細(xì)胞免疫組化步驟

1、細(xì)胞免疫組化步驟標(biāo)準(zhǔn)化管理處編碼BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N細(xì)胞免疫組化步驟(2010-06-19 21:40:50)細(xì)胞免疫組化（SABC法）步步看: 細(xì)胞凍存夠了，且狀態(tài)良好！咋們就開始做細(xì)胞免疫組化吧！開始做實驗了，先看要準(zhǔn)備 些什么吧!實驗準(zhǔn)備:實驗用品:移液槍：ImK 200uK lOul槍頭：Iml、200ulx lOul槍頭盒：ImK 200uK lOulEP管:濕盒需要滅菌的東西：培養(yǎng)皿（可以是fi復(fù)用的）、細(xì)胞爬片（多聚賴氨酸處理，并經(jīng)過環(huán) 氧乙烷消毒）、常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)物品。試劑:細(xì)胞消化液、完全培養(yǎng)基、4%多聚賴氨酸、0. 01M PBS （）、3%

2、H2O2 （現(xiàn)配）、%TxitonX-100.濃縮型SABC試劑盒（血清封閉液、二抗、三抗SABC）、蘇木素、ddH20、DAB顯色試劑盒操作步驟:細(xì)胞爬片的制作細(xì)胞用消化液消化后，用完全培養(yǎng)基重懸（4-5011）或者密度為l-5xl06/ml2、在滅菌的培養(yǎng)皿中鋪上3塊細(xì)胞爬片（圓片），圓片間不要重疊3、取細(xì)胞懸液分別滴到圓片上，注意不要滴到圓片外，讓細(xì)胞貼片SOmin左右4、30inin后，在培養(yǎng)皿中補加完全培養(yǎng)液（輕微的加入，以免沖力將貼壁的細(xì)胞打下來）,放于37 C, 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h左右（讓其貼壁更牢）。組化前處理取出培養(yǎng)皿，用PBS漂洗2x2inin （PBS可以不滅菌）

3、2、4%多聚甲醛處理（室溫）20inin；3、PBS 漂洗，3x2inin；4、5、PBS 漂洗，3x2inin；6、3%H2O2 處理（室溫）ISmim7、PBS 漂洗，3x2inin；%Txiton X-100 處理（室溫）20inin；組化1、血清封閉：試劑盒中的血清封閉液，37。C, 20inin；2、取出甩干封閉液（不漂洗）；一抗（1： 200） （PBS稀釋），陰性對照用PBS代替一抗，37 Cl-2h 或 4 C 過夜;3、PBS 漂洗，3x2inin；4、5、PBS 漂洗，3x2inin；二抗孵育：試劑盒中的生物素化.37* C, 20inin；6、SABC 孵育：濕盒內(nèi) 37

4、 C, 20inin；7、PBS 漂洗，3x4min；8、DAB顯色：DAB試劑盒中的A、B、C三種試劑，我是按照500ul蒸佛水中各加4ul,混勻。在鏡下觀察顯色悄況，在沒有背景色的條件下可繼續(xù)顯色。一般在2-lOmin9、自來水沖洗;10、蘇木素復(fù)染，15-30s；自來水沖洗;12、封片劑封片（有細(xì)胞一面對著載玻片），鏡下觀察若要氏期保存片子，可以對爬片進(jìn)行脫水處理:70% （1 次，Imin） -80% （1 次，Imin） -95% （1 次，Imin）-無水乙醇（2x3min） 甲 苯（2xlinin）,觀察是否徹底脫水，看觀察片子放入二甲苯時，容器周W有白色霧狀產(chǎn) 生，若有則說明脫水不徹底?？芍匦逻M(jìn)行!得到結(jié)果：實驗組中，細(xì)胞漿為棕黃色，細(xì)胞和為藍(lán)紫色；陰性細(xì)胞中，只有核被染為藍(lán) 色，胞漿無色！在此抱歉不能將圖片上傳，還得