[畢業(yè)設(shè)計(jì)精品]稻曲病菌對(duì)戊唑醇的室內(nèi)抗性篩選

1、本科畢業(yè)論文 題 目稻曲病菌對(duì)戊唑醇的室內(nèi)抗性篩選in vitro adaptation to tebuconazole in ustilaginoidea virence strains姓 名學(xué) 號(hào)專(zhuān) 業(yè)動(dòng)植物檢疫指導(dǎo)教師職 稱(chēng)教授 中國(guó)二一年六月分類(lèi)號(hào) 密級(jí)本科畢業(yè)論文 稻曲病菌對(duì)戊唑醇的室內(nèi)抗性篩選in vitro adaptation to tebuconazole in ustilaginoidea virence strains學(xué)生姓名：學(xué)生學(xué)號(hào)：學(xué)生專(zhuān)業(yè)：動(dòng)植物檢疫指導(dǎo)教師： 教 授植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院二一年六月目錄摘要.iiabstract.iii關(guān)鍵字.iii1 前言.11.1

2、稻曲病菌.11.2 戊唑醇.31.3 病原菌室內(nèi)抗性篩選.52 材料與方法.5 2.1 試驗(yàn)材料.52.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容.52.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析.52.4 討論.8參考文獻(xiàn).9致謝.9附錄.10摘 要稻曲病的發(fā)病面積逐年增加，為害日益加重，已成為水稻主要三大病害之一。 戊唑醇通過(guò)抑制真菌中麥角甾醇的生物合成對(duì)稻曲病有很好的防治效果。本文主要是用戊唑醇對(duì)稻曲病菌的兩種生理小種進(jìn)行了室內(nèi)抑菌活性測(cè)定。將兩種生理小種在不斷提高濃度梯度的戊唑醇pda培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，直到其抗性無(wú)法得到增強(qiáng)。然后在pda培養(yǎng)皿中繼續(xù)轉(zhuǎn)接5代，測(cè)量原始菌株、轉(zhuǎn)接16代的對(duì)照菌株、馴化菌株以及再度轉(zhuǎn)接5代的菌株的ec50，看其抗性

3、是否得到保持。關(guān)鍵詞戊唑醇；水稻稻曲??；抗性abstractas the area of rice incidenced by ustilaginoidea oryzae (patou.) bref increased year by year，and the damage is increasing，it has become one of the three major diseases of rice.tebuconazole effects on inhibiting biosynthesis of ergosterol that has great control effect on

4、 ustilaginoidea oryzae (patou.) bref. we mainly have indoor antifungal activities on two races of ustilaginoidea oryzae (patou.) bref with tebuconazole.two races were rasied concentration gradient in pda plate with tebuconazole in rasing concentration gradient，until their resistance can not be enhan

5、ced.then continue to divert for 5 generations in pda plate，measure the ec50 of original strain、control strain and domesticated strains treated after16 generations、the strain re-switched for 5 generations to see whether the resistance have been maintainedkey wordstebuconazole；ustilaginoidea oryzae (p

6、atou.) bref ；resistance1 前言殺菌劑對(duì)植物病原菌的抑菌活性測(cè)定是研究殺菌劑的基礎(chǔ)。通過(guò)室內(nèi)活性測(cè)定可以明確殺菌劑的作用效果及抑菌譜。戊唑醇由于殺菌活性高等特點(diǎn),目前已經(jīng)在市場(chǎng)上大量使用。但是抗藥性問(wèn)題的出現(xiàn)影響著殺菌劑的發(fā)展。室內(nèi)對(duì)病原真菌進(jìn)行抗性篩選,可以模擬出田間病原菌對(duì)殺菌劑的抗藥性發(fā)展動(dòng)態(tài),對(duì)殺菌劑進(jìn)行抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,為田間科學(xué)合理的用藥提供理論指導(dǎo)。1.1 稻曲病菌稻曲病又稱(chēng)偽黑穗病、綠黑穗病、谷花病、青粉病,是一種由病原真菌引起的后期谷粒病害,通常在晚稻上發(fā)生,多發(fā)生在水稻收成好的年份,使農(nóng)民誤以為是豐收的象征,俗稱(chēng)“豐產(chǎn)果”,在全國(guó)各稻區(qū)均有發(fā)生。20世紀(jì)

7、80年代之前,該病零星發(fā)生,屬次要病害;90年代以來(lái),由于密粒直立型超級(jí)稻和優(yōu)質(zhì)水稻品種的大面積推廣,單季稻熟制的擴(kuò)大,施肥水平偏高和不合理,尤其是單季稻孕穗期多雨適溫的頻率較高,稻曲病的發(fā)病面積逐年增加,為害日益加重,已成為水稻主要三大病害之一。稻曲病的發(fā)生,會(huì)造成水稻大面積空秠率增高,既不利于晚稻高產(chǎn),又嚴(yán)重影響稻米的質(zhì)量,且稻曲病病菌還會(huì)產(chǎn)生毒素,對(duì)人畜有不良影響。該病只發(fā)生于穗部,為害部分谷粒。受害谷粒發(fā)病初期外觀與健康谷粒誤明顯區(qū)別,在水稻齊穗35d內(nèi)可顯癥,病菌早期侵害子房,花柱及柱頭,后期侵入幼嫩穎里的外表皮,蔓延到配孔中,然后大量繁殖并形成子座。發(fā)病時(shí),病菌首先在谷粒內(nèi)部生成小

8、菌核,形成菌絲塊并逐漸膨大,內(nèi)外穎裂開(kāi),露出淡黃色塊狀物,即孢子座,后包于內(nèi)外穎兩側(cè),比健康谷粒大34倍,形成近球形病粒,呈黑綠色,初外包一層薄膜表面光滑,后顯粗糙龜裂,散發(fā)生墨綠色粉末,即病菌的厚垣孢子,使水稻結(jié)實(shí)率和干粒重下降,俗稱(chēng)“灰包”。一般每穂有病粒15粒,嚴(yán)重的可達(dá)2030粒。有的兩側(cè)生黑色扁平菌核,風(fēng)吹雨打易脫落。（吳格娥,2000；楊洵,2007；章方海,2006）病原ustilaginoideavirens(cooke)tak.稱(chēng)稻綠核菌,屬半知菌亞門(mén)真菌。分生孢子座6-124-6(m),表面墨綠色,內(nèi)層橙黃色,中心白色。分生孢子梗直徑2-2.5(m)。分生孢子單胞厚壁,表面

9、有瘤突,近球形,大小4-5(m)。菌核從分生孢子座生出,長(zhǎng)橢圓形,長(zhǎng)2-20mm,在土表萌發(fā)產(chǎn)生子座,橙黃色,頭部近球形,大小1-3mm,有長(zhǎng)柄,頭部外圍生子囊殼,子囊殼瓶形,子囊無(wú)色,圓筒形,大小180-22m,子囊孢子無(wú)色,單胞,線(xiàn)形,大小120-1800.5-1(m)。厚垣孢子墨綠色,球形,表面有瘤狀突起,大小3-54-6(m)。有性態(tài)為clavicepsvirenssakurai稱(chēng)稻麥角,屬子囊菌亞門(mén)真菌。（王云川,2006）1.2.1傳播途徑和發(fā)病條件(1) 大量病原菌存在病菌主要以菌核在土壤中越冬,也可以厚垣孢子在被害谷物內(nèi)或健康谷粒潁殼上越冬。翌年78月份,當(dāng)菌核和厚坦孢子遇到適

10、宜條件時(shí),即可萌發(fā)產(chǎn)生子囊孢子和分生孢子,隨氣流和水流傳播,落到水稻植株上,在水稻破口時(shí)傾入花器和幼穎,由厚垣孢子再生小孢子及子囊孢子進(jìn)行初侵染。連作地塊時(shí)間長(zhǎng),有效菌原積累多,發(fā)病率高。(2) 品種抗性差雜交稻重于常規(guī)稻,粳稻重于糯稻,大穗型,破口抽穗期長(zhǎng)的品種發(fā)病重。(3) 氣候原因氣溫24-32病菌發(fā)育良好,26-28最適,低于12或高于36不能生長(zhǎng)。抽穗揚(yáng)花期遇雨及高溫,特別是在陰雨天發(fā)病重。(4) 栽培原因 抽穗早的品種發(fā)病較輕。(5) 施肥隨施氮量的增加,稻曲病發(fā)病程度加重,尤其是后期重施穗肥有利于發(fā)病。另施肥不當(dāng)或施肥太遲,容易造成貪青,劍葉偏長(zhǎng),形成穗部小氣候相對(duì)濕度較高,受陽(yáng)

11、光直射較少,一直延遲抽穗。鉀肥有壯桿作用,可使葉直,葉厚,穗部受光良好,減少病害滋生條件。(6) 長(zhǎng)期深水漫灌,不曬田。(7) 破口前后為及時(shí)用藥預(yù)防。(8) 重視不夠,防治信息不能及時(shí)傳達(dá)。（張業(yè)金,2006,王琴,2005）1.2.2防治方法(1) 合理安排種植期,避開(kāi)發(fā)病高峰時(shí)節(jié)。適時(shí)早播早植,加強(qiáng)管理,錯(cuò)開(kāi)穗期雨季以減輕病害。健生栽培,提高逆抗水平。(2) 選用抗（耐）病品種。(3) 避免病田留種,深耕翻埋菌核。發(fā)病時(shí)摘除并銷(xiāo)毀病粒。(4) 科學(xué)管水。(5) 改進(jìn)施肥技術(shù)基肥要足,追肥要早,慎用穗肥,增強(qiáng)稻株抗病能力。(6) 合理密植每公頃栽225000穴左右為宜。過(guò)于密植,易導(dǎo)致田間

12、蔭蔽,濕度大,利于發(fā)病。(7) 確定重點(diǎn)防治對(duì)象田感病品種種植區(qū),山區(qū)及偏施,遲施氮肥的田塊,均應(yīng)列入重點(diǎn)防治對(duì)象田。(8) 抓住防治適期施藥抓住水稻分蘗末期,破口前3d-7d,始穗期三個(gè)關(guān)鍵時(shí)期施藥（可有效兼治紋枯病等病害）。(9) 藥劑防治。(10) 清除病源,減少初次侵染來(lái)源。(11) 加強(qiáng)測(cè)報(bào),及時(shí)用藥防治。（段宗云,2007）1.2 戊唑醇戊唑醇是一種羥乙基三唑衍生物,屬三唑類(lèi)內(nèi)吸殺菌劑。毒性分類(lèi)屬低毒殺菌劑。該化合物由德國(guó)拜耳公司于1986年最先開(kāi)發(fā)成功,英文通用名,化學(xué)名稱(chēng)為1-（4-氯苯基）-4,4-二甲基-3（1h-1,2,4-三唑-1-基甲基）戊-3-醇與其它所有三唑類(lèi)殺菌

13、劑一樣,戊唑醇抑制真菌中麥角甾醇的生物合成,可用作種子處理劑和葉面噴霧劑,不僅活性高,而且持效期長(zhǎng),對(duì)防治許多作物包括單子葉植物和雙子葉植物病害安全有效。甾醇類(lèi)化合物是生物維持生命及生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的物質(zhì)。在真菌和細(xì)菌中,主要是合成麥角甾醇,它是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分,對(duì)細(xì)胞膜的滲透性起重要作用。麥角甾醇的生物合成已成為新型殺菌劑的重要靶標(biāo)之一,其抑制劑由于活性高、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn),在生產(chǎn)上受到普遍重視。1.2.1作用特點(diǎn)從作用方式看,戊唑醇對(duì)稻曲病病菌表現(xiàn)為抑菌作用,對(duì)植物則表現(xiàn)為治療作用。從作用機(jī)理看,主要是對(duì)病原真菌的麥角甾醇生物合成起抑制作用。一般認(rèn)為三唑類(lèi)麥角甾醇抑制劑的主要機(jī)理是

14、抑制麥角甾醇中間體的氧化脫甲基反應(yīng),特別是對(duì)2,4-亞甲基-二氫羊毛甾醇結(jié)構(gòu)中14位碳原子上脫甲基反應(yīng)的抑制。生化機(jī)制研究表明,與傳統(tǒng)的三唑類(lèi)殺菌劑相比,戊唑醇還存在其它作用位點(diǎn),但同樣存在于麥角甾醇生物合成過(guò)程中。除了三唑類(lèi)殺菌劑的典型特征,即由于抑制脫甲基反應(yīng)引起的麥角甾醇中間產(chǎn)物積累以外,在用戊唑醇處理后,在菌絲中出現(xiàn)了三種5甾醇(符號(hào)表示雙鍵位于第5位碳原子,下同),即5-麥角甾醇、5-豆固醇和5,22-豆固二烯醇。這可能有兩種原因,即戊唑醇干擾反應(yīng)進(jìn)行順序最后導(dǎo)致87異構(gòu)化不能正常進(jìn)行或直接對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生影響,而間接地對(duì)甾醇混合物的組成產(chǎn)生了影響。與傳統(tǒng)三唑類(lèi)殺菌劑相比,戊唑醇的活性譜

15、擴(kuò)大的機(jī)理正在于此。（李富根,2001）1.2.2生物活性植物病害防治中的應(yīng)用戊唑醇具有優(yōu)良的生物活性,用量低,內(nèi)吸性較強(qiáng),適用范圍廣,對(duì)白粉菌屬、柄銹菌屬、喙孢屬、核腔菌屬和殼針孢屬菌引起的病害均能有效地防治。戊唑醇可作種子處理或葉面噴霧用。作種子處理用時(shí),加工成拌種劑(ws、ds),由于其內(nèi)吸作用,所以能有效防治吸附在種子表面以及內(nèi)部的病原菌,被廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、高粱等旱地作物,防治某些種傳和土傳病害,特別是用于防治黑穗病。作噴霧用時(shí),可加工成乳油、可濕性粉劑、懸浮劑、水乳劑等。戊唑醇被植物吸收后,在植物組織中向頂轉(zhuǎn)移,能防治各種作物中的多種稻曲病病菌,目前主要應(yīng)用在控制禾谷類(lèi)及花生病

16、害、香蕉葉斑病、油菜白粉病和茶餅病等病害。1.2.3合成機(jī)理（譚成俠,2001）1.3 病原菌室內(nèi)抗性篩選室內(nèi)抗性篩選的方法大多有兩種：一種是紫外線(xiàn)誘變；另外一種是藥劑誘導(dǎo)篩選。通過(guò)誘變處理或藥劑選擇探測(cè)抗藥菌株產(chǎn)生的可能性,再通過(guò)抗藥菌株的致病力、遺傳穩(wěn)定性及競(jìng)爭(zhēng)性,可以推測(cè)優(yōu)勢(shì)菌株導(dǎo)致抗藥性發(fā)生的可能性。為這種殺菌劑的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估,從而延緩抗性的發(fā)生、科學(xué)合理的用藥提供理論指導(dǎo)（趙建江,2008）2 材料和方法2.1試驗(yàn)材料2.1.1供試藥劑及其配制戊唑醇,用無(wú)菌水稀釋成8000g/ml母液,置于4攝氏度冰箱內(nèi)保存,備用。2.1.2供試菌株稻曲病ustilaginoideaviren

17、s由植物病理教研室博士研究生呂博提供。2.2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在預(yù)培養(yǎng)的真菌菌落邊緣,打取直徑7mm的菌碟于含系列濃度的pda培養(yǎng)皿上,27攝氏度培養(yǎng)14天,測(cè)量菌落直徑。轉(zhuǎn)接16代后,將ck和馴化的菌株在pda培養(yǎng)皿中繼續(xù)轉(zhuǎn)接五代,測(cè)量馴化菌株,ck以及親本的ec50,做對(duì)比。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析表1u-12轉(zhuǎn)接16代菌落直徑平均數(shù)據(jù)記錄（濃度單位：g/ml：菌落直徑單位：cm）濃度轉(zhuǎn)接代數(shù)ck0.030.060.100.301.00122.723.1233.432.482.3144.572.802.2554.632.532.2264.632.532.2275.153.272.2885.171.750

18、.7194.371.110.76103.971.480.96114.772.391.78124.372.151.22134.101.971.40144.401.521.480.5154.430.971.230.5164.431.931.230.5圖表 1 data of u-12 after switching for 16 generations u-12轉(zhuǎn)接16代數(shù)據(jù)表2u-32轉(zhuǎn)接16代菌落直徑平均數(shù)據(jù)記錄（濃度單位：g/ml,菌落直徑單位：cm）濃度轉(zhuǎn)接代數(shù)ck0.030.060.100.301.00124.083.8034.962.873.6444.313.633.0854.172.

19、782.2064.172.782.2075.303.231.3784.962.610.8694.902.332.00104.022.792.32115.062.771.92124.952.751.76134.952.832.23144.732.131.240.5154.582.341.010.5164.282.221.590.5圖表 2 data of u-32 after switching for 16 generationsu-32轉(zhuǎn)接16代數(shù)據(jù)根據(jù)圖表中數(shù)據(jù)可以看出,菌株在在不斷提高濃度的pda培養(yǎng)基中能生長(zhǎng),且菌落直徑在不斷增大,表明抗性在不斷上升。表3不同濃度戊唑醇下u-12菌株的

20、ec50值（濃度單位：g/ml,表格中數(shù)據(jù)單位：%）菌株種類(lèi)濃度u-12d12-0d12-1d12-2ck0.0187.7197.6444.4133.980.0395.9098.0356.2543.200.197.27100.0052.3054.850.3100.00100.0057.2466.021100.00100.0084.2188.833100.00100.00100.00100.0010100.00100.00100.00100.00ec500.110.06注：u-12表示親本,d12-0表示培養(yǎng)16代的ck組,d12-1表示培養(yǎng)16代的馴化菌株,d12-2為馴化菌株繼續(xù)轉(zhuǎn)接5代的菌

21、株。圖表 3 ec50 of u-12 virens strainsu-32菌株ec50圖表數(shù)據(jù)表明u-12在16代的轉(zhuǎn)接之后其對(duì)戊唑醇的抗性得到了提高,并且d12-1菌株在保存了一個(gè)月之后再轉(zhuǎn)接5代,其抗性只得到了部分保持。2.4討論這個(gè)課題的提出是基于這樣一個(gè)假設(shè),稻曲病病菌在不斷提高的藥劑濃度下其抗性能不斷得到增長(zhǎng),即突變體數(shù)目的增加。但是其抗性不可能無(wú)限增加,對(duì)藥劑濃度有個(gè)最高的適應(yīng)濃度,高于這個(gè)濃度下無(wú)論如何都不可能生長(zhǎng)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)大概做了一年時(shí)間,由于稻曲病病菌的菌絲生長(zhǎng)速率較慢,所以?xún)蓚€(gè)星期轉(zhuǎn)接。開(kāi)始的時(shí)候我們選擇了用一系列的濃度梯度來(lái)培養(yǎng)稻曲病病菌（0.01ppm,0.03ppm

22、,0.1ppm,0.3ppm,1ppm,3ppm,10ppm）,根據(jù)培養(yǎng)出來(lái)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比選擇了一個(gè)初始濃度,0.03ppm。在0.03ppm的戊唑醇pda培養(yǎng)基中病菌生長(zhǎng)能得到一定的抑制。后來(lái)我們不斷的轉(zhuǎn)接,病菌在含藥的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩個(gè)星期后,如果直徑能生長(zhǎng)到一定大小就可以選用更高濃度的含藥培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)轉(zhuǎn)接。順著這個(gè)過(guò)程我們將菌株培養(yǎng)了16代,直到其達(dá)到了最高適應(yīng)濃度,0.3ppm。然后我們將轉(zhuǎn)接16代的ck和能適應(yīng)0.3ppm戊唑醇濃度的病菌在pda培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接5代。最后我們將親本,16代的馴化菌株,16代的ck及馴化菌株繼續(xù)轉(zhuǎn)接5代的菌株在一些列濃度的戊唑醇pda培養(yǎng)基中培養(yǎng),得到ec

23、50值,看轉(zhuǎn)接16代的馴化菌株抗性能否得到提高,并且其突變并不能穩(wěn)定保持。在相同濃度下,稻曲病病菌的抗性直接表現(xiàn)為菌落直徑的大小,即菌落直徑越大,其對(duì)相同濃度戊唑醇的抗性越高。同時(shí),能在高濃度上生長(zhǎng)也體現(xiàn)其抗性的增長(zhǎng)。數(shù)據(jù)表明,u-12與u-32對(duì)戊唑醇的適應(yīng)濃度極限為0.3ppm,在1ppm濃度戊唑醇的pda培養(yǎng)基上就無(wú)法生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)接16代的馴化菌株,其抗性得到了很大的提高,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的預(yù)期假設(shè)是正確的,但是病菌對(duì)戊唑醇的抗性并不能得到很好的保持。根據(jù)圖表數(shù)據(jù)能看出,相同濃度下菌株的菌落直徑并不是直線(xiàn)上升,ec50的圖表中,d12-1的數(shù)據(jù)也不是直線(xiàn)上升,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在一定誤差。參考文獻(xiàn)1.

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