細(xì)胞與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)：4Bax表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)

1、細(xì)胞與遺傳實(shí)驗(yàn) 上一周的實(shí)驗(yàn)結(jié)果上一周的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 v細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果 v細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 Gimsa染色-細(xì)胞形態(tài) Hochest染色-細(xì)胞核形態(tài) v下一步的實(shí)驗(yàn)？ Control GD DDP20DDP40DDP60 凋亡相關(guān)基因凋亡相關(guān)基因 BaxBax的表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)的表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 免免 疫疫 細(xì)細(xì) 胞胞 化化 學(xué)學(xué) 原原 理理 免疫細(xì)胞化學(xué)是將抗原、抗體間的免疫反應(yīng)引 入細(xì)胞標(biāo)本，并通過對(duì)其所帶有的特殊標(biāo)記物的 顯示，籍以對(duì)細(xì)胞內(nèi)某抗原作定性、定位以及定 量檢測(cè)。 antigen Bcl-2 家族成員家族成員 Bax vOnce activated, the normally cy

2、toplasmic Bax assumes a conformation that exposes its C- terminal membrane insertion domain allowing it to integrate into the outer mitochondrial membrane. vBax6A7抗體： 構(gòu)象特異性的抗體，識(shí)別Bax的膜插入片段，僅 在Bax構(gòu)象發(fā)生改變、活化后才能與之結(jié)合 SABC (StreptAvidin -biotin- peroxidase complex 鏈酶親和素 生物素 過氧化物酶 復(fù)合物) DAB：3,3-二氨基聯(lián)苯胺 DAB顯色顯

3、色 vIn the presence of H202 (hydrogen peroxide) DAB is converted to an insoluble brown reaction product by the enzyme HRP (horse radish peroxidase) vthe reaction is something like this: DAB + H202 DAB reaction product+ H20 HRP 器材與試劑器材與試劑 儀器：移液槍、槍頭、顯微鏡、濕盒、96孔板 材料：培養(yǎng)細(xì)胞 試劑：甲醇、PBS、封閉液、一 抗、 二抗、 SABC、DAB 、

4、0.3H2O2-PBS、 試試 劑劑 說說 明明 v PBS： 磷酸鹽緩沖液（0.01M,PH7.4） v 封閉液： 5%BSA v 一 抗： Bax6A7，用時(shí)PBS稀釋（1：300） v 二抗： 生物素山羊抗小鼠IgG v SABC (StreptAvidin-biotin-peroxidase complex ) vDAB(diaminobenzidine)顯色液（現(xiàn)配） ： 3,3-二氨基聯(lián)苯胺 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 (Day 1 and 2) 接種5104/ml細(xì)胞于96孔板，每孔200ul培養(yǎng)液；分為五組， 每組三個(gè)平行孔；37oC、5%CO2培養(yǎng)24h（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期） -此時(shí)屬正常培養(yǎng)

5、，高糖培養(yǎng)基（10%DMEM） 1、24h后，Control 組繼續(xù)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng) 2、24h后，無糖損傷組棄去培養(yǎng)液，隨后加入無糖培養(yǎng)基培 養(yǎng)（棄去或加入培養(yǎng)基時(shí)均應(yīng)小心）繼續(xù)培養(yǎng)24h - GD組 3、24h后，DDP（順鉑）組棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為 20umol/l，40umol/l， 60umol/l的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 (Day 3) v4.PBS洗，2次 ，3min/次 v5.甲醇固定6min v6.PBS洗，3次，3min/次 v7.加入封閉液, 25l，37 ，30min v8.吸棄上清液；加一抗（1:300）25l，37 ， 12h，4 過夜 實(shí)驗(yàn)

6、步驟實(shí)驗(yàn)步驟 (Day 4) v9.PBS洗3次，3min/次 v10.加二抗25l，37 ，1h以上 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 (Day 4) v11.PBS洗，3次，3min/次 v12.加0.3 H2O2-PBS，37 ，30min v13.PBS洗，3次，3min/次 v14.SABC工作液 25l，37 ，30min v15.PBS洗，3次，3min/次 v16.DAB顯色，鏡下控制，蒸餾水終止反應(yīng) v觀察結(jié)果 結(jié)果觀察結(jié)果觀察 v1.細(xì)胞的染色情況，包括整體細(xì)胞的染色密度以 及深染細(xì)胞數(shù) v2.細(xì)胞的密度 v3.細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 v4. 缺糖前 hela 細(xì)胞 缺糖 24h hela細(xì)胞

7、缺糖 48h hela 細(xì)胞 缺糖前 PC 12細(xì)胞 缺糖 24 h PC 12細(xì)胞 缺糖 48 h PC 12細(xì)胞 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) v一抗的稀釋度、孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度、背 景有直接關(guān)系。一般來說，陽性染色強(qiáng)度不夠時(shí)， 可提高一抗?jié)舛群脱娱L(zhǎng)孵育時(shí)間；背景過高時(shí)， 可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時(shí)間。 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 v接種5104/ml細(xì)胞于96孔板，每孔200ul培養(yǎng)液 ；分為五組，每組三個(gè)平行孔 v單層貼壁細(xì)胞棄原培養(yǎng)液加胰蛋白酶液 （覆蓋住瓶底）輕晃后迅速棄去胰蛋白酶液 加胰蛋白酶液（覆蓋住瓶底） (40s) 棄 胰蛋白酶液 靜置 3 min (可在顯微鏡下觀察 ) 定量加入培養(yǎng)液 2 ml 吹打細(xì)胞成單 細(xì)胞懸液 取一滴至血球計(jì)數(shù)板 計(jì)數(shù)細(xì) 胞計(jì)算后接種細(xì)胞于96孔板 v虛擬實(shí)驗(yàn)