銅綠假單胞菌的分類鑒定

1、1 銅綠假單胞菌的分離及鑒定銅綠假單胞菌的分離及鑒定 組員：張沖組員：張沖 郭澤郭澤 王平王平 2 銅綠假單胞菌 3 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?n了解銅綠假單胞菌的微生物學(xué)特性了解銅綠假單胞菌的微生物學(xué)特性 n掌握微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)基本原理及操作掌握微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)基本原理及操作 n熟悉銅綠假單胞菌的分離鑒定程序及熟悉銅綠假單胞菌的分離鑒定程序及 方法方法 4 概述 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌慣稱綠膿桿菌，為革蘭慣稱綠膿桿菌，為革蘭 氏陰性桿菌，屬假單胞菌屬。它在自然界氏陰性桿菌，屬假單胞菌屬。它在自然界 分布甚廣，空氣、水、土壤中均有存在，分布甚廣，空氣、水、土壤中均有存在， 在潮濕處可長期生存，對(duì)外環(huán)境的抵抗力在

2、潮濕處可長期生存，對(duì)外環(huán)境的抵抗力 比其他菌強(qiáng)，抗干燥的能力也強(qiáng)。比其他菌強(qiáng)，抗干燥的能力也強(qiáng)。 5 生物學(xué)特性 n 形態(tài)：形態(tài)：革蘭氏陰性桿革蘭氏陰性桿菌菌， 菌體菌體長短不一長短不一 ；單端單鞭單端單鞭 毛毛；動(dòng)力動(dòng)力陽性；陽性；無芽胞。無芽胞。 n特性：專性需氧特性：專性需氧；生長生長 溫度范圍是溫度范圍是2542， 最適生長溫度最適生長溫度35，4不不 生長。生長。 6 生物學(xué)特性 n抗原抗原性性: :O O抗原抗原 H H抗原抗原 粘液抗原粘液抗原 R R抗原抗原 菌毛抗原菌毛抗原 n產(chǎn)生熒光素和水溶性的綠膿素，培養(yǎng)物呈藍(lán)產(chǎn)生熒光素和水溶性的綠膿素，培養(yǎng)物呈藍(lán) 綠色。綠色。 7 生物

3、學(xué)特性 n在血平板上形成大而扁平、濕潤、有金屬在血平板上形成大而扁平、濕潤、有金屬 光澤、藍(lán)綠色、透明溶血環(huán)菌落，有生姜光澤、藍(lán)綠色、透明溶血環(huán)菌落，有生姜 味；味； n在在普通平板、普通平板、血平板、麥康凱平板上可形血平板、麥康凱平板上可形 成成5 5種不同形態(tài)的菌落種不同形態(tài)的菌落 典型型典型型 粘液型粘液型 侏儒型侏儒型 粗糙型粗糙型 大腸菌樣型大腸菌樣型 8 生物學(xué)特性 n菌落呈灰綠色菌落呈灰綠色，大小大小 不一不一, ,扁平濕潤扁平濕潤，邊緣邊緣 不規(guī)則呈傘狀伸展不規(guī)則呈傘狀伸展， 表面?？梢娊饘俟鉂杀砻娉？梢娊饘俟鉂?。 典型型（麥康凱平板）典型型（麥康凱平板） 9 生物學(xué)特性 n產(chǎn)

4、綠膿素產(chǎn)綠膿素 瓊脂染成黃綠色瓊脂染成黃綠色 典型型（普通平板）典型型（普通平板） 10 生物學(xué)特性 n菌落光滑凸起菌落光滑凸起 成粘液狀成粘液狀 粘液型（血平板）粘液型（血平板） 粘液型（麥康凱平板）粘液型（麥康凱平板） 11 生物學(xué)特性 n菌落中央凸起菌落中央凸起 邊緣扁平邊緣扁平 表面粗糙表面粗糙 粗糙型粗糙型（麥康凱平板）（麥康凱平板） 12 生物學(xué)特性 n菌落圓形凸起菌落圓形凸起 似大腸埃希菌菌落似大腸埃希菌菌落 大腸型（麥康凱平板）大腸型（麥康凱平板） n細(xì)小，無光澤細(xì)小，無光澤 半透明菌落半透明菌落侏儒型（麥康凱平板）侏儒型（麥康凱平板） 13 生化特性 n 氧化酶：氧化酶：+

5、+ n 葡萄糖的氧化（葡萄糖的氧化（O/FO/F）：）：O O n 枸櫞酸鹽利用：枸櫞酸鹽利用：+ + n 精氨酸雙水解：精氨酸雙水解：+ + n 明膠液化：明膠液化：+ + n 硝酸鹽還原：硝酸鹽還原：+ + n 乙酰胺酶：乙酰胺酶：+ + n 吲哚試驗(yàn)：吲哚試驗(yàn)：- - 14 微生物學(xué)檢驗(yàn) 15 膿液膿液 痰痰 尿液等尿液等 直接涂片、革蘭染色、鏡檢直接涂片、革蘭染色、鏡檢分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) （血平板、麥康凱）（血平板、麥康凱） 18-24h35 可疑菌落（金屬光澤、可疑菌落（金屬光澤、-溶血、產(chǎn)綠色素、特殊氣味）溶血、產(chǎn)綠色素、特殊氣味） 初步鑒定初步鑒定最終鑒定最終鑒定 色素色素 鑒定鑒

6、定 生化生化 反應(yīng)反應(yīng) 42 生長生長 分型分型 （血清學(xué)（血清學(xué) 噬菌體）噬菌體） 革蘭陰性革蘭陰性 桿菌，氧桿菌，氧 化酶陽性化酶陽性 菌落特征菌落特征 氣味氣味 綠膿素綠膿素 報(bào)告報(bào)告 檢驗(yàn)程序 藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn) 16 試驗(yàn)材料 n病料病料：痰液標(biāo)本：痰液標(biāo)本 n試劑試劑：氧化酶紙片：氧化酶紙片，明膠，明膠、革蘭染色液、革蘭染色液、藥敏藥敏 紙片、紙片、無菌生理鹽水及生化管配套試劑無菌生理鹽水及生化管配套試劑等等 n培養(yǎng)基培養(yǎng)基：普通平板、普通平板、血平板、血平板、麥康凱麥康凱平板、半平板、半 固體培養(yǎng)基、非發(fā)酵菌微量生化管等固體培養(yǎng)基、非發(fā)酵菌微量生化管等 n其它其它 ：顯微鏡、培養(yǎng)箱

7、、小試管、載玻片、：顯微鏡、培養(yǎng)箱、小試管、載玻片、 接種針、接種環(huán)、酒精燈、火柴、接種針、接種環(huán)、酒精燈、火柴、平皿平皿等等 17 分離培養(yǎng) n標(biāo)本采集標(biāo)本采集：膿液、濃痰（無菌拭子）：膿液、濃痰（無菌拭子） n痰液標(biāo)本的前處理痰液標(biāo)本的前處理 加入等量的加入等量的PH 7.6 的的1% 胰酶溶液，放置胰酶溶液，放置35、 90 min使痰液均質(zhì)化使痰液均質(zhì)化。 n直接涂片，直接涂片，革蘭氏革蘭氏染色染色，鏡檢鏡檢 n分別分別接種接種普通普通平板平板、血平板血平板和麥康凱和麥康凱平板平板，培培 養(yǎng)養(yǎng)1824h ，進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。 18 初步鑒定 n選出可疑菌落選出可疑菌落 金

8、屬光澤、金屬光澤、-溶血、產(chǎn)綠色素、特殊氣味溶血、產(chǎn)綠色素、特殊氣味等等 n初步鑒定初步鑒定 染色鏡檢染色鏡檢：取可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。：取可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。 氧化酶試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)：挑取可疑菌落于濾紙片上，滴加一：挑取可疑菌落于濾紙片上，滴加一 滴新配制的滴新配制的5%二甲基對(duì)苯二胺試劑，二甲基對(duì)苯二胺試劑，15-30min內(nèi)，內(nèi)， 出現(xiàn)出現(xiàn)紅色至紫紅色紅色至紫紅色，為，為陽性陽性；若不變色，為陰性。；若不變色，為陰性。 19 綠膿菌素試驗(yàn)綠膿菌素試驗(yàn)：選取可疑菌落：選取可疑菌落2-32-3個(gè)，置于綠膿菌個(gè)，置于綠膿菌 素測定用培養(yǎng)基，于素測定用培養(yǎng)基，于3737培養(yǎng)培

9、養(yǎng)24h24h，加入氯仿、色素，加入氯仿、色素 后，再加入鹽酸后，再加入鹽酸 ，上層稀鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)，上層稀鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性紅色為陽性， 表示菌落中含有綠膿菌素。表示菌落中含有綠膿菌素。 初步鑒定 20 最終鑒定 n明膠液化試驗(yàn)：明膠液化試驗(yàn)：選取可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺選取可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺 接種于明膠培養(yǎng)基內(nèi)，接種于明膠培養(yǎng)基內(nèi)，3737培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h，取出后放入，取出后放入 冰箱冰箱10-30min10-30min，如若溶解，如若溶解，即試驗(yàn)呈即試驗(yàn)呈陽性陽性；如凝固；如凝固 不溶，試驗(yàn)呈陰性。不溶，試驗(yàn)呈陰性。 n硝酸鹽還原試驗(yàn)硝酸鹽還原試驗(yàn)：選取可疑菌落的純培養(yǎng)物，接

10、：選取可疑菌落的純培養(yǎng)物，接 種于硝酸鹽培養(yǎng)基，置于種于硝酸鹽培養(yǎng)基，置于3737培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h，如若培養(yǎng)，如若培養(yǎng) 基中的小倒管內(nèi)基中的小倒管內(nèi)有氣體，有氣體，試驗(yàn)呈試驗(yàn)呈陽性陽性。 21 最終鑒定 n吲哚試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)：選取可疑菌落的純培養(yǎng)物：選取可疑菌落的純培養(yǎng)物接種于蛋白胨接種于蛋白胨 水水，培養(yǎng)培養(yǎng)8h-24h8h-24h后，加后，加KovacsKovacs（靛基質(zhì)靛基質(zhì)）試劑約試劑約3 3mmmm 高高，如若，如若在液層界面發(fā)生在液層界面發(fā)生紅色紅色，即為，即為陽性陽性反應(yīng)反應(yīng)。 n4242生長試驗(yàn)生長試驗(yàn)：選取純被檢物，接種于普通瓊脂斜：選取純被檢物，接種于普通瓊脂斜 面培養(yǎng)

11、基上，于面培養(yǎng)基上，于4242培養(yǎng)培養(yǎng)4h4h，銅綠假單胞菌能，銅綠假單胞菌能生長為生長為 陽性陽性反應(yīng)。反應(yīng)。 22 血清學(xué)鑒定 n血清群鑒定：血清群鑒定：取潔凈玻片，滴加多價(jià)取潔凈玻片，滴加多價(jià)O血清于玻片，血清于玻片， 再接種此菌的純培養(yǎng)物少許混勻，再接種此菌的純培養(yǎng)物少許混勻，2min觀察凝集現(xiàn)象，觀察凝集現(xiàn)象， 鑒定。鑒定。 n血清學(xué)分型：血清學(xué)分型：按血清分型試劑盒操作說明進(jìn)行操作：按血清分型試劑盒操作說明進(jìn)行操作： 將待檢測菌在將待檢測菌在LB瓊脂培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取少許與瓊脂培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取少許與 30L陽性血清混合，一分鐘觀察結(jié)果。陽性血清混合，一分鐘觀察結(jié)果。 n判定標(biāo)準(zhǔn)：判定標(biāo)準(zhǔn)：有凝集塊出現(xiàn)，且生理鹽水空白對(duì)照組有凝集塊出現(xiàn)，且生理鹽水空白對(duì)照組 不凝集者為陽性。不凝集者為陽性。 23 藥敏試驗(yàn) n擴(kuò)散法（擴(kuò)散法（K-BK-B法