DNA和RNA提取原理和方法

1、核酸提取及常見問題分析,第一部分：DNA提取方法簡介,第二部分：DNA提取常見問題、 原因分析及其對策,內(nèi)容,第三部分：RNA提取方法簡介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策,核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作 。,前言,第一部分：DNA提取方法簡介,第二部分：DNA提取常見問題、 原因分析及其對策,第三部分：RNA提取方法簡介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策,第一部分：DNA提取方法簡介,DNA提取的幾種方法,基因組DNA的提取,CT

2、AB法 SDS法 其它,DNA提取的幾種方法,非基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,堿裂解法 煮沸法,線粒體、葉綠體DNA的提取,差速離心結(jié)合SDS裂解法,基因組DNA CTAB法,CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。 具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里 該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉

3、淀即可使核酸分離出來。,注：CTAB溶液在低于15 時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15。,CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方,Tris-HCl （pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性； NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP（脫氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離； -巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除,基因組DNA CTAB法,褐變,CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合

4、物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。,基因組DNA CTAB法,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）,PVP 按其平均分子量大小分為四級，習(xí)慣上常以K值表示，不同的K值分別代表相應(yīng)的PVP平均分子量范圍。K值實(shí)際上是與PVP水溶液的相對粘度有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關(guān)的物理量，因此可以用K值來表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越強(qiáng)。 在研磨過程中加入PVP，其中的CO-N=基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚的能力，從源頭上減少了酚類被氧化的機(jī)會(huì)。 同時(shí)向抽提液中加入還原劑-巰基乙醇，后者能打斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨后經(jīng)抽提而

5、去除。,CTAB法流程圖,植物材料,裂解液,上層溶液,液氮研磨,抽提,細(xì)胞裂解,干燥溶解,離心洗滌,酒精沉淀,DNA溶液,基因組DNA CTAB法,SDS法原理,基因組DNASDS法,SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸； 提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法DNA提取緩沖液,2.65 水浴 60min, 其間緩慢搖動(dòng)幾次。 3.加入150ul 的5mol/ LKac, 混勻, 冰浴15min 左右,

6、SDS法流程圖 （以動(dòng)物組織為例）,基因組DNASDS法,基因組DNA其它方法,物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法 化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法 生物方式：酶法,根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：,基因組DNA其它方法,吸附材料結(jié)合法：,根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：,硅質(zhì)材料 陰離子交換樹脂 磁珠,高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。 快捷高效。,低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。 適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。,磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。,基因組DNA其它方法,濃鹽法： 有機(jī)溶劑抽提法： 密度梯度離心法：,利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將

7、二者分離,有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用,利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物,質(zhì)粒DNA堿裂解法,堿裂解法原理,染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。,質(zhì)粒DNA堿裂解法,堿裂解法流程圖,對數(shù)期菌體,溶液III中和,溶液I充分重懸,溶液II裂解,上清液,抽提,離心洗滌,酒

8、精沉淀,干燥溶解,沉淀,質(zhì)粒DNA溶液,SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液1的成分及作用,溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去 溶液 0.2M NaOH / 1% SDS 破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。 溶液III 3M 醋酸鉀 / 2M 醋酸 這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均

9、兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時(shí)基因組DNA也被PDS共沉淀,質(zhì)粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。,細(xì)胞器DNA差速離心法,差速離心法原理,是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（

10、蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。,線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來。,第一部分：DNA提取方法簡介,第二部分：DNA提取常見問題、 原因分析及其對策,內(nèi)容,第三部分：RNA提取方法簡介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策,第二部分：DNA提取常見問題、 原因分析及其對策,DNA提取的基本步驟,I.材料準(zhǔn)備 II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放 III.核酸分離、純化 IV

11、.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) V.核酸溶解在適量緩沖液或水中,材料準(zhǔn)備,最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融 提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞） 組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長，否則會(huì)造成DNA降解 含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集,基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加） 培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失 盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）,嚴(yán)謹(jǐn)性質(zhì)粒和松弛性質(zhì)粒,按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類： 一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，

12、質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有12個(gè)質(zhì)粒； 另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時(shí)和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。,細(xì)胞裂解,材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低 針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： 植物材料液氮研磨 動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨 組培細(xì)胞蛋白酶K 細(xì)菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩,基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,菌體量適當(dāng) 培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液

13、中充分懸浮 變性的時(shí)間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷 復(fù)性時(shí)間也不宜過長，否則會(huì)有基因組DNA的污染 G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁,核酸分離、純化,采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔 離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間（獼猴桃大提，10000轉(zhuǎn)20min） 針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法,基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,核酸分離、純化,蛋白質(zhì)的去除： 酚/氯仿抽提 使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌 蛋白酶處理,多糖的去除： 高鹽法：用乙醇沉淀

14、時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。,核酸分離、純化,多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合,核酸分離、純化,鹽離子的去除： 70的乙醇洗滌,核酸沉淀、

15、溶解,當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分 沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解,基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì) DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng) DNA中殘留有金屬離子,重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前） 重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā) 增加7

16、0乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）,DNA提取常見問題,問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。,原因,對 策,材料不新鮮或反復(fù)凍融 未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性 提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷 外源核酸酶污染 反復(fù)凍融,盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融 液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液 在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量 細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔 所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌 將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融,DNA提取常見問題,問題二：DNA降解。,對 策,原因,實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉

17、淀不完全 洗滌時(shí)DNA丟失,盡量選用新鮮（幼嫩）的材料 動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁 高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長（對于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量） 低溫沉淀，延長沉淀時(shí)間 加輔助物，促進(jìn)沉淀 洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒,DNA提取常見問題,問題三：DNA提取量少。,對 策,原因,獼猴桃DNA提取實(shí)例,1.CTAB配方如上,配制好備用,65度水浴預(yù)熱。獼猴桃葉片或果實(shí)采取后最好立即放到液氮中,避免酚類物質(zhì)氧化 2.65水浴一個(gè)小時(shí) 3.氯仿：乙醇：異戊醇=80:16:4的抽提液 兩次。10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，盡量把絲狀物壓緊，避免吸取上清時(shí)有

18、絲狀物牽拉 等體積預(yù)冷的異丙醇 ，75%乙醇洗去其他雜質(zhì)。洗兩次 。 用無水乙醇5毫升洗一次。晾干5分鐘揮發(fā)掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存,獼猴桃基因組DNA,第一部分：DNA提取方法簡介,第二部分：DNA提取常見問題、 原因分析及其對策,內(nèi)容,第三部分：RNA提取方法簡介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策,第三部分：RNA提取方法簡介,RNA提取的通用方法,異硫氰酸胍/苯酚法,原理： 細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放； 釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位

19、于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分離； 有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。,RNA提取的通用方法,異硫氰酸胍/苯酚法,步驟: 材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。 裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。 純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。 洗滌：70乙醇。 沉淀：異丙醇、無水乙醇。 乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。,RNA提取的通用方法,影響RNA提取的因素,材料： 新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料 如若材料來源困難，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔

20、?？梢韵葘⒉牧腺A存在TRIzol或樣品貯存液中，于70或20保存 如要多次提取，請分成多份保存 液氮長期保存，70短期保存,影響RNA提取的因素,影響RNA提取的因素,樣品破碎及裂解： 根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法： 培養(yǎng)細(xì)胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和細(xì)菌：一般TRIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁 動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品保持冷凍 樣品量適當(dāng)，保證充分裂解 為減少DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量,影響RNA提取的因素,純化： 在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速； 經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，

21、雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長，易造成 RNA 降解； 柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。,影響RNA提取的因素,第一部分：DNA提取方法簡介,第二部分：DNA提取常見問題、 原因分析及其對策,內(nèi)容,第三部分：RNA提取方法簡介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常見 問題、原因分析及其對策,RNA提取常見問題,RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 電泳帶型異常 下游實(shí)驗(yàn)效果不佳,RNA降解,新鮮細(xì)胞或組織： 裂解液的質(zhì)量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足

22、 組織裂解不充分 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如脾臟，胸腺等)，很難避免 RNA 的降解。 建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。,RNA降解,冷凍樣品： 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70冰箱保存。樣品要相對小一點(diǎn)； 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿； 樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。,OD260 /OD280 比值偏低,蛋白質(zhì)污染： 不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。 減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底 解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚殘留： 不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。 解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。,OD260 /OD280 比值偏低,抽提試劑殘留： 確保洗滌時(shí)要徹底懸浮 RNA，并且徹底去掉 75% 乙醇。 解決辦法:再沉淀一次后，溶解。 設(shè)備限制： 測定OD260 及OD280 數(shù)值時(shí)，要使OD260 讀數(shù)在 0.10 - 0.50 之間。此范圍線性最好。 用水稀釋樣品： 測 OD 時(shí)