基因克隆基因克隆genecloning或分子克隆又稱為重組DNA

1、第八章 基因克隆基因克隆(gene cloning )或分子克隆,又稱為重組DNA技術(shù)，是應(yīng)用酶學(xué)方法，在體 外將不同來源的 DNA 分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃?主細(xì)胞中進(jìn)行擴增，形成大量的子代 DNA 分子的過程?？寺?cione) 指含有單一的 DNA重組體的無性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細(xì)胞建立無性繁殖系的過程 (cloning) 。一個完整的基因克隆過程包括以下步驟：1、獲得待克隆的 DNA片段(基因)；2、目的基因與載體在體外連接；3、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；4、篩選、鑒定陽性重組子；5、重組子的擴增與/或表達(dá)。第一節(jié) 重組 DNA 中常

2、用的工具酶包括限制性核酸內(nèi)切酶、 DNA 連接酶、 DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等，一、限制性內(nèi)切酶的定義、命名和分類 限制性核酸內(nèi)切酶是識別并切割特異的雙鏈 DNA 序列的一種內(nèi)切核酸酶。 限制性核酸內(nèi)切酶的來源：細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)。分子克隆中所用的限制性核酸內(nèi)切酶屬于第n類。 限制性核酸內(nèi)切酶的命名。二、限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點1、識別位點的 DNA 序列呈二重旋轉(zhuǎn)對稱(即具有迥文結(jié)構(gòu)) ；2、切割DNA均產(chǎn)生含5-磷酸和3-羥基的末端；3、 錯位切割產(chǎn)生具有 5-或3-突出的粘性末端；而沿對稱軸切割雙鏈DNA產(chǎn)生平頭末 端，也稱鈍性末端。4、 少數(shù)不同的限制酶可識別和切割相同的位點，這些酶

3、稱為同切酶，如Mbol I和Sau3A。三、其它工具酶參考“分子克隆” ( Sambrook,J et al . molecular cloning )第二節(jié) 載體宿主系統(tǒng) 一、概述載體(vector)是攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴增和表達(dá)的DNA,它們一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。載體應(yīng)具備以下條件：1、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制；2、具有多種限制酶的單一切點(即所謂多克隆位點)以便外源DNA插入；3、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；4、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA 與宿主 DNA 便于分離；5、對于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子、增強子、

4、加尾信號等基因表達(dá)元件。宿主細(xì)胞是基因克隆中重組 DNA 分子的繁殖場所， 適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞， 必須符以下條件：1、對載體的復(fù)制和擴增沒有嚴(yán)格的限制；2、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA ;3、在重組DNA增殖過程中，不會對它進(jìn)行修飾；4、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；5、容易導(dǎo)入重組 DNA分子；6、符合重組 DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。二、質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasmid）是存在于細(xì)菌染色體外的小的共價、閉環(huán)雙鏈DNA分子，能自主復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時遺傳給子代細(xì)胞。 質(zhì)粒可賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀如抗藥性等， 通過質(zhì)粒 賦予細(xì)菌的表型可識別質(zhì)粒的存在，這是篩選重組轉(zhuǎn)化子的基礎(chǔ)。作為載體的質(zhì)粒一般具

5、有以下特點：1、分子相對較?。?siokb）；2、松馳型復(fù)制；3、具有適當(dāng)?shù)亩嗫寺∥稽c以便外源DNA 插入；4、具有插入失活篩選標(biāo)志，便于從平板上直接篩選陽性重組子；5、質(zhì)粒能攜帶的外源 DNA 片段一般較小（ 15kb）三、入噬菌體載體入噬菌體是一種雙鏈 DNA噬菌體，基因組約為 50kb+。線性入噬菌體DNA分子的兩端各有12堿基的互補單鏈序列，是天然的粘性末端，稱 為 COS 位點。入噬菌體的生活周期：溶菌（裂解）生長時在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生長。入噬菌體的基因組：左臂長約20kb,含噬菌體頭、尾蛋白編碼基因；中央片段長約12-24kb, 對噬菌體為非必需區(qū)；右臂長約10kb,

6、含入噬菌體復(fù)制和溶菌相關(guān)蛋白的編碼基因。所有入噬菌體載體均為通過切除非必需的中央?yún)^(qū)， 并增減某些限制性酶切位點和插入適當(dāng)?shù)暮Y選標(biāo) 記基因改造而成。已構(gòu)建的入噬菌體載體分為兩類：1、置換型載體：有兩個酶切位點或兩組排列相反的多克隆位點，其間的DNA 片段可被外源 DNA 置換。這類載體適于克隆 5-20kb 的外源基因片段， 常用于構(gòu)建基因組 DNA 文庫。2、插入型載體： 只有一個限制性內(nèi)切酶位點或一組多克隆位點可供外源基因插入。這類載體允許插入5-7kb的外源DNA,適于構(gòu)建cDNA文庫。如入gt噬菌體載體。 一般將噬菌體 DNA 在體外包裝成病毒顆粒后再用于感染受體菌，這樣能大大提高轉(zhuǎn)染效

7、率。四、M 13絲狀噬菌體載體M 13基因組大小為 6407bp，它是一種閉環(huán)的單鏈 DNA分子，在感染細(xì)菌后呈雙鏈復(fù) 制型 DNA 。因此用作克隆載體的雙鏈 DNA 可從細(xì)菌中分離得到。在細(xì)菌中，雙鏈 DNA 復(fù) 制 100-200 拷貝后就大量產(chǎn)生單鏈 DNA, 后者包裝成子代噬菌體顆粒，分泌到細(xì)胞外，而不 裂解細(xì)菌。在 M13 基因組中含 507 個核苷酸的非必需區(qū)， 在這個區(qū)域插入外源 DNA 不會影響 M13 的繁殖和生存，現(xiàn)在使用的 M13 載體如 M13Mp18 等均為對此區(qū)域進(jìn)行改造而獲得。M13克隆的最大問題是不能插入較大的外源DNA片段（一般 1000bp），但M13載體

8、的優(yōu)點是從細(xì)菌中釋放出來的噬菌體顆粒中含有一條與克隆的模板DNA 互補的單鏈，所以最適合于制備 DNA 測序時用的單鏈模板，另外也可用于制備單鏈特異性 DNA 探針。五、粘粒載體粘粒（柯斯質(zhì)粒）是指含有 入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒，由入DNA的COS區(qū)（約20-數(shù)百bp）與質(zhì)粒重組而成，在宿主細(xì)胞中可作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)任何噬菌體 的功能。粘粒的結(jié)構(gòu)特點：1、含有抗藥性標(biāo)記和質(zhì)粒復(fù)制起始位點；2、一個或多個單一限制酶切位點；3、帶有入噬菌體粘性末端；4、分子?。?-6kb），可容納大到40-50kb的外源DNA片段，因此適于構(gòu)建真核生物 基因組 DNA 文庫。六、酵母人工染色體載體

9、酵母人工染色體由酵母染色體的著絲粒 （cen4）、自主復(fù)制序列（ARS1）和來自四膜蟲的端 粒（Tel）等功能性DNA序列組成。它可攜帶長達(dá) 200-1000kb的DNA片段，因此在人基因組 DNA 大片段的克隆中非常有用，是染色體克隆排序的主要工具。用酵母人工染色體克隆 DNA的過程與入噬菌體相似，將 DNA大片段與載體的兩臂相 聯(lián)，然后將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母細(xì)胞中，利用載體上的選擇性標(biāo)記進(jìn)行篩選。第三節(jié) 目的基因的獲取一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫和 cDNA 文庫，兩種文庫的建庫過程不同，產(chǎn)生的基 因結(jié)構(gòu)也不同，因此應(yīng)用范圍也不相同。（一）、基因組文庫是含有某

10、種生物體（或組織、細(xì)胞）全部基因的隨機片段的重組DNA 克隆群體。用入噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的基本步驟：1、準(zhǔn)備載體 DNA（如置換型入噬菌體載體），用適當(dāng)?shù)南拗泼赶⒎蛛x得到載體的 左右兩臂；2、純化真核細(xì)胞高分子量 DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗泼覆糠窒?、分離適當(dāng)大小的基因組 DNA片段（20-24kb ）；4、連接載體與外源DNA;5、連接產(chǎn)物體外包裝及感染；6、基因組文庫的擴增。由于基因組文庫包含了染色體的所有隨機片段形成的重組DNA 克隆，因此，利用適當(dāng)?shù)暮Y選方法，就可以從中找出攜帶所需目的基因片段的重組克隆。（二）、 cDNA 文庫cDNA 是指以 mRNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的

11、作用下形成的互補 DNA. 以細(xì)胞的全部 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 組成的重組克隆群體稱為 cDNA 文庫。 從 cDNA 文庫可以獲得較完整的連續(xù)編碼序列（不含內(nèi)含子） ，便于表達(dá)成蛋白質(zhì)。 構(gòu)建 cDNA 文庫的主要步驟：1、mRNA 分離；2、cDNA 第一鏈合成；3、cDNA 第二鏈合成；4、載體與 cDNA 的連接 ;5、噬菌體的包裝及轉(zhuǎn)染；6、CDNA文庫的擴增和保存。二、化學(xué)合成法制備 DNA 片段主要用于一些小的 DNA 片段的合成。三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴增基因片段對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），以基因組DNA 或 CDNA 模板擴增得

12、到目的基因片段。第四節(jié) DNA 分子的體外連接DNA 片段的體外連接是重組 DNA 技術(shù)的關(guān)鍵。 DNA 連接是由 DNA 連接酶催化完成 的。一、DNA 連接酶DNA 連接酶催化兩年雙鏈 DNA 片段相鄰的 5-磷酸和 3-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的的 DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA連接酶：T4 DNA連接酶，該酶需要 ATP 作為輔助因子。T4 DNA 連接酶在分子克隆中主要用于：1、連接具有同源互補粘性末端的DNA片段；2、連接雙鏈 DNA分子間的平端；3、在雙鏈平端的 DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。二、粘性末端連接如果載體和插入片段具有相同的粘性末端，則

13、很容易用 DNA 連接酶連接成環(huán)狀的重 組 DNA 分子，但是要注意當(dāng)載體和插入的兩個末端均為同源的粘性末端時，連接后可能出 現(xiàn)以下問題：1、載體自身環(huán)化， 造成假陽性背景克隆， 為避免此問題， 可在連接前， 用堿性磷酸酶 將載體 DNA 5- 端去磷酸化，這樣只有載體和插入片段之間才能發(fā)生連接；2、插入片段可雙向插入；3、插入片段可多拷貝插入。當(dāng) DNA 片段兩端為非同源的粘性末端時，可實現(xiàn)定向克隆，這時的連接效率非常高， 是重組方案中最有效、簡捷的途徑。三、平端連接平端連接的優(yōu)點是可用 T4 連接酶連接任何 DNA 平端，這對不同 DNA 分子的連接十分 有利。 因為除了相同或不同限制酶酶

14、切產(chǎn)生的平末端分子外，含 3-或 5-突出的粘性末端也可以被補齊或削平，實現(xiàn)平端連接。（一）、 5-突出粘性末端的補齊限制酶降解產(chǎn)生的5-端突出的粘性末端，可用大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段（ klenow 片段）補齊。（二）、 3-突出粘性末端的削平含3突出的粘性末端可用 T4 DNA聚合酶的3宀5外切核酸酶活性補平。 平端連接的主要問題是， 它的連接效率比粘性末端低， 因此需較多的 T4 DNA 連接酶和 較高的底物濃度，聚乙二醇（PEG ）可促進(jìn)平端連接反應(yīng)。四、人工接頭連接對平端DNA片段，可借助人工合成的接頭來方便連接。所謂接頭是人工合成的至少8 個核苷酸長的一段迥文序列。 接頭是平

15、端， 在磷酸化后通過 T4 DNA 連接酶可與大多數(shù)平端DNA 連接。連接后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，可產(chǎn)生所需要的粘性末端。五、利用適配子連接適配子是人工合成的具有一個以上限制酶識別位點的短序列， 它具有一個平端， 可與其 它 DNA 的平端連接， 同時它還有某種限制酶的突出端， 可與含互補的限制酶突出端的 DNA 片段連接，連接后，用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钣挚僧a(chǎn)生所需要的突出粘端。第五節(jié) 重組 DNA 導(dǎo)入宿主菌體外連接的重組 DNA 分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。 根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組 DNA 分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。一、轉(zhuǎn)化指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體， 將外源

16、基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程。 轉(zhuǎn)化時， 細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)?處理使之處于感受態(tài)即容易接受外源 DNA 的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使 DNA 導(dǎo)入細(xì) 菌宿主中。此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。二、轉(zhuǎn)染和感染利用噬菌體 DNA 作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是感染，即在體外將噬菌 體 DNA 包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在 DNA 連接酶作 用下使噬菌體 DNA 環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌。 但習(xí)慣上常把以噬菌體 DNA 為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。第六節(jié) 重組克隆的篩選與鑒定基因克隆的最后一步

17、是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落， 并鑒定重組子 的正確性。 通過細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴增， 獲得所需的基因片段的大量拷貝。 進(jìn)一步研究 該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達(dá)該基因的產(chǎn)物。一、抗藥性標(biāo)志的篩選如果克隆載體帶有某種抗藥性標(biāo)志基因如ampr 或 tetrr ，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落， 這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別 開來。如果重組 DNA 時將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi)，該標(biāo)志基因失活，通過有無抗菌素培 養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。二、3 半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選很多載體都攜帶一段細(xì)菌的 lacZ基因

18、，它編碼3 半乳糖苷酶N-端的146個氨基酸， 稱為a 肽，載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為lacZ 15基因型，它表達(dá)3 半乳糖苷酶的 C-端肽鏈， 當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時表達(dá)兩個片段時， 宿主細(xì)胞才有 3 半乳糖苷酶活性， 使特異的底物 X-gal 變?yōu)樘m色化合物， 這就是所謂的 a 互補，而重組子由于基因插入使 a 肽基因失活， 不能形成a -互補，在含 X-gal的平板上，含陽性重組子的細(xì)菌為無色菌落或噬菌斑。三、菌落快速裂解鑒定法從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小，判斷有無插入片段存在， 該法適于插入片段較大的重組子初篩。四、內(nèi)切酶圖譜鑒定經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割， 釋放出插入片斷； 對于可能存在雙向插入