醫(yī)學微生物學：實驗5

1、實驗五實驗五 l示教示教: :細菌代謝產(chǎn)物檢查細菌代謝產(chǎn)物檢查 l 腸道桿菌在選擇鑒別培養(yǎng)基的生長情況腸道桿菌在選擇鑒別培養(yǎng)基的生長情況 l 數(shù)碼鑒定數(shù)碼鑒定 l 肥達試驗肥達試驗 l學生操作：肉湯增菌結果血平板接種學生操作：肉湯增菌結果血平板接種 l 標本標本SSSS平板接種平板接種 l病例一病例一22、病例二、病例二11、病例三、病例三11討論討論 細菌代謝產(chǎn)物檢查細菌代謝產(chǎn)物檢查 l1.1.細菌的糖發(fā)酵試驗細菌的糖發(fā)酵試驗 l2.2.靛基質(zhì)產(chǎn)生試驗靛基質(zhì)產(chǎn)生試驗 l3.3.甲基紅試驗甲基紅試驗 l4.V-P4.V-P試驗試驗 l5.5.枸櫞酸鹽利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗 l6.6.硫化氫產(chǎn)

2、生試驗硫化氫產(chǎn)生試驗 l7.細菌菌落色素觀察細菌菌落色素觀察 l8.細菌溶血現(xiàn)象細菌溶血現(xiàn)象 l9.動力實驗動力實驗 IMViC 產(chǎn)酸產(chǎn)酸 不發(fā)酵不發(fā)酵 產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸產(chǎn)氣 細菌糖酶分解作用細菌糖酶分解作用 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 變變 紅紅 + 變變 紅紅 ， 氣氣 泡泡 + 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 不不 變變 色色 - 糖類糖類 指示劑：安氏指示劑 l細菌的糖發(fā)酵試驗細菌的糖發(fā)酵試驗 靛基質(zhì)靛基質(zhì)(吲哚吲哚)產(chǎn)生試驗產(chǎn)生試驗 某些細菌能分解蛋白胨中的某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸色氨酸，生成吲，生成吲 哚。吲哚的存在可用顯色反應表現(xiàn)出來。吲哚與哚。吲哚的存在可用顯色反應表現(xiàn)出來。吲哚與 對二甲基氨基苯醛

3、結合，形成玫瑰吲哚，為玫瑰對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為玫瑰 紅色化合物。紅色化合物。 結果：結果： 試劑與培養(yǎng)物接觸面之間有試劑與培養(yǎng)物接觸面之間有玫瑰紅玫瑰紅 出現(xiàn)這為陽性，沒有玫瑰紅色為陰性出現(xiàn)這為陽性，沒有玫瑰紅色為陰性 甲基紅試驗 葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸 甲酸甲酸. .乙酸乙酸. .乳酸乳酸 腸桿菌科腸桿菌科 分解分解 pHpH降到降到4.54.5以下以下 產(chǎn)酸少或轉化產(chǎn)酸少或轉化 成其他物質(zhì)，成其他物質(zhì)， pH6.2pH6.2以上以上 甲基紅甲基紅（黃色黃色） 甲基紅甲基紅（紅色）（紅色） V-P試驗 葡萄糖葡萄糖 細細 菌菌 脫羧脫羧 O O2 2氧化氧化 + 蛋白胨

4、（蛋白胨（精氨酸胍基精氨酸胍基） 紅色紅色化合物（化合物（+） 堿堿 性性 環(huán)環(huán) 境境 分分 解解 一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別 丙酮酸丙酮酸 乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇 （中性）（中性） 二乙二乙 酰酰 指示劑：李氏試劑 枸櫞酸鹽利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗 細菌如產(chǎn)氣桿菌細菌如產(chǎn)氣桿菌 溴麝香草酚蘭溴麝香草酚蘭指示劑指示劑 由由綠色綠色變變藍色藍色（陽性陽性） 分解分解 碳酸鹽碳酸鹽 培養(yǎng)基變堿性培養(yǎng)基變堿性 枸櫞酸鹽培養(yǎng)基枸櫞酸鹽培養(yǎng)基 枸櫞酸鈉枸櫞酸鈉碳源碳源 硫化氫產(chǎn)生試驗硫化氫產(chǎn)生試驗 培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中 胱氨酸胱氨酸 ( (含硫氨基酸含硫氨基酸) ) 細細 菌菌 硫化氫硫化氫 + +鉛鹽

5、鉛鹽( (或鐵鹽或鐵鹽) ) 黑褐色硫化鉛或黑褐色硫化鉛或 硫化鐵沉淀物硫化鐵沉淀物 結果：結果： 穿刺接種細菌至醋酸鉛培養(yǎng)基中。穿穿刺接種細菌至醋酸鉛培養(yǎng)基中。穿 刺線部位黑褐色為陽性，不變色為陰性刺線部位黑褐色為陽性，不變色為陰性 分解分解 動力試驗動力試驗 細菌菌落的色素現(xiàn)象觀察細菌菌落的色素現(xiàn)象觀察 l金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌普通平板普通平板 l綠膿色素綠膿色素平板平板 細菌菌落的溶血現(xiàn)象觀察細菌菌落的溶血現(xiàn)象觀察 腸道桿菌在選擇鑒別培養(yǎng)基的生長情況腸道桿菌在選擇鑒別培養(yǎng)基的生長情況 l SSSS瓊脂培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基 成分成分：牛肉膏，蛋白胨牛肉膏，蛋白胨：營養(yǎng)物：營養(yǎng)物 膽鹽膽鹽

6、：大腸菌群抑菌劑，：大腸菌群抑菌劑，抑制其它雜菌，特別是革蘭抑制其它雜菌，特別是革蘭 氏陽性菌的生長。能促進某些病原菌的生長。氏陽性菌的生長。能促進某些病原菌的生長。 硫代硫酸鈉硫代硫酸鈉：緩和膽鹽對志賀菌和沙門菌的：緩和膽鹽對志賀菌和沙門菌的 有害作用并中和煌綠及中性紅染料的毒性有害作用并中和煌綠及中性紅染料的毒性 枸櫞酸鐵枸櫞酸鐵：指示硫化氫的產(chǎn)生，菌落中心呈：指示硫化氫的產(chǎn)生，菌落中心呈 黑色黑色 0.1%0.1%煌綠：煌綠：三苯甲烷染料，大腸菌群抑菌劑，三苯甲烷染料，大腸菌群抑菌劑，抑制其抑制其 它雜菌，特別是革蘭它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。氏陽性菌的生長。 其他：其他：乳糖乳糖

7、 0.1%0.1%中性紅中性紅 蒸餾水蒸餾水 是分離沙門菌及志賀菌屬的是分離沙門菌及志賀菌屬的強選擇培養(yǎng)基強選擇培養(yǎng)基。 抑制非病原菌抑制非病原菌 腸道桿菌在選擇鑒別培養(yǎng)基的生長情況腸道桿菌在選擇鑒別培養(yǎng)基的生長情況 l 雙糖鐵培養(yǎng)基雙糖鐵培養(yǎng)基 成份： 蛋白胨水、酚紅指示劑、瓊脂、硫代硫酸鈉、 硫酸亞鐵銨、乳糖（1%）、葡萄糖（0.1%） 原理：原理： 1.1.細菌分解細菌分解葡萄糖、乳糖葡萄糖、乳糖產(chǎn)酸；產(chǎn)酸； 2.2.酚紅酚紅指示劑在酸性條件下顯示黃色，指示劑在酸性條件下顯示黃色， 堿性條件下顯紫紅色；堿性條件下顯紫紅色； 3.3.致病菌致病菌分解葡萄糖而不分解乳糖。分解葡萄糖而不分解乳

8、糖。 1.分解葡萄糖不分解乳糖：乳糖（1%）含量遠大于 葡萄糖（0.1%） 產(chǎn)少量酸。 上層培養(yǎng)基 CO2 H2O 堿，變紅 下層培養(yǎng)基：無 O2，酸性，黃色 2.分解葡萄糖又分解乳糖：乳糖（1%）含量多，產(chǎn) 生大量酸 上下層都變黃 O2 大腸埃希菌 上下都為黃色 痢疾志賀菌 上紅下黃 傷寒沙門菌 上紅下黃，黑色FeS 中國藍培養(yǎng)基 1.1.成份成份 蛋白胨蛋白胨 1g 1g 乳糖乳糖 1g1g K K2 2HPOHPO4 4 0.2g 1% 0.2g 1%中國藍中國藍 1ml1ml 無糖瓊脂無糖瓊脂 20g 1%20g 1%玫瑰酸酒精溶液玫瑰酸酒精溶液 1ml1ml 原理 1.1.中國藍和玫

9、瑰酸在不同中國藍和玫瑰酸在不同pHpH中的顏色變化：中的顏色變化： 酸性酸性 堿性堿性 中國藍中國藍 藍色藍色 無色或淡藍色無色或淡藍色 玫瑰酸玫瑰酸 黃色黃色 淡紅色淡紅色 該培養(yǎng)基制成后，該培養(yǎng)基制成后，pHpH約約7.47.4，呈淡紫色。，呈淡紫色。 2.2.中國藍在培養(yǎng)基中起指示作用，能分解乳中國藍在培養(yǎng)基中起指示作用，能分解乳 糖產(chǎn)酸的細菌使培養(yǎng)基糖產(chǎn)酸的細菌使培養(yǎng)基pHpH下降，菌落成藍下降，菌落成藍 色；不分解乳糖的細菌則形成無色菌落。色；不分解乳糖的細菌則形成無色菌落。 3.3.玫瑰酸對一般革蘭陽性菌的生長有抑制作玫瑰酸對一般革蘭陽性菌的生長有抑制作 用，故中國藍玫瑰酸平板不易

10、污染。用，故中國藍玫瑰酸平板不易污染。 4.4.用途：分離沙門菌及志賀菌等腸道致病菌用途：分離沙門菌及志賀菌等腸道致病菌 大腸埃希菌 痢疾志賀菌 傷寒沙門菌 深藍色菌落，培養(yǎng)基也可呈藍色 無色菌落，培養(yǎng)基淡紫色 無色菌落，培養(yǎng)基淡紫色 伊紅美藍培養(yǎng)基（EMB） l成份：成份： 肉膏湯瓊脂：肉膏湯瓊脂：100ml100ml 乳糖：乳糖：1g1g 2%2%伊紅：伊紅：2ml2ml 0.5%0.5%美藍：美藍：1ml1ml l原理：原理： 細菌分解乳糖細菌分解乳糖產(chǎn)酸：伊紅產(chǎn)酸：伊紅+ +美藍美藍紫黑紫黑/ /紫紅紫紅 大腸埃希菌 痢疾志賀菌 傷寒沙門菌 紫黑色菌落，有金屬光澤 無色半透明菌落 無色

11、半透明菌落 糞便糞便 標本標本 接種接種 EMB 瓊脂瓊脂 平板平板 數(shù)碼鑒定 l原理： 計算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個細菌條目對系統(tǒng)中每 個生化反應出現(xiàn)頻率總和。計算單項總發(fā)生頻 率和多項總發(fā)生頻率，得出鑒定百分率，按鑒 定百分率大小排序，查碼，經(jīng)查閱檢索或電腦 軟件將數(shù)字轉化成細菌名稱 數(shù)碼鑒定 l 鑒定概率(%id)- 表示某個菌的性狀與分類單元之 間的密切程度。 l T ：表示某個菌的性狀與每一個分類單元的最典 型反應之間的關系，即期望值。在01之間，與 不典型試驗成反比。 最好的鑒定%id99.9，T0.75 很好的鑒定%id99.0，T0.5 好的鑒定%id90.0，T0.25 識別力低%

12、id80.0，T0 API 20 NE反應板反應板 第1位數(shù)第2位數(shù)第3位數(shù)第4位數(shù)第5位數(shù)第6位數(shù)第7位數(shù) 鑒 定 結 果 O N P G 精 氨 酸 賴 氨 酸 鳥 氨 酸 檸 檬 酸 硫 化 氫 尿 酶 I P A 吲 哚 V - P 明 膠 葡 萄 糖 甘 梨 醇 肌 醇 山 梨 醇 鼠 李 糖 蔗 糖 蜜 二 糖 苦 杏 仁 甙 阿 拉 伯 糖 氧 化 酶 124124124124124124124 反應 結果 梅 氏 弧 菌 應得 數(shù)值 124020100104104020000 組合 編碼 7215520 編碼鑒定結果示例編碼鑒定結果示例 (%id=99.9, T=0.74 )

13、肥達試驗肥達試驗 (Widal test) 人感染傷寒或副傷寒沙門菌后，經(jīng)過人感染傷寒或副傷寒沙門菌后，經(jīng)過 一段時間，血清內(nèi)出現(xiàn)特異性抗體，此種一段時間，血清內(nèi)出現(xiàn)特異性抗體，此種 抗體與傷寒或副傷寒沙門菌結合后，能出抗體與傷寒或副傷寒沙門菌結合后，能出 現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象?，F(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 患者血清患者血清 特異性特異性AbAb 傷寒傷寒 副傷寒副傷寒 沙門菌（沙門菌（Ag） 凝集凝集 方法及結果方法及結果 待檢血清倍比稀釋待檢血清倍比稀釋 無血清無血清 傷寒傷寒O抗原抗原 1：201：401：801：1601：3201：640 對照對照 傷寒傷寒H抗原抗原 1：201：401：8

14、01：1601：3201：640 對照對照 甲副甲副H抗原抗原 1：201：401：801：1601：3201：640 對照對照 乙副乙副H抗原抗原 1：201：401：801：1601：3201：640 對照對照 +：液體清澈透明，菌體全部形成凝塊于管底者； +：液體較透明，大部分菌體凝集沉于官底者 ； +：液體稍混濁，可見較多細小凝集者； +：液體較渾濁，可見到細小凝集塊者； -：液體混濁，無凝集者。 血清凝集效價：血清凝集效價： (抗體滴度抗體滴度) 與定量與定量Ag產(chǎn)生明顯凝集（產(chǎn)生明顯凝集（+）的血清最高稀釋倍數(shù)）的血清最高稀釋倍數(shù) 結果分析 傷寒沙門菌“O” 效價1：80 “H”

15、效價1：160 副傷寒沙門菌“H”效價1：80 O、H效價正常值，腸熱癥可能性大 正常值，可能性小 O高H不高：感染早期或交叉反應 O不高H高：預防接種、非特異性回憶反應 有診斷價值有診斷價值 病例一2討論 l患者入院后呼吸困難進行性加劇，血壓下降 ，BP 95/50 mmHg。立即給予吸氧、補液 和莫西沙星治療。胸部X線片顯示：雙肺下 部中、外帶多發(fā)性斑片狀陰影。B超顯示： 左側胸腔、腹腔少量積液，心包腔積液，右 股部膿腫（低回聲區(qū)大小22.5cm）。動 脈血氣分析顯示：I型呼吸衰竭，呼吸性堿 中毒。肝功、腎功、心肌酶譜檢查均異常。 行胸腔和腹腔穿刺抽出少量血性液體。 病例一2討論 l患者哪

16、些器官/系統(tǒng)檢查出現(xiàn)了異常？你認 為原因是什么？ l引起患者感染的可能的病原體是什么？在 你所學的病原體中，哪些可以引起上述癥 狀？應采用哪些微生物學檢查方法進行診 斷和鑒別？ l討論患者的治療策略。 病例一2分析 l膿毒血癥、感染性休克、多器官功能衰竭 l化膿性細菌：球菌、桿菌、厭氧菌等 菌落形態(tài)觀察、染色鏡檢、生化試驗、分 子診斷試驗、血清學試驗等 l對癥支持、抗感染（藥敏）等 病例二1討論 l 患者男性，19歲，廣州某大學二年級學生。 l 主述：昨晚宵夜食用了生牛肉刺身，今早開始惡心、腹痛 ，已有1次嘔吐，7次腹瀉，腹瀉量多，呈稀水樣。 l 病史：既往體檢無胃腸道慢性炎癥或潰瘍史，無過敏

17、史， 無消化道腫瘤家族史。近期大便正常，此前4小時突然出現(xiàn) 惡心、陣發(fā)性腹痛與腹瀉，無寒顫。近期，未曾接觸過有 此類癥狀患者，未長期服用過抗生素。 l 查體：體溫38.1，血壓134/75 mmHg，脈搏100次/分， 呼吸16次/分。腹部無反跳痛，上腹輕微壓痛。肝脾未觸及 。心肺正常。 l 實驗室檢查：大便常規(guī)：糞便稀液狀、色淡、有腥臭，鏡 檢見中性粒細胞，極少紅細胞。血常規(guī)：白細胞6.7109/L ，其中淋巴細胞占32.3，中性粒細胞58.8 病例二1討論 l總結患者的主要臨床癥狀、查體及實驗室 檢查異常。 l初步診斷是什么？應與哪些疾病做鑒別？ l可以引起該病的病原體主要有哪些？ l取何

18、種標本，如何進行微生物學檢查？ 病例二1分析 l急性胃腸炎 l致病菌：沙門菌、志賀菌等； 條件致病菌：大腸桿菌、產(chǎn)氣、變形桿菌等 l糞便標本：盡量取膿血或粘液部分 使用抗生素前 l食物中毒：嘔吐物、可疑食物標本 l肉湯增菌結果血平板接種肉湯增菌結果血平板接種 平板分區(qū)劃線接種平板分區(qū)劃線接種 l糞便標本糞便標本SS平板接種平板接種 棉拭子涂布棉拭子涂布 接種環(huán)分區(qū)劃線接種環(huán)分區(qū)劃線 l 糞便、肛拭標本糞便、肛拭標本 SS平板平板 挑取無色、半透明的可疑致病菌菌落挑取無色、半透明的可疑致病菌菌落 雙糖鐵平板：純分離及初步鑒定雙糖鐵平板：純分離及初步鑒定 據(jù)雙糖鐵平板初步鑒定結果，選擇可疑菌株進一步作系列據(jù)雙糖鐵平板初步鑒定結果，選擇可疑菌株進一步作系列 生化反應及動力檢查，并用相應的腸道桿菌診斷血清作玻生化反應及動力檢查，并用相應的腸道桿菌診斷血清作玻 片凝集試驗進行細菌的種、型別鑒定及藥敏試驗片凝集試