuò)增,圖2.5：部分樣品的16S rDNA片段 PCR擴(kuò)增

10、結(jié)果,結(jié)果和討論,23,圖2.6： 部分樣品的sodA 片段PCR 擴(kuò)增結(jié)果,結(jié)果和討論,24,圖7： 部分樣品sodA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序圖譜,結(jié)果和討論,25,37例CoNS樣品進(jìn)行了16S rDNA基因及sodA基因片段的PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示全部樣品均能準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)的片段，其片段大小分別為16S rDNA 926bp及sodA 482bp，且均為單一條帶； 序列測(cè)定表明所有樣品16S rDNA 及sod A PCR產(chǎn)物序列均相同，未發(fā)現(xiàn)與感染相關(guān)的特異性分子序列,結(jié)果和討論,26,ica操縱子可出現(xiàn)在多種CoNS中，臨床實(shí)驗(yàn)室建立并常規(guī)進(jìn)行CoNS致病性分子標(biāo)志物的檢測(cè)方法是有意義、有必要的； 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們確立了的敏感、準(zhǔn)確、快速的醫(yī)院感染相關(guān)性CoNS基因診斷新方法，即ica D基因擴(kuò)增方法,第四部分 結(jié)論,27,結(jié)論,本研究首次報(bào)道了除表皮葡萄球菌以外的其他種的凝固酶陰性葡萄球菌產(chǎn)生多糖胞間粘附因子的情況； 表皮葡萄球菌在臨床CoNS中檢出最多，是攜帶icaD操縱子的主