分子生物學檢驗技術(shù)核酸的基本結(jié)構(gòu)和功能

1、第二講 核酸的基本結(jié)構(gòu)和功能 分子生物學實驗室 分子生物學檢驗技術(shù)課件分子生物學檢驗技術(shù)課件 ?1868年，F(xiàn). Miescher從細胞核中分離得 到一種酸性物質(zhì)，現(xiàn)在被稱為核酸。 ?核酸是一類重要的生物大分子，擔負著 生命信息的儲存與傳遞。 ?核酸是現(xiàn)代生物化學、分子生物學的重 要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分 子。 一、核酸是什么？一、核酸是什么？ 1944年，Avery的轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)化實驗 or and 可分離可分離 ?1952年， 噬菌體感染大腸桿菌試驗。 ?以上兩個試驗證明了DNA是遺傳物質(zhì)， 物種的所有特征都編碼在DNA分子中。 ?以后又發(fā)現(xiàn)了RNA病毒，它們的遺傳 信息編碼在RNA分

2、子中。 ?有人說：給我一個愛因斯坦的細胞， 我就可以克隆出許許多多的愛因斯 坦。-一個細胞中含有這種生物所 有的遺傳信息。 二、核酸有多少種？ 兩種： 1. DNA 2. RNA DNA-Deoxyribonucleic Acid-脫氧核糖核酸 RNA-Ribonucleic Acid-核糖核酸 稍后講核酸的組成時將看出 DNA和RNA的區(qū)別和聯(lián)系。 三、核酸在哪里？ ? 98核中（染色體中） ? 真核 線粒體（mtDNA） ? 核外 ? 葉綠體（ctDNA） ?DNA 擬核 ? 原核 ? 核外：質(zhì)粒（plasmid ） ? 病毒：DNA病毒 因此： 1. 要從有核細胞中提取DNA。 2. 一

3、般我們從有核細胞的細胞核中獲得DNA。 RNA有3種，主要存在于細胞質(zhì)中 ? tRNA-轉(zhuǎn)運RNA-蛋白質(zhì)合成時搬運氨基酸的工具 ? rRNA- 核蛋白體RNA-構(gòu)成蛋白質(zhì)的合成場所 ? mRNA信使RNA-蛋白質(zhì)合成的模板 2種核酸的功能可以這樣理解： 1. DNA編碼了遺傳信息。即DNA分子 中蘊藏著該物種全部遺傳特征。 2. RNA使DNA上編碼的遺傳信息兌現(xiàn)。 四、核酸的基本化學組成 核酸 核苷酸 核苷 磷酸 堿基 戊糖 核酸的元素組成： C H O N P 核酸的基本結(jié)構(gòu)單位是核苷酸： 即： 核酸=核苷酸-核苷酸-核苷酸=（核苷酸）n 請比較：蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是氨基酸 蛋白質(zhì)=氨

4、基酸-氨基酸-氨基酸=（氨基酸）n 核苷酸 =磷酸+戊糖+堿基 組成核酸的戊糖有兩種。 DNA所含的糖為 - D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為-D-核糖。 1. 戊糖（五碳糖戊糖（五碳糖-甲乙丙丁甲乙丙丁戊戊己庚辛）己庚辛） O H H OH H OH OH H HOCH 2HOCH 2 O H H OH H H OH H D-核糖D-2-脫氧核糖 Ribose Deoxyribose 己糖：如C6H12O6-葡萄糖葡萄糖 2. 堿基堿基 . 嘌呤（Purine ） -兩個環(huán) 1 2 3 4 5 6 9 7 8 N N N H N NH2 ?腺嘌呤Adenine A NH N N H N

5、O NH2 ?鳥嘌呤guanine G . 嘧啶（Pyrimidine ） -一個環(huán) 1 2 3 4 5 6 尿嘧啶 uracil NH N H O O U N N H NH 2 O 胞嘧啶 cytosine C NH N H O O 胸腺嘧啶 thymine T 3. 磷酸 H3PO4 快速作答 1. 核酸的基本結(jié)構(gòu)單位是？ 2. 核酸有多少種？ 3. DNA大多存在于細胞的什么地方？ 4. RNA多數(shù)存在于細胞的哪里？ 5. 核苷酸可以完全水解成哪 3個部分？ 6. 常見的堿基有多少種？ 7. A U C G T 各代表什么？ 8.組成DNA的戊糖和組成RNA的戊糖一樣嗎？ 9.下圖是嘌呤

6、還是嘧啶？ 1 2 3 4 5 6 9 7 8 五、戊糖和堿基怎樣連接成為核苷？ ?核苷 戊糖+堿基 ?糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷 鍵 1 2 3 4 5 (OH) 1 2 3 4 5 (OH) 胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鳥嘌呤核苷腺嘌呤核苷 N N OH HO N N NH2 HO N N OH H2N N N N N N N NH2 O H H OH H OH H HOCH2 HOCH2 O H H OH H OH H O H H OH H OH H HOCH2 O H H OH H OH H HOCH2 假尿苷（） 次黃苷（肌苷）I 黃嘌呤核苷 X 二氫尿嘧啶核苷 D 取代核苷的表

7、示方式 7-甲基鳥苷 m5G 5 OH Adenosine Guanosine Cytidine Uridine 六、核苷和磷酸怎樣連接成核苷酸？ 核苷酸 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸 H H 核苷酸 ?繼續(xù)磷酸化 O-P O O - N N N N NH2 O H H OH H OH H OCH2O-P O O- O-P O O- 三磷酸腺苷 (ATP) AMP ADP ATP ?剛才那兩個圖是DNA還是 RNA? 環(huán)化磷酸化 ? cAMP ? cGMP 肌苷酸及鳥苷酸(強力味精) IMP GMP 七、核苷酸與核苷酸怎樣連接成核酸？ ?上一個核苷酸的C3-OH 與下一個核苷酸的5-磷 酸基形

8、成3,5-磷酸二酯鍵 5 5 3 3 ?上一個核苷酸的C3-OH 與下一個核苷酸的5-磷 酸基形成3,5-磷酸二酯鍵 5 5 3 3 ? 5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羥基端（常用3-OH表示） ? 多聚核苷酸鏈具有方向性，當表示一個多聚核苷酸鏈時，必須 注明它的方向是53或是35。 多聚核苷酸的表示方式 DNA RNA 5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU T 5 3 OH U 5 3 OH OH OH OH OH 第三節(jié) DNA的結(jié)構(gòu) ?一、DNA的一級結(jié)構(gòu) ?脫氧核糖核酸的排列

9、順序 可以用堿基排列順序表示 ?連接鍵：3，5-磷酸二酯鍵 磷酸與戊糖順序相連形成主鏈骨架 堿基形成側(cè)鏈 ?多核苷酸鏈均有 5-末端和3-末端 DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形式。 生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f 化的不同排列組合之中。 2. 基因與基因組基因與基因組 基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物細胞中DNA 分子的最小功能單位（交換單位）。 蛋白質(zhì)（mRNA 蛋白質(zhì)） 產(chǎn)物 tRNA RNA rRNA 調(diào)節(jié)功能：調(diào)節(jié)基因 無產(chǎn)物 作用未知 結(jié)構(gòu)基因 基因組（genome）：某生物體（完整單倍體）所含全部遺 傳物質(zhì)的總和。傳物質(zhì)的總和。 包括

10、：核基因組（擬核/核核DNA）及核外（質(zhì)粒/質(zhì)體DNA） bp（堿基對） 103 104 105 106 107 108 109 1010 1011 1012 人 兩棲類 魚類 藻類 酵母 細菌 E.Coli 病毒 質(zhì)粒 各種細胞、病毒和細菌質(zhì)粒中基因組的大小 3. 原核生物基因組特點 ? 重復序列少，多位編碼區(qū) ? 多為操縱子形式組織 ? 有重疊基因存在 4. 真核生物基因組特點 ? 以染色體存在 ? 重復序列多 基因組計劃 人類基因組計劃（Human Genome Project ， HGP ） 酵母基因組計劃 （YGP） 大腸桿菌（E.Coli） 二、二、DNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu) DN

11、A的雙螺旋模型的雙螺旋模型 ?1953年，J. Watson 和F. Crick 在前 人研究 工作 的基礎(chǔ)上，根據(jù) DNA結(jié)晶 的X-衍射圖譜和分子模 型，提出了著名的 DNA雙 螺旋結(jié)構(gòu)模型 ，并對模 型的生物學意義作出了 科學的解釋和預測。 ?在DNA分子中，嘌呤堿基 的總數(shù)與嘧啶堿基的總 數(shù)相等。 DNA雙螺旋模型要點雙螺旋模型要點 B型結(jié)構(gòu) 兩條鏈反向平行，右手螺旋 堿基在內(nèi)（AT，GC）堿 基平面垂直于螺旋軸 磷酸、戊糖在外構(gòu)成骨架， 雙螺旋每轉(zhuǎn)一周 為10堿基對 （bp） A型結(jié)構(gòu)（了解） 堿基平面傾斜20o，螺旋變粗 變短，螺距23nm。 Z型結(jié)構(gòu)（了解） 左手螺旋，只有小溝

12、2.0 nm 小 溝 大 溝 雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù) 類型 旋轉(zhuǎn)方向 螺旋直徑 （nm） 螺距 （nm） 每轉(zhuǎn)堿基 對數(shù)目 堿基對間垂直 距離（nm） 堿基對與水 平面傾角 ADNA BDNA ZDNA 右 右 左 2.0 2.3 1.8 2.8 3.4 4.5 11 10 12 0.255 0.34 0.27 20o 0o 7o 雙螺旋穩(wěn)定的力 氫鍵 堿基堆積力（疏水相互作用及范德華力） 離子鍵等 則DNA變性劑（熱、pH、脲/酰胺、有機溶劑） DNA的存在形式的存在形式 二、DNA的三級結(jié)構(gòu) ?DNA雙螺旋的進一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)， 負超螺旋 原核 雙鏈環(huán)狀DNA（dcDNA） 病毒 單鏈

13、環(huán)狀DNA（scDNA） 單鏈線性DNA（ssDNA） 真核 雙鏈線性DNA（dsDNA） 第四節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能 一、RNA的結(jié)構(gòu)特點 1. 堿基: A、G、C、U （AU/GC） 2. 多為單鏈，分子較小 3. 分三類：mRNA 信使RNA，蛋白質(zhì)翻譯的模板 tRNA-蛋白質(zhì)翻譯時轉(zhuǎn)運氨基酸的工具（15%） rRNA -構(gòu)成蛋白質(zhì)合成的場所（80%） 4. 少數(shù)病毒是RNA病毒（基因由RNA編碼） 二、RNA的功能：總體上，DNA編碼遺傳 信息；RNA將其兌現(xiàn)。 tRNA的三級結(jié)構(gòu)三葉草形，重要功能區(qū)： 反密碼環(huán) 氨基酸臂 第五節(jié)第五節(jié) 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì) 一、一般的理化性質(zhì) ? 兩

14、性解離 / 一般呈酸性（在中性溶液中帶負電荷），微 溶于水，不溶于有機溶劑 ?線性大分子（粘度高。抗剪切力差） ?可用電泳或離子交換（色譜）進行分離 ?室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解 ?加熱條件下，D核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色 D2脫氧核糖酸二苯胺 藍紫色 二、核酸的紫外吸收特性 ?在核酸分子中，由于嘌呤堿 和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系， 因而具有獨特的紫外線吸收 光譜，一般在260nm左右有 最大吸收峰，可以作為核酸 及其組份定性和定量測定的 依據(jù)。 ?以A260/A280進行定性、定量 ?DNA和RNA溶液中加入溴化乙 錠（EB），在紫外下發(fā)出熒 光 三、核酸的變性、復性與分子

15、雜交 1. 變性 ?穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈 結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。 ?變性表征 生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸 收增加（增色效應） ?變性因素 pH（11.3或5.0） 變性劑（脲、甲酰胺、甲醛） 低離子強度 加熱 ?DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。 因此，通常將紫外吸收的增加量達最大量一半時的溫度稱熔 解溫度，用Tm表示。 ?一般DNA的Tm值在70-85?C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的 含量有關(guān)。 ?G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通過經(jīng)驗公式

16、計算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 2. 熱變性和T m 3. 核酸的復性核酸的復性 ?變性核酸的互補鏈在適當?shù)臈l件下，重新締合成為雙 螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復性。 ?DNA復性后，一系列性質(zhì)將得到恢復，但是生物活性一 般只能得到部分的恢復，具有減色效應。 ?將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。 變性的DNA緩慢冷卻時可復性，因此又稱為“退火”。 退火溫度Tm25 ?復性影響因素 片段濃度/片段大小/片段復雜性（重復序列數(shù)目）/ 溶液離子強度 4.分子雜交分子雜交 ?DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補序列的異源 DNA單鏈 或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新 分子稱為雜交DNA分子。 ?核酸的雜交在分子生物學和遺傳學的研究中具有 重要意義。 ?Southern 雜交（Southern bolting ） ?Northern 雜交（Northern bolting ） ?Western 雜交 （Western bolting ） 四、核酸的序列測