兩個(gè)α–葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性及轉(zhuǎn)苷作用

1、兩個(gè)葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性及轉(zhuǎn)苷作用低聚異麥芽糖包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等，α–葡萄糖苷酶（α-transglucosidase,E.C.2.4.1.24）可轉(zhuǎn)移葡萄糖基到麥芽糖、葡萄糖等底物分子上進(jìn)而獲得低聚異麥芽糖。研究1發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)α–葡萄糖苷酶較高的微生物主要是黑曲霉（Aspergillus niger），目前的研究主要集中在酶基因的克隆及高效表達(dá)2–4方面，而針對(duì)不同基因編碼的酶的性質(zhì)比較及轉(zhuǎn)苷應(yīng)用分析報(bào)道較少。α–葡萄糖苷酶同時(shí)具有水解和轉(zhuǎn)苷兩種活性，不同的α–葡

2、萄糖苷酶所表現(xiàn)出的這兩種活性具有較大的差異。在低聚異麥芽糖生產(chǎn)中，針對(duì)不同生產(chǎn)目的，如對(duì)低聚異麥芽糖產(chǎn)品不同成分、不同濃度、不同純度等的要求，需要選擇具有不同轉(zhuǎn)苷活性或水解活性的酶。GenBank 中已報(bào)道的編碼α–葡萄糖苷酶基因有 7 個(gè)，這 7 個(gè)基因之間 DNA 相似性程度較低，不到 40%,氨基酸序列相似性也只有 25%左右，為了分析這些不同的α–葡萄糖苷酶的功能和應(yīng)用特性，本文選取其中 DNA 和氨基酸序列相似度較高（均在 50%左右）的兩個(gè)α–葡萄糖苷酶 A（Glu-A）和α–葡萄糖苷酶

3、 B（Glu-B）為研究對(duì)象，首先實(shí)現(xiàn)了這兩個(gè)酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)，并主要對(duì)這兩個(gè)酶的酶學(xué)性質(zhì)及轉(zhuǎn)苷作用進(jìn)行比較分析，為研究其他幾種酶的酶學(xué)性質(zhì)和酶的功能與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，也可為α–葡萄糖苷酶在低聚異麥芽糖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。1 材料與方法1.1 菌株畢赤酵母工程菌 P. ,pastoris A、P., pastoris B,由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2 培養(yǎng)基YPG 固體培養(yǎng)基：酵母粉 5,g、蛋白胨 10,g、甘油10,g、瓊脂 5,g,溶解于 500,mL 水中。121,滅菌20,min.BMGY 培養(yǎng)基：酵母粉 5,g、蛋白胨 12,g,溶解于420,m

4、L 水中。121,滅菌 20,min.冷卻至室溫加入60,mL 1,mol/L 的磷酸鉀緩沖液、60,mL 酵母氮源、1.2,mL 生物素溶解液、60,mL 甘油溶解液。BMMY 培養(yǎng)基：酵母粉 6,g、蛋白胨 12,g,溶解于 420,mL 水中。121,滅菌 20,min.冷卻至室溫加入 60,mL 1,mol/L 的磷酸二氫鉀–磷酸氫二鉀緩沖液、60,mL 酵母氮源、1.2,mL 生物素溶解液、60,mL甲醇溶解液。1.3 酶活的測(cè)定方法采用 QB 2525-2001食品添加劑·α–葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的方法進(jìn)行酶活的測(cè)定：用α&nd

5、ash;葡萄糖苷酶作用底物α–甲基–D–葡萄糖苷生成葡萄糖，所生成的葡萄糖與含有葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶的 4–氨基安替比林和酚試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)來(lái)定量測(cè)定。在此實(shí)驗(yàn)條件下，在 2.5,mL 上述混合物的反應(yīng)體系中，60,min 產(chǎn)生 l ?g 葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)α–葡萄糖苷酶活力單位。1.4 酶學(xué)性質(zhì)分析1.4.1 酶的最適反應(yīng)溫度及穩(wěn)定性將兩種畢赤酵母工程菌產(chǎn)α–葡萄糖苷酶酶液取2,mL 分別置于 1090,的條件下取樣測(cè)定酶活，以最高酶活為相對(duì)酶活 100%.在 pH 5.0

6、 條件下，將酶液在不同的溫度下保溫 0.5,h,將不進(jìn)行溫度處理的酶液作為相對(duì)酶活 100%.1.4.2 酶的最適反應(yīng) pH 及穩(wěn)定性在 4,反應(yīng)條件下，用磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉–磷酸二氫鉀緩沖液配制 pH 分別為2、3、4、5、6、7、8、9,質(zhì)量濃度為 20,g/L 的α-甲基-D–葡萄糖苷底物溶液。測(cè)定兩種酶的酶活力。以最高酶活計(jì)為 100%.在室溫條件下，將酶液分別置于不同 pH 條件下，保溫 0.5,h,測(cè)定酶活力，將未進(jìn)行處理的酶液計(jì)為 100%.1.5 轉(zhuǎn)苷實(shí)驗(yàn)及產(chǎn)物成分分析用 pH 為 5 的緩沖液配制質(zhì)量濃度為 2

7、00,g/L 的麥芽糖溶液 50,mL 裝入 250,mL 三角瓶中。α–葡萄糖苷酶加酶量為 36,U/mL,封住瓶口，將三角瓶置于55,水浴搖床進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng) 30,h.取樣測(cè)定各種低聚糖的含量，分析轉(zhuǎn)苷結(jié)果。轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物成分分析采用高效液相色譜法。色譜條 件 :Prevail Carbohydrate 色 譜 柱 （250,mm ×4.6,mm），流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù) 75%乙腈水溶液，柱溫30, ,流 量 1,mL/min ,進(jìn)樣量 10,?L ,蒸 發(fā)溫度90,，蒸發(fā)氣體流量 2.0,L/min.2 結(jié)果與分析2.1 兩種α–葡萄糖苷酶

8、酶學(xué)性質(zhì)2.1.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性溫度對(duì)兩種α–葡萄糖苷酶的酶活力影響結(jié)果如圖 1 所示。由圖 1 可知：兩種α–葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度均為 50,。在溫度大于 30,時(shí)，酶活力迅速上升，在 4060,酶活保持較為穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)溫度超過(guò) 60,時(shí)，兩種酶的酶活均迅速下降。α–葡萄糖苷酶 Glu-A 在 80,時(shí)就已經(jīng)失活，而 Glu-B 在80,時(shí)的酶活也很低，在 90,時(shí)完全失活。將兩種酶液在不同的溫度條件下保溫 0.5,h 后，測(cè)定酶活力結(jié)果如圖 2 所示。在 1060,時(shí)兩種酶酶活力保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，Glu-A

9、 穩(wěn)定性高于 Glu-B.在溫度高于 60,時(shí)，酶活力迅速下降。2.1.2 最適 pH 及 pH 穩(wěn)定性pH–酶活力曲線如圖 3 所示。pH–酶活力穩(wěn)定性曲線如圖 4 所示。由圖 3 可知：α–葡萄糖苷酶 Glu-A 的酶活最適pH 為 5,α–葡萄糖苷酶 Glu-B 的酶活最適 pH 為6.由圖 4 可知：Glu-A 的 pH 穩(wěn)定范圍為 56,穩(wěn)定范圍較窄，當(dāng) pH 低于 5 或高于 6 時(shí)，酶活力迅速下降。Glu-B 的 pH 穩(wěn)定性范圍較寬，在 pH 57 之間均能保持一定的酶活力。2.2 轉(zhuǎn)苷作用及產(chǎn)物分析利用麥

10、芽糖作為底物，配制質(zhì)量濃度為 200,g/L的麥芽糖溶液，加入α–葡萄糖苷酶進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分析5,兩種α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷麥芽糖結(jié)果如圖 5、圖 6 所示，生成率數(shù)值見表 1.通過(guò)圖 5、圖 6 及表 1 可以發(fā)現(xiàn)，不同目的基因來(lái)源于黑曲霉的兩種畢赤酵母工程菌所產(chǎn)α–葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷麥芽糖的結(jié)果不同。Glu-A 轉(zhuǎn)化麥芽糖生成潘糖的效率最高，潘糖的生成率達(dá)到了 31.41%,其次為異麥芽糖的生成率為 15.79%,最低為異麥芽三糖，生成率為 4.18%.Glu-B 轉(zhuǎn)化麥芽糖生成的產(chǎn)物中異麥芽糖及異麥

11、芽三糖的生成率較高，分別為 16.71%、15.85%,潘糖最低，為 4.15%.這一結(jié)果可能是由于這兩種不同的α–葡萄糖苷酶基因序列的差異，以及氨基酸組成的不同而導(dǎo)致轉(zhuǎn)苷過(guò)程中對(duì)葡萄糖苷元的偏好不同，出現(xiàn)了不同的轉(zhuǎn)苷結(jié)果6.3 討 論通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的畢赤酵母重組菌株P(guān).,pastoris A 和 P.,pastoris B 所表達(dá)的α–葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，兩種酶的酶學(xué)性質(zhì)基本相同。Glu-A 和 Glu-B 的最適溫度均為 50,，1060,時(shí)酶活力均保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。最適溫度比報(bào)道中黑曲霉所產(chǎn)的α–葡萄

12、糖苷酶最適反應(yīng)溫度 55,略低7.兩種酶的最適 pH 分別為 5、6;pH 穩(wěn)定性范圍分別為 56 和 57,pH 穩(wěn)定范圍具有一定的差異性，Glu-B pH 穩(wěn)定范圍較 Glu-A 的 pH 穩(wěn)定范圍寬。日本田野制藥株式會(huì)社所生產(chǎn)的α–葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度為 65,，最適 pH 為 5.08.在轉(zhuǎn)苷作用方面，不同基因編碼的α–葡萄糖苷酶具有不同的轉(zhuǎn)苷效果，Glu-A 和 Glu-B 轉(zhuǎn)苷麥芽糖后，總低聚異麥芽糖生成率分別為 51.04%和 35.85%,Chen 等9從黑曲霉中獲得α–葡萄糖苷酶基因構(gòu)建載體并在畢赤酵母

13、工程菌中表達(dá)，所得酶以異麥芽糖為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，總低聚異麥芽糖生成率為 26%.本文中的Glu-A 偏向于將α–1,4 糖苷鍵打開，使游離出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到麥芽糖上形成α–1,6 糖苷鍵，因而麥芽糖轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物中潘糖的量高。而 Glu-B 則偏向于將α–1,4 糖苷鍵打開，使游離出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到葡萄糖和異麥芽糖上形成α–1,6 糖苷鍵，最終轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物中異麥芽糖及異麥芽三糖的量較高。本實(shí)驗(yàn)證實(shí) Glu-A和 Glu-B 雖然都來(lái)源于黑曲霉，但α–葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)及轉(zhuǎn)苷作用存在著一定的差異性，這將為利用不同α–葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷作用生產(chǎn)低聚異麥芽糖的研究提供依據(jù)和參考。參考文獻(xiàn)：1 童星，唐秋嵩，吳玉飛，等。 黑曲霉α–葡萄糖苷酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)J. 微生物學(xué)報(bào)，2009,49（2）：262–268.2 謝振榮，幕躍林，顏麗娟，等。 α–葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株H