基因功能的研究方法

1、第十章.基因功能的研究方法（一）,一、計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)基因功能 二、實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能 1基因失活是功能分析的主要手段 1.1 基因敲除（Gene knock-out） 1.2 基因敲除的技術(shù)路線 1.3 基因敲除的主要應(yīng)用領(lǐng)域及國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 1.4 基因失活的表型效應(yīng)有時(shí)不易分辨 2轉(zhuǎn)座子突變庫的構(gòu)建 2.1 插入序列 2.2 實(shí)驗(yàn)步驟,3內(nèi)含子歸巢突變 4基因的超表達(dá)用于功能檢測(cè) 5. 反義RNA 5.1 反義RNA的分類和作用機(jī)制 5.2 ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA ) 5.3 反義RNA的功能 5.3.1 調(diào)控細(xì)菌基因

2、的表達(dá) 5.3.2 噬菌體溶菌/溶源狀態(tài)的控制 5.3.3 IS10轉(zhuǎn)位作用的抑制 5.4 人工合成構(gòu)建反義RNA 5.5 使反義RNA分子穩(wěn)定的方法,三、其他的基因功能研究方法 噬菌體展示(phage display) 酵母雙雜交 (yeast two-hybridization) 2.1 概念 2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 2.3 利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能 2.4 利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用 2.5 利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響 2.6 利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖(Genome Protein Linkage Ma

3、p） 3. 開放讀框順序標(biāo)簽(open-reading-frame sequence tags,OSTs）,確認(rèn)DNA順序中的基因序列后，下一個(gè)問題就是探知其功能，這是基因組研究的一個(gè)難度很大的領(lǐng)域。 一些已完成測(cè)序的基因組順序分析表明，我們所了解的基因組內(nèi)容比真實(shí)的情況少的多。如大腸桿菌與啤酒酵母，在未開始基因組測(cè)序前已經(jīng)完成了大量常規(guī)的遺傳學(xué)分析，當(dāng)時(shí)遺傳學(xué)家認(rèn)為這2種生物的大多數(shù)基因已經(jīng)通過突變鑒定，但實(shí)際上還有很多空白。 大腸桿菌編碼蛋白質(zhì)的4288個(gè)基因中，以往知道的只有1853個(gè)，僅占43%。至于啤酒酵母，所知更少，僅為30%。,一、計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)基因功能,計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)基因功能的依據(jù)仍然

4、是同源性比較。同源基因都有1個(gè)共同的祖先基因，他們之間有許多相似的順序。同源基因可以分為2類：,種間同源基因或直系基因(orthologous gene) 這是指不同物種之間的同源基因，它們來自物種分隔之前的同一祖先。 種內(nèi)同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一種生物內(nèi)部的同源基因，它們常常是多基因家族的不同成員，其共同的祖先基因可能存在于物種形成之后，也可能出現(xiàn)于物種形成之前。 同源基因一般不會(huì)有完全一致的核苷酸順序，因?yàn)檫@兩個(gè)基因在出現(xiàn)后獨(dú)立的發(fā)生隨機(jī)突變，但它們有相似的順序組成，大部分未突變的核苷酸位置是相同的。 當(dāng)一個(gè)新的基因序列被確認(rèn)后，根據(jù)同源性可從數(shù)據(jù)庫中查找

5、已知順序的同源基因。根據(jù)進(jìn)化的相關(guān)性可從已知的同源基因推測(cè)新基因的功能。,根據(jù)同源性預(yù)測(cè)基因時(shí)必需注意以下幾點(diǎn)：,一般認(rèn)為aa的一致性或相似性在25%以上可視為同源基因； 同源性與相似性的含義不同，如aa順序的80%的相似性不能稱為同源性。 一致性常指同一位置同一aa在整個(gè)多肽序列中所占的比例，而相似性除一致性aa外還包括可取代aa的成員，因此相似性aa的比例總是高于一致性aa。,同源性分析可以給出整個(gè)基因或某一區(qū)段功能的信息,同源查詢除了直接比較DNA順序外，還可將DNA順序翻譯為aa順序。由于組成蛋白質(zhì)的aa有20多種，而DNA核苷酸只有4種，因此aa順序的差異要比核苷酸的差異大的多。 以

6、aa順序進(jìn)行同源性比較的結(jié)果更為準(zhǔn)確，也更加可行。已有許多軟件可用于這項(xiàng)分析，常用的是BLAST。研究者只要將資料以正確格式的電子郵件發(fā)送到DNA資料庫BLAST服務(wù)站，很快就會(huì)得到回音。,有時(shí)在2個(gè)無明顯親緣關(guān)系的基因之間會(huì)出現(xiàn)局部相似的區(qū)段。這種情況表明，2個(gè)無親緣關(guān)系的蛋白質(zhì)可能具有相似的功能，相似的順序是功能的核心區(qū)域。 雖然基因本身無共同的祖先，但其功能域卻有共同的起源。它們都是古老祖先的后裔，在進(jìn)化中一方面發(fā)生獨(dú)立突變，另一方面又因基因組重排成為新基因的組成部分。例如信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，這類蛋白質(zhì)一般都有2個(gè)基本的功能域，即接受信號(hào)的功能域和傳達(dá)信號(hào)的激酶域。,二、實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能,同源

7、性分析并非萬靈藥方，對(duì)許多新基因的功能分析還必需依賴其他的實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行補(bǔ)充，并將同源性研究的結(jié)果進(jìn)一步外延。 如何確定一個(gè)基因的功能是基因組計(jì)劃中最困難的問題之一。 大多數(shù)分子生物學(xué)家認(rèn)為現(xiàn)有的技術(shù)與策略對(duì)于從基因組測(cè)序所獲得的大量未知基因的功能研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。 基因的功能是一個(gè)過程，是從基因到表型的一系列反應(yīng)。 傳統(tǒng)的遺傳分析是從表型出發(fā)最終到達(dá)基因； 現(xiàn)在的基因功能研究是從基因出發(fā)直接推導(dǎo)表型。因此必須尋找一系列的實(shí)驗(yàn)方法來鑒別與目標(biāo)基因相關(guān)的表型。,1基因失活是功能分析的主要手段 傳統(tǒng)的遺傳分析主要借助突變型研究表型變異的遺傳基礎(chǔ)，利用紫外線誘導(dǎo)及化學(xué)試劑處理可使生物群體產(chǎn)生突變個(gè)體，

8、也可從自然的群體中發(fā)現(xiàn)突變體。 經(jīng)遺傳分析將突變基因定位，然后觀察這一突變體是否與改變的表型對(duì)應(yīng)。在此基礎(chǔ)上采用分子生物學(xué)方法進(jìn)一步分離與克隆目標(biāo)基因。,所謂定位克隆就是根據(jù)與突變位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，然后通過物理圖尋找靶位點(diǎn)。 上述傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析的原理同樣可用來設(shè)計(jì)從基因到表型的研究。如果我們能找到某種方法，根據(jù)待測(cè)基因的順序使生物體內(nèi)該基因失活，亦可鑒別由此產(chǎn)生的表型變異。,1.1 基因敲除（Gene knock-out） 概念：基因敲除除可中止某一基因的表達(dá)外，還包括引入新基因及引入定點(diǎn)突變。 即可以是用突變基因或其它基因敲除相應(yīng)的正?；颍部梢杂谜；蚯贸鄳?yīng)的突變基因。,基因敲除是

9、80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)。80年代初，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。 1985年，首次證實(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。 到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。此后的幾年中，基因敲除技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展和完善。,1.2 基因敲除的技術(shù)路線如下： 構(gòu)建重組基因載體； 用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)； 用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞； 將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長(zhǎng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。,Note: 基因敲除的靶

10、細(xì)胞目前最常用的是小鼠ES細(xì)胞?；蚯贸募夹g(shù)路線雖不復(fù)雜，但由于高等真核細(xì)胞內(nèi)外源DNA與靶細(xì)胞DNA序列自然發(fā)生同源重組的機(jī)率非常低，約為百萬分之一，要把基因敲除成功的細(xì)胞篩選出來是一件非常困難的工作。因此，同源重組的篩選和檢測(cè)就成了基因敲除技術(shù)所要解決的關(guān)鍵問題。 目前已有多種篩選方法，其中1988年猶它大學(xué)的Capecchi教授的研究組發(fā)展的正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)適用范圍寬且效率較高。,1.3 基因敲除主要應(yīng)用領(lǐng)域及國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 基因敲除的應(yīng)用領(lǐng)域主要有： 建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料； 改造動(dòng)物基因型，鑒定新基因和/或其新功能； 治療遺傳?。?改造生物、培育新的生物品

11、種。,ES細(xì)胞基因敲除途徑建立轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的成熟，首次使體外精細(xì)的基因操作與小鼠的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育和生命過程得到了直接的結(jié)合，為探討高等動(dòng)物基因組結(jié)構(gòu)和功能提供了有效的方法。 由基因敲除技術(shù)產(chǎn)生出的特殊小鼠已經(jīng)對(duì)哺乳類生物學(xué)的各領(lǐng)域，包括發(fā)育生物學(xué)、癌生物學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和人類遺傳學(xué)產(chǎn)生了極大影響。 理論上，基因敲除可適用于任何能產(chǎn)生ES細(xì)胞的物種，將來可在小鼠基因敲除成熟的基礎(chǔ)上開展其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因敲除工作。,建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料 基因敲除小鼠是研究疾病的發(fā)生機(jī)理、分子基礎(chǔ)及診斷治療的重要實(shí)驗(yàn)材料。如1989年囊性纖維化病（CF）的致病基因（CFTR）被成功

12、地克??；1992年成功建立了CFTR基因的基因敲除的CF小鼠模型，為CF基因治療提供了很好的動(dòng)物模型，得以順利通過了基因治療的動(dòng)物試驗(yàn)；于1993年開始臨床試驗(yàn)并獲得成功。,改造動(dòng)物基因型，鑒定新基因和/或其新功能，研究發(fā)育生物學(xué) 深入研究基因敲除小鼠在胚胎發(fā)育及生命各期的表現(xiàn)，可以得到詳細(xì)的有關(guān)該基因在生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，為研究基因的功能和生物效應(yīng)提供模式。 例如，目前人類基因組研究多由新基因序列的篩選檢測(cè)入手，進(jìn)而用基因敲除法在小鼠上觀察該基因缺失引起的表型變化。目前已報(bào)道了多種學(xué)習(xí)、記憶以及LTP、LTD 有缺陷的基因敲除動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)多種基因在學(xué)習(xí)、記憶的形成過程中必不可少。,治療遺傳病 這

13、包括去除多余基因或修飾改造原有異?；蛞赃_(dá)到治療的目的。 改造生物、培育新的生物品種 細(xì)菌的基因工程技術(shù)是本世紀(jì)分子生物學(xué)史上的一個(gè)重大突破，而基因敲除技術(shù)則可能是遺傳工程中的另一重大飛躍。這項(xiàng)新技術(shù)在基礎(chǔ)理論研究及實(shí)際應(yīng)用中都將有著廣闊的應(yīng)用前景。,1.4 基因失活的表型效應(yīng)有時(shí)不易分辨 通過上述種種方法得到的攜帶失活基因的品系與個(gè)體后，下一步工作就是檢測(cè)突變體表型以便指認(rèn)未知基因的具體功能。這一步也會(huì)遇到難題，生物表型范疇很廣。 即使單細(xì)胞的酵母，要確認(rèn)一個(gè)未知基因?qū)Ρ硇偷呢暙I(xiàn)，也可列出很長(zhǎng)的一串名單。 至于高等生物，因其某些表型具有難以捉摸的綜合性，區(qū)分其準(zhǔn)確的功能更加棘手。,2轉(zhuǎn)座子突

14、變庫構(gòu)建 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法又稱基因標(biāo)簽(gene tagging)，通過構(gòu)建插入突變庫系統(tǒng)，分離與克隆功能基因與調(diào)控順序。這一策略主要依據(jù)以下技術(shù)： 植物體細(xì)胞全能性； 已經(jīng)建立了一套成熟的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，使外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中成功表達(dá)。,植物中有許多轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，它們的轉(zhuǎn)座機(jī)制已經(jīng)清楚，通過轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)插入可獲得大量的突變型，根據(jù)插入的轉(zhuǎn)座子序列合成探針，可分離被破壞的位點(diǎn)，并分析它們的組成。 轉(zhuǎn)座子可以發(fā)生回復(fù)突變，從插入的座位脫離，使突變系重現(xiàn)野生型表型。,目前應(yīng)用的最成功的是玉米的Ac-Ds轉(zhuǎn)座因子系統(tǒng)?；驑?biāo)簽突變庫的工作原理如下： 玉米色粒調(diào)控元件Ac-Ds 系統(tǒng)：第9 染色體 C 基因：

15、色素合成基因。 Ac 基因：自主移動(dòng)的調(diào)節(jié)因子，4.5 kb， 5 個(gè)exon， 編碼轉(zhuǎn)座酶。 Ds 基因：非自主移動(dòng)的受體因子， 0.54.0 kb，與Ac 有同源序列 ，插入引起色素不能合成。,2.1 插入序列(insertion sequence, IS) 僅含有轉(zhuǎn)座酶基因的簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)移序列。長(zhǎng)度多在7001500bp左右。 由末端反向重復(fù)序列(IR)，轉(zhuǎn)座酶基因組成。插入基因組中時(shí)，在靶位上生成正向重復(fù)序列(DR)常見的IS結(jié)構(gòu) 。 IS 長(zhǎng)度 末端IR 靶位DR 插入選擇IS1 768 23 9 隨機(jī)IS2 1327 41 95 熱點(diǎn)IS4 1428 18 （12） AAAN20TTTI

16、S5 1195 16 4 熱點(diǎn)IS10 1329 22 9 TNAGCN IS50 1531 9 9 熱點(diǎn),2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 將Ac因子轉(zhuǎn)座酶的編碼基因與組成型啟動(dòng)子如35S構(gòu)建成嵌合基因表達(dá)載體，由于除去了轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)的反向重復(fù)順序，轉(zhuǎn)座酶的編碼基因不能自我轉(zhuǎn)座。這一表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得的再生植株為（sAc）。 外顯子捕獲載體構(gòu)建：在轉(zhuǎn)座子的邊界順序與標(biāo)記基因之間插入內(nèi)含子剪接受體順序，將它們轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得再生植株B。,將植株和植株B雜交，在轉(zhuǎn)座酶的作用下來自植株B的轉(zhuǎn)座子可以切離與轉(zhuǎn)座。當(dāng)它們插入到某一外顯子中時(shí)，基因轉(zhuǎn)錄加工后可能獲得含正確讀框的mRNA。根據(jù)突變表型與標(biāo)記基因的共分離篩選

17、轉(zhuǎn)化無性系，通過自交可得到純合的不含轉(zhuǎn)座酶基因的插入突變系。 增強(qiáng)子捕獲載體將核心啟動(dòng)子TATA盒框與標(biāo)記基因編碼順序連接，然后在其兩側(cè)安裝轉(zhuǎn)座子邊界，轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得再生植株C。將植株A與植株C雜交，在轉(zhuǎn)座酶的作用下來自植株C的轉(zhuǎn)座子可以轉(zhuǎn)移到增強(qiáng)子下游啟動(dòng)標(biāo)記基因表達(dá)。采取類似4的方法分離純合的插入突變系，進(jìn)一步檢測(cè)增強(qiáng)子的組織特異性表達(dá)場(chǎng)所。,上述方法用于擬南芥的基因打靶(gene targeting)取得了很好的效果，并已應(yīng)用于水稻，玉米等作物的功能基因分離。但它們也有2點(diǎn)不利之處： 插入突變往往是隱性的，必須建立自交的 F2代群體才能找到突變株系； 植物基因組有大量的冗沉基因，它們可取代

18、突變基因的功能，很多突變的效果不易鑒定。改進(jìn)方法為采用功能增益突變路線，即在轉(zhuǎn)座子邊界內(nèi)部加入強(qiáng)啟動(dòng)子。,3內(nèi)含子歸巢突變 什么是內(nèi)含子歸巢? 在I類II類的某些內(nèi)含子中含有開放讀框，可產(chǎn)生具有三種功能的蛋白。 這些蛋白可使內(nèi)含子（或以其原來的DNA形式，或作為RNA的DNA拷貝）移動(dòng)(mobile)，使內(nèi)含子可插到一個(gè)新的靶位點(diǎn)，這個(gè)現(xiàn)象叫做歸巢（homing）。 I組和II組內(nèi)含子分布很廣，在真核和原核細(xì)胞中都有發(fā)現(xiàn)。,在這些內(nèi)含子的開放讀框中編碼具有三種功能的蛋白，這些蛋白與DNA或RNA的代謝有關(guān)。 核酸內(nèi)切酶：在DNA的靶位點(diǎn)剪切，使內(nèi)含子得以插入； 反轉(zhuǎn)錄酶：涉及將內(nèi)含子RNA變成

19、DNA拷貝； 成熟酶：從前體的RNA中切掉內(nèi)含子的部分。,第I組內(nèi)含子具有編碼核酸內(nèi)切酶的開放讀框；有時(shí)成熟酶的活性和此蛋白有關(guān)。 第II類內(nèi)含子具有編碼核酸內(nèi)切酶和反轉(zhuǎn)錄酶的序列，另外成熟酶的活性也與此蛋白有關(guān)。在有些情況下還具有與其它酶活性相關(guān)聯(lián)的成熟酶功能的遺傳信息，成熟酶主要功能是使內(nèi)含子的構(gòu)象穩(wěn)定，這于剪接來說是很必要的。,現(xiàn)已知道有些第I組內(nèi)含子編碼核酸內(nèi)切酶，它們的作用是幫助內(nèi)含子在雜交中能插入到其不同等位基因的座位中。 在真菌的線粒體中普遍存在著內(nèi)含子的多態(tài)性或者缺乏內(nèi)含子，有種觀點(diǎn)認(rèn)為內(nèi)含子來源于基因的插入。 通過分析酵母線粒體的大的rRNA基因在雜交中的重組，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為

20、以上的現(xiàn)象是基因的丟失。,在第I組內(nèi)含子中含有編碼序列。這些內(nèi)含子存在于“+”的酵母品系中，但另一品系“-”中缺乏此內(nèi)含子，將+和-進(jìn)行雜交其后代通常都是+。 如果我們將+品系看作供體，將-品系前成受體，我們從+-雜交中會(huì)發(fā)現(xiàn)-基因組中產(chǎn)生了內(nèi)含子的新拷貝，結(jié)果使全部后代都表現(xiàn)為+。 在兩個(gè)親本任何一個(gè)都可發(fā)生突變而抑制以上的歸巢。,突變的結(jié)果使雜交后代中出現(xiàn)了正常分離，即+和-的后代中出現(xiàn)了正常分離，即+和-的后代數(shù)相等。這種突變表明了這個(gè)過程的性質(zhì)。 在+的品系中突變發(fā)生在緊靠著內(nèi)含子將要插入的位點(diǎn)。在-品系中突變發(fā)生在內(nèi)含子的開放讀框中，從而阻止了蛋白質(zhì)的合成。這表明在+品系中的內(nèi)含子編

21、碼的蛋白識(shí)別-品系的靶位點(diǎn)，將其切開，并將內(nèi)含子的一個(gè)新拷貝插入切開的靶位點(diǎn)中，使之變成+品系，而且能穩(wěn)定地遺傳。,這種蛋白的作用是什么呢？?jī)?nèi)含子的產(chǎn)物是一種核酸內(nèi)切酶，它能識(shí)別-基因并將它作為靶點(diǎn)切開其雙鏈。這種核酸內(nèi)切酶識(shí)別18bp的靶序列，此含有內(nèi)含子插入位點(diǎn)。靶序列的剪切是在每條鏈插入位點(diǎn)的3端這一側(cè)2個(gè)堿基處交錯(cuò)切，這樣剪切位點(diǎn)占4個(gè)bp，產(chǎn)生了凸出的單鏈末端。 這種類型的剪切是和轉(zhuǎn)座子移到新位點(diǎn)的機(jī)制有關(guān)。雙鏈的斷裂起始了基因的轉(zhuǎn)變，在轉(zhuǎn)變中+基因序列產(chǎn)生了一個(gè)新拷貝取代-基因，這個(gè)過程涉及通過復(fù)制機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)座，且僅在DNA水平上發(fā)生或以DNA取代的方式，或以模板轉(zhuǎn)換的方式（與重組

22、修復(fù)相類似）來完成。要注意內(nèi)含子的插入中斷了內(nèi)切酶對(duì)這個(gè)序列的識(shí)別，這樣使其穩(wěn)定。,其它含有開放讀框的第I類內(nèi)含子也可以移動(dòng)。內(nèi)含子永久存在的機(jī)制是相同的：內(nèi)含子編碼的核酸內(nèi)切酶剪切內(nèi)含子將之插入特殊的靶位點(diǎn)。 插入的細(xì)節(jié)是有不同的。例如T4噬菌體td內(nèi)含子所編碼的核酸內(nèi)切酶就是在靶位點(diǎn)上游24bp處剪切，然后內(nèi)含子本身插入這個(gè)位點(diǎn)，而不是其新產(chǎn)生的拷貝。,雖然內(nèi)含子移動(dòng)的機(jī)制是共同的，但靶位點(diǎn)的序列和內(nèi)含子編碼區(qū)域之間并無同源性。據(jù)推測(cè)內(nèi)含子有一個(gè)共同的進(jìn)化區(qū)域，但很明顯它們有很大的歧化。靶位點(diǎn)是在各種靶序列中最長(zhǎng)的，對(duì)于核酸內(nèi)切酶來說也是最特異的。結(jié)果內(nèi)含子永久性地插入到單個(gè)的靶位點(diǎn)中，而

23、且不插入基因組的任何其他地方，此就稱為內(nèi)含子歸巢( intron homing)。 含有編碼核酸內(nèi)切酶序列的內(nèi)含子在不同細(xì)菌和低等真核生物中都有所發(fā)現(xiàn)。由此產(chǎn)生一種游離的因子，其編碼的功能涉及到RNA的剪接或者DNA分子之間的移動(dòng)。與此相關(guān)的觀點(diǎn)認(rèn)為內(nèi)含子編碼區(qū)域中密碼子的用法與外顯子稍有不同。,在第類內(nèi)含子中大部分開放讀框都具有一個(gè)與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān)的區(qū)域（除核酸內(nèi)切酶編碼區(qū)之外）。這種類型的內(nèi)含子在低等真核生物和某些細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)。反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)于內(nèi)含子來說是特異的，而且和歸巢有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶以初始mRNA為模板合成內(nèi)含子的DNA拷貝，通過采用與反轉(zhuǎn)錄病毒相似的機(jī)制使內(nèi)含子插入到靶位點(diǎn)中。和這種

24、情況有關(guān)的此種類型的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與失去LTRs的一組反轉(zhuǎn)錄子是相似的。在靶位點(diǎn)產(chǎn)生缺口，形成的3-OH對(duì)于引發(fā)來說是需要的。,第類內(nèi)含子歸巢的例子與前面介紹的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的機(jī)制相似，內(nèi)切酶在靶位點(diǎn)的雙鏈DNA上切一切口，在缺口上產(chǎn)生了3末端為反轉(zhuǎn)錄酶提供了引物。內(nèi)含子RNA為cDNA的合成提供了模板。由于此RNA含有內(nèi)含子兩側(cè)的外顯子的序列，所以此cDNA要比內(nèi)含子本身長(zhǎng)，它能跨越雙鏈切口，結(jié)果是使內(nèi)含子插入到靶位點(diǎn)。,將一種核糖核蛋白和DNA底物的一道溫育在體內(nèi)可產(chǎn)生移動(dòng)系統(tǒng)。這個(gè)核糖核蛋白含有一個(gè)帶有第II組內(nèi)含子的RNA和它的蛋白產(chǎn)物。它具有核酸內(nèi)切酶活性，在恰當(dāng)?shù)陌形稽c(diǎn)交錯(cuò)切割雙鏈

25、。核糖核蛋白的RNA和蛋白兩種成份對(duì)于剪切都是需要的。在催化中二者可能都有作用。,可移動(dòng)的內(nèi)含子似乎是被插入到先前存在的基因中。它們可能進(jìn)化為核內(nèi)前體-mRNA內(nèi)含子。具有自我剪切的能力的內(nèi)含子顯示了剪接進(jìn)化的重要作用。例如它們能移動(dòng)到核中并成為snRNA的祖先。,內(nèi)含子歸巢突變就是利用歸巢特性，將它們插到大腸桿菌的質(zhì)粒載體中，另外再將人類HIV病毒和CCR5基因靶位DNA構(gòu)建到另一載體中。當(dāng)這2類載體在大腸桿菌或人類體外培養(yǎng)細(xì)胞中相遇，內(nèi)含子RNA可以逆剪切方式插入到HIV和CCR5 DNA靶位中，而且表現(xiàn)為某種隨機(jī)性。當(dāng)內(nèi)含子反向插入基因內(nèi)部時(shí)，由于不表達(dá)IEP，成為永久整合。當(dāng)內(nèi)含子插入

26、方向與IEP轉(zhuǎn)錄方向一致時(shí)，內(nèi)含子可以繼續(xù)轉(zhuǎn)移破壞其他位點(diǎn)。這一系統(tǒng)可望用于缺少同源重組系統(tǒng)生物的功能基因組研究。,4基因的超表達(dá)用于功能檢測(cè),基因功能的檢測(cè)除了使其失活外還可讓其過量表達(dá)，基因產(chǎn)物的不足與過量都會(huì)破壞這種平衡，表現(xiàn)生長(zhǎng)與發(fā)育的異常。 基因的超表達(dá)有兩種技術(shù)： 1. 增加基因的拷貝數(shù)； 2. 采用強(qiáng)啟動(dòng)子促使基因表達(dá),5. 反義RNA 反義RNA(anti sense RNA)是指mRNA互補(bǔ)的RNA分子。這種反義RNA能與mRNA分子特異性地互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制該mRNA的加工與翻譯，是原核細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)控的一種方式。然而，許多實(shí)驗(yàn)證明，在真核細(xì)胞中亦存在反義RNA，但其功

27、能尚未全部明了。 最近幾年來通過人工合成反義RNA的基因，并將之導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄出反義RNA，即能抑制特定基因的表達(dá)，阻斷該基因的功能，有助于了解該基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)和分化的作用。同時(shí)也暗示了該方法對(duì)腫瘤實(shí)施基因治療的可能性。,5.1 反義RNA的分類和作用機(jī)制 下表總結(jié)了原核細(xì)胞內(nèi)天然存在的11種反義RNA。這些反義RNA按其作用機(jī)制可經(jīng)分為三大類。 類：這類反義RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或編碼區(qū)，引起翻譯的直接抑制(A類)或與靶mRNA結(jié)合后引起該雙鏈RNA分子對(duì)RNA酶的敏感性增加，使其降解(B類)。,類：這類反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結(jié)合，從而抑制靶mRN

28、A的翻譯功能。其作用機(jī)制尚不完全清楚，可能是反義RNA與靶mRNA的上游序列結(jié)合后會(huì)引起核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因而阻止了核糖體的結(jié)合。 類：這類反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。,5.2 ticRNA transcription inhibitory complementary RNA ticRNA是大腸桿菌中CAP蛋白(cAMP結(jié)合蛋白)的mRNA的反義RNA。ticRNA的基因的啟動(dòng)子可被cAMP-CAP復(fù)合物所激活，從CAP mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3個(gè)核苷酸處開始，以CAP mRNA的模板DNA鏈的互補(bǔ)鏈為模板，合成ticRNA。,ticRNA具體長(zhǎng)度不清楚，但是

29、它是5端一段正好和CAP mRNA的5端有不完全的互補(bǔ)，可以形成雙鏈的RNA雜交體。而在CAP mRNA上緊隨雜交區(qū)之后的是一段約長(zhǎng)11bp的A，U豐富區(qū)。這樣的結(jié)構(gòu)十分類似于不依賴性的轉(zhuǎn)錄終止子的結(jié)構(gòu)，從而CAP mRNA的轉(zhuǎn)錄剛剛開始不久后即迅速終止。從這個(gè)例子中我們可以看到CAP蛋白合成的自我調(diào)節(jié)作用。當(dāng)CAP合成達(dá)一定量后，即可與cAMP結(jié)合成cAMP-CAP復(fù)合物。再激活ticRNA的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出ticRNA，反過來抑制CAP-mRNA的合成。,5.3 反義RNA的功能 在原核生物中反義RNA具有多種功能，例如調(diào)控質(zhì)粒的復(fù)制及其接合轉(zhuǎn)移，抑制某些轉(zhuǎn)位因子的轉(zhuǎn)位，對(duì)某些噬菌體溶菌-溶源

30、狀態(tài)的控制等。 下文僅舉數(shù)例：,5.3.1 調(diào)控細(xì)菌基因的表達(dá) 反義RNA對(duì)編碼CAP基因的調(diào)控作用已如前述。這里再介紹一下micF RNA對(duì)ompF基因的表達(dá)的調(diào)控。ompF蛋白質(zhì)是大腸桿菌的外膜蛋白的主要成分這一。micF RNA是從另一基因(ompC基因)附近的DNA序列轉(zhuǎn)錄而來，和ompF mRNA的5端有70%的序列互補(bǔ)，因此在體外micF RNA可以抑制ompF mRNA的翻譯。 但是這種抑制作用在體內(nèi)是否重要尚有疑問，因?yàn)槿笔icF基因的菌株其ompF蛋白的表達(dá)只受到輕微的影響。,5.3.2 噬菌體溶菌/溶源狀態(tài)的控制 反義RNA也參與了和P22噬菌體的溶菌/溶源狀態(tài)的控制。P

31、22噬菌體編碼一種抗阻遏蛋白Ant，它可以抑制許多樣噬菌體的阻遏蛋白與DNA的結(jié)合。這對(duì)于剛剛感染細(xì)胞的P22建立樣原噬菌體(prophage)是有益的。 但是Ant必須在嚴(yán)格的控制下，否則Ant的過分表達(dá)必將阻止溶源狀態(tài)的建立，而成為溶菌性的噬菌體。Ant蛋白質(zhì)表達(dá)的控制是利用反義RNA(sarRNA)能與ant mRNA的翻譯起源區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制ant mRNA翻譯成Ant蛋白。,在噬菌體中c蛋白控制著溶菌或溶源狀態(tài)的選擇。c蛋白可以激活Pre啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子控制的基因是噬菌體整合作用所必須的，且同時(shí)能抑制噬菌體的復(fù)制。 c蛋白的另一功能是延緩?fù)砥诨虻谋磉_(dá)，其作用機(jī)制是c蛋白激活Pa

32、Q的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄出PaQRNA。PaQRA是編碼Q蛋白的mRNA的反義RNA。因此，PaQRNA能與QmRNA配對(duì)雜交而抑制其翻譯，而Q蛋白早已知道是晚期基因表達(dá)的激活蛋白。 c基因本身的表達(dá)還受到稱為oopRNA的反義RNA的調(diào)控。oopRNA與c基因的3端互補(bǔ)，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。,5.3.3 IS10轉(zhuǎn)位作用的抑制 outRNA是一種反義RNA，可以和IS10編碼的轉(zhuǎn)位酶mRNA(INRNA)5端結(jié)合而抑制其翻譯，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)拷貝IS10時(shí)，只能生成很少量的outRNA，故轉(zhuǎn)位酶仍可生成。但當(dāng)IS10的拷貝數(shù)增多時(shí)，outRNA愈來愈多，其控制作用亦明顯增強(qiáng)，所以稱為多拷貝抑制

33、現(xiàn)象。這種現(xiàn)象可以防止IS10的過量堆積引起的細(xì)胞損害。,5.4 人工合成構(gòu)建反義RNA 既然反義RNA在原核生物中對(duì)基因表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，那末人工設(shè)計(jì)在天然狀態(tài)下不存在的反義RNA來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，想必也是可能的。這已在不少實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。 由于目前對(duì)靶mRNA的SD序列的上游區(qū)的結(jié)構(gòu)了解甚少，因此，在要設(shè)計(jì)類反義RNA用于和靶mRNA SD序列上游區(qū)結(jié)合，以期達(dá)到調(diào)節(jié)該mRNA翻譯的目的是比較困難的。,類反義RNA是和mRNA的起始處結(jié)合而形成類似-不依賴性的轉(zhuǎn)錄終止子而使轉(zhuǎn)錄水平上抑制靶基因的表達(dá)。因此，要設(shè)法在靶mRNA上找到一段連續(xù)的U序列，就可以設(shè)計(jì)出反義RNA，與該U序列

34、上游的mRNA鏈互補(bǔ)，以形成-不依賴性終止子。理想的作用位點(diǎn)是在靶mRNA的5端上游的非編碼區(qū)，以免受核糖體的影響。 只要靶基因的核苷酸順序已經(jīng)知道，就可以人工設(shè)計(jì)出類反義RNA。有時(shí)還可設(shè)計(jì)同時(shí)具有類和類反義RNA功能的反義RNA。,我們還可以設(shè)計(jì)出天然存在的反義RNA的反義RNA來。這樣就可以拮抗原始反義RNA對(duì)靶mRNA的抑制作用。而達(dá)到激活或加強(qiáng)某個(gè)靶基因的表達(dá)的目的。然而并不是所有的mRNA對(duì)其相應(yīng)的類反義RNA都敏感。例如： 有的mRNA壽命很短，只有1-2分鐘，它們和反義RNA結(jié)合的機(jī)會(huì)較少，因而就較不敏感。反之，另一些mRNA則很穩(wěn)定，壽命可達(dá)十多分種，則其對(duì)相應(yīng)的反義RNA的

35、抑制作用就很敏感。 此外，反義RNA本身的穩(wěn)定性有很大的實(shí)際意義。顯然，穩(wěn)定的反義RNA對(duì)靶mRNA的調(diào)節(jié)作用比不穩(wěn)定的反義RNA要好。,5.5 使反義RNA分子穩(wěn)定的方法 反義RNA 3端帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)或類似-不依賴性終止子結(jié)構(gòu)時(shí)，可以穩(wěn)定RNA分子。,Gorski等還發(fā)現(xiàn)在T4噬菌體的基因32 mRNA的5端上游的莖環(huán)結(jié)構(gòu)及其附近的序列亦可穩(wěn)定RNA分子。所以在設(shè)計(jì)反義RNA基因時(shí)，最好將產(chǎn)生3及5端這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列克隆在反義RNA基因的兩端。 Hirashima等1986年發(fā)現(xiàn)，針對(duì)靶mRNA的SD序列和AUG區(qū)域的反義RNA，要比單純對(duì)編碼區(qū)域的反義RNA更為有效。 1989年Hira

36、shima又發(fā)現(xiàn)，針對(duì)SD序列和它的上游區(qū)域（但不包括AUG）的反義RNA更為有效。 在真核生物中，針對(duì)5端非編碼區(qū)的反義RNA更有效。但也有實(shí)驗(yàn)表明針對(duì)第一內(nèi)含子的反義RNA也同樣有效。,現(xiàn)在設(shè)計(jì)反義RNA基因是時(shí)應(yīng)注意幾點(diǎn)總結(jié)如下： 長(zhǎng)的反義RNA并不一定比短的反義RNA更為有效。 在原核生物中針對(duì)SD序列及其附近區(qū)域的反義RNA可能更有效。 在真核生物中，對(duì)應(yīng)于5端非編碼區(qū)的反義RNA可能比針對(duì)編碼區(qū)的反義RNA更有效。,盡量避免在反義RNA分子中出現(xiàn)自我互補(bǔ)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 設(shè)計(jì)的反義RNA分子中不應(yīng)有AUG或開放讀框，否則該反義RNA亦會(huì)與核糖體結(jié)合而影響其與靶mRNA的配對(duì)結(jié)合。 進(jìn)一

37、步還可以將帶有ribozyme結(jié)構(gòu)的RNA連在反義RNA的3端尾上，當(dāng)反義RNA與靶mRNA雜交后，即可利用其酶活性來降解靶mRNA。,此外，為了增強(qiáng)反義RNA的作用，還可以采取一些額外措施，例如： 由于反義RNA對(duì)靶mRNA的抑制作用有劑量依賴性，所以在構(gòu)建反義RNA基因時(shí)，要選擇強(qiáng)的、可以誘導(dǎo)的啟動(dòng)子以增強(qiáng)反義RNA本身的表達(dá)。 構(gòu)建許多個(gè)反義RNA基因串連在一起，以得到線性重復(fù)的多拷貝基因，對(duì)提高反義RNA的表達(dá)也有利。 RNA酶可以降解RNA：RNA雜交體，所以在構(gòu)建反義RNA基因時(shí)，可將RNA酶的基因也同時(shí)轉(zhuǎn)化到靶細(xì)胞中并進(jìn)行表達(dá)。這樣，當(dāng)反義RNA與靶mRNA結(jié)合后，RNA酶即可將

38、其降解。這顯然有利于反義RNA的抑制作用。,三、其他的基因功能研究方法,基因失活與過量表達(dá)是研究基因功能的基本方法，但還有一些其他的方法可將基因失活及過量表達(dá)所知的結(jié)果進(jìn)一步延伸與深化，對(duì)蛋白質(zhì)活性進(jìn)行綜合研究。,噬菌體展示(phage display) 噬菌體展示是一項(xiàng)篩選技術(shù)，它將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白將展示在病毒顆粒的表面，而編碼這個(gè)融合子的DNA則位于該病毒粒子內(nèi)。 噬菌體展示技術(shù)使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細(xì)胞表面受體等）的多肽配體通過一種被稱為淘選（panning）的體外選擇程序得以快速鑒定。,最簡(jiǎn)單的

39、淘選程序，是將噬菌體展示肽庫與包被有靶分子的平板（或磁珠）共溫育，先洗去未結(jié)合噬菌體，然后洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。被洗脫的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，然后再進(jìn)行下一輪的結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán)，以富集那些可結(jié)合序列。經(jīng)3-4輪淘選后，通過DNA測(cè)序?qū)γ總€(gè)可結(jié)合克隆進(jìn)行定性。,展示在噬菌體表面的隨機(jī)肽庫可應(yīng)用于許多方面，包括繪制抗原表位圖譜、研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和鑒定非肽配體的肽模擬物。生物活性肽分子的鑒定既可通過對(duì)固定的純化受體進(jìn)行淘選，也可在完整細(xì)胞上進(jìn)行淘選。蛋白酶底物的鑒定可通過在隨機(jī)肽區(qū)域的上游加一段親和標(biāo)簽，然后選用特異性的介質(zhì)來區(qū)分切割和未切割的噬菌體。 另外，大的蛋白質(zhì)分子，如抗體、激素、蛋白酶

40、抑制劑、酶和DNA結(jié)合蛋白也可展示在噬菌體上，通過對(duì)隨機(jī)突變文庫的篩選，分離出各種具有親和力或特異性改變的突變體。,PhD-C7C噬菌體展示肽庫試劑盒是將隨機(jī)七肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pIII)上而構(gòu)建成的一個(gè)組合文庫。與其他NEB展示肽庫不同的是，所展示的隨機(jī)多肽兩側(cè)各有一個(gè)半胱氨酸。在非還原條件下，這兩個(gè)半胱氨酸自發(fā)地形成一個(gè)二硫鍵，使展示的多肽環(huán)化，而PhD-7和PhD-12肽庫則展示線性多肽。受限于二硫鍵環(huán)內(nèi)的7肽庫已被證實(shí)能識(shí)別抗原表位結(jié)構(gòu)，D-氨基酸靶分子的鏡像配基及開發(fā)以多肽為基礎(chǔ)的治療藥物。,二硫鍵環(huán)內(nèi)的7肽表達(dá)在pIII的N末端，第一個(gè)半胱氨酸緊接于丙氨酸后，第二個(gè)

41、半胱氨酸后有一小段間隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser組成，然后是野生型pIII蛋白。該文庫含有1.2109個(gè)電轉(zhuǎn)化序列（可能的隨機(jī)七肽序列數(shù)為：207=1.28109），用10 l本試劑盒提供的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)序列一次可產(chǎn)生約200個(gè)拷貝。 原始文庫的大量測(cè)序結(jié)果表明該文庫序列具有廣泛的多樣性，無明顯的殘基位置偏嗜。建議不要擴(kuò)增原始文庫來進(jìn)行其他的淘選試驗(yàn)，因?yàn)橐坏┰贁U(kuò)增便可能會(huì)出現(xiàn)序列偏性現(xiàn)象。,酵母雙雜交 (yeast two-hybridization) 2.1 概念 酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺(tái)，在近幾年來得到了廣泛運(yùn)用。

42、 酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。,酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。 細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular)，往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，D

43、NA-AD)。,這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。 大量的研究文獻(xiàn)表明，酵母雙雜交技術(shù)既可以用來研究哺乳動(dòng)物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。因此，它在許多的研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。,2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 根據(jù)這個(gè)特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Bait protein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，

44、在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Bait protein。 將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-Library表達(dá)載體上。 同時(shí)將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長(zhǎng)。,當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因His、Ade、LacZ、Mel1，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。 將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-Library載體提取分離出來，從而對(duì)載體中插入的文庫基因進(jìn)行測(cè)序和分析工作。

45、在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。 基于酵母雙雜交技術(shù)平臺(tái)的特點(diǎn)，它已經(jīng)被應(yīng)用在許多研究工作當(dāng)中。,2.3 利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì) 的新功能 酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-Library載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在Genebank中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。 另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。,例如：Engelender等人以神經(jīng)末端蛋白alpha-synuclein 蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交Clontech Matchmarker System 3為操作平臺(tái)，從成人腦cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并證明了Synphilin-1與alpha-synuclein 之間的相互作用與帕金森病的發(fā)病有密切相關(guān)。 為了研究?jī)蓚€(gè)蛋白之間的相互作用的