分子生物學第一次討論人類基因組DNA提取、限制性核酸內切酶切割的原理方法瓊脂糖凝膠電泳結果及其應用

1、第三組 口腔1401班 第一次討論課第一次討論課 人類基因組人類基因組DNADNA提取、限制性核酸內提取、限制性核酸內 切酶切割的原理、方法、瓊脂糖凝膠切酶切割的原理、方法、瓊脂糖凝膠 電泳結果分析及其應用。電泳結果分析及其應用。 人類基因組DNA提取可以從外周血，肝或脾組織取材， 也可以無創(chuàng)傷的采集材料，如用口腔上皮脫落細胞，發(fā)根細 胞。提取方法有經(jīng)典酚醇法、鹽析法、煮沸法。 以下以酚醇法提取外周血白細胞DNA為例 原理原理 l原則 保證DNA一級結構的完整。減少細胞內DNase對DNA的降解 。 排除蛋白質，其他核酸及有機溶劑分子的污染。 原理原理 lDNA和蛋白質的性質 DNA整體表現(xiàn)為

2、酸性，帶負電。是極性化合物，微溶于水 ，不溶于乙醇，苯酚，氯仿，乙醚等有機溶劑，形成沉 淀。從而被分離提取出來。 蛋白質分子表面帶有親水基團，也容易進行水合作用， 并在表面形成一層水化層，使蛋白質分子能順利地進入 到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當有機溶液存在時， 蛋白質的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀，從而被 除去。 l相關試劑及作用 細胞裂解液 :82.9g NH4CL， 10gKHCO3，0.37gEDTANA2, 滅菌雙蒸水定容至1000mL EDTANA2是一種血液抗凝劑 低滲溶液使細胞膜漲破，白細胞釋放細胞核，紅細胞釋放血 紅蛋白 細胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaC

3、l，10mmol/L Tris- HCl，1mmol/L EDTA 使核膜破裂，釋放染色質 EDTA是一種血液抗凝劑，同時抑制核酸酶活性，防止DNA 被水解。 RNase是RNA酶，能水解去除DNA中的 RNA SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種去污劑 ，能導致蛋白質變性，成為易溶于水的 復合物。從而破壞蛋白質與DNA的結合， 使DNA釋放出來。 蛋白酶K是一種很強的蛋白水解酶，在 SDS中穩(wěn)定。水解各種蛋白質（包括糖蛋 白和肽類，和脂類，胺類物質）。同時 由于RNA酶和DNA酶是蛋白質，也可被水 解，從而防止DNA被水解。 酚是蛋白質的變性劑，并將變性的蛋白質溶解其中。而 DNA則溶解于水相。

4、氯仿也是蛋白質的變性劑，促進兩相分離，并除去DNA溶 液中的酚。 無水乙醇：DNA不溶于其中， 沉淀DNA 70%乙醇：溶解其他有機溶劑， 而DNA幾乎不溶于其中， 洗滌DNA沉淀。洗滌完后， 乙醇易揮發(fā)。 l注意事項 操作時要戴手套，因為苯酚是腐蝕劑，另外防止手上的核 酸酶或細菌污染DNA樣品。 方法方法 加入細胞裂解液和細胞 核裂解液，裂解細胞和 細胞核，釋放染色質 加入RNase，SDS,蛋 白酶K等，水解RNA 和蛋白質 酚：氯仿（1:1） 分離DNA 70%乙醇，漂洗 DNA 無水乙醇沉 淀 TE緩沖液溶解 DNA。,-20保 存。 取材。 EDTANA2抗凝 處理的新鮮全血 限制性

5、核酸內切酶限制性核酸內切酶 l定義 限制性核酸內切酶是可 以識別特定的核苷酸序列， 并在每條鏈中特定部位的兩 個核苷酸之間的磷酸二酯鍵 進行切割的一類酶，簡稱限 制酶。 磷酸二酯鍵 l分類 根據(jù)酶的功能特性、大小及反應時所需的輔助因子 I類酶在DNA分子上沒有特異性的酶解片斷 類酶在DNA分子上有特異性的酶解片斷 原理原理 l識別特定的核苷酸序列 （識別序列多為回文序 列） l在每條鏈中特定部位的 兩個核苷酸之間的磷酸 二酯鍵進行切割 切割方法切割方法 l生成平末端 有一些酶沿識別序列對稱軸切斷DNA，產(chǎn)生的末端稱為 平端或鈍端。 例如:SmaI l生成粘性末端 切點是交錯的,生成兩條單鏈末端

6、的堿基是互補的，切 后末端可以粘接起來,稱為粘性末端。黏性末端的片段可自 行復性,易于通過DNA連接酶把斷裂點接上而復原。不同來源 的DNA用同一限制性內切酶切后生成的片段由于具有粘性末 端可通過氫鍵互補地粘接,再用DNA連接酶連成重組的DNA分 子,因此該酶的發(fā)現(xiàn)和應用使基因工程成為可能。 如EcoR I 5-G GAATTCAATTC-3 5-G G AATTC AATTC-3 3-CTTAACTTAAG G-5 3-CTTAACTTAA G G-5 氫氧化鐵膠體在直流電作用下移向陰極， 這是大家熟悉的電泳實驗現(xiàn)象。后來發(fā) 展起來可以減少外界干擾的區(qū)帶電泳技 術，這是一種用固體作支持介質的

7、電泳 技術，待分離物質通過在支持介質中移 動而得以分離成若干區(qū)帶。如果用瓊脂 糖凝膠作支持介質，這種區(qū)帶電泳技術 則稱為瓊脂糖凝膠電泳。 在電場作用下，DNA和RNA之類生物大分 子可在瓊脂糖凝膠中運動。由于分子泳 動速率與分子大小和分子構型有關，因 而可將不同大小的分子，或分子大小相 同但構型不同的分子分離開來。瓊脂糖 凝膠電泳技術在當代已經(jīng)成為一種極其 重要的分析手段，廣泛應用于生物化學、 分子生物學、醫(yī)學、藥學、食品、農業(yè)、 衛(wèi)生及環(huán)保等許多領域。 什么是瓊脂糖凝膠什么是瓊脂糖凝膠 瓊脂糖凝膠電泳技術使用瓊脂糖凝膠作為固體介質。從海 藻提取出的瓊脂中可以分離出一種膠狀多糖，稱為瓊脂糖。

8、瓊脂糖通常為自色粉末，有時稍帶色。它的主要成分為交 替連接的D-吡喃半乳糖和3，6-脫水-L-吡喃半乳糖基。 瓊脂糖分子中含有很多羥基，羥基之間的氫鍵使瓊脂糖分 子聚集，成為形成凝膠的主要作用力。 瓊脂糖形成凝膠的過程如圖3所示。在加熱條件下， 瓊脂糖溶于水，形成溶液。當該溶液的溫度降至 45左右時，多糖鏈(圖3左部)通過鏈間的氫鍵形成 雙螺旋結構(圖3中部)。雙螺旋之間通過氫鍵相連成 束，束間再通過氫鍵作用形成三維網(wǎng)絡結構(圖3右 部)，即凝膠36。由于維系三維網(wǎng)狀結構的作用 力主要是氫鍵，因此能破壞氫鍵的因素都能破壞瓊 脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠三維網(wǎng)絡結構中存在大量微 孔，這就是DNA分子在凝

9、膠中移動的通道。 在一定的電場強度下，相同構型的DNA分子，在凝膠 中的遷移速率與分子量的對數(shù)值呈反比關系，因此可 以將不同分子量的DNA分開。分子量相同時，不同構 型DNA分子的遷移速率也不同，也可以分開。圖展示 了DNA的3種分子構型。 通常，超螺旋DNA的遷 移速率最快，線性DNA 次之，開環(huán)DNA最慢。 因此，瓊脂糖凝膠電泳 技術成為分離、鑒定 DNA混合物的常用方法。 電泳是如何實現(xiàn)分離DNA的 電泳實驗過程通常包含4個環(huán)節(jié)。將瓊 脂糖在水中加熱到90以上使其溶解后， 趁熱倒入制膠板中，讓它在室溫下自然 凝固，形成半固體狀的無色透明凝膠片。 這一步稱為制膠。 制膠板中事前插有梳子，當

10、凝膠形成后，移 去梳子，膠片中就留下了小孔。將這樣的凝 膠片放人電泳槽(圖7)，加入電泳液后，向小 孔中加入待分離的DNA樣品。 這一步稱為點樣，通 常的點樣量只有幾個 微升。接通電源，在 電場的作用下，DNA 分子在凝膠的孔隙中 向正極移動，這就是 電泳。 分子量不同或構型不同的DNA分子的電泳速率 不同，因此可以分離開來。由于DNA本身無色， 所以需要加入一種有色指示劑，來幫助人們 確定它移動到了什么位置。所用指示劑一般 分子量很小，電泳速率較快，跑在泳帶的最 前端，可以根據(jù)它的位置及時終止電泳。實 驗中還需要加入某種熒光染色劑，它與DNA的 結合體在紫外光照射下發(fā)出熒光，從而將分 離出的

11、DNA條帶顯示出來。 圖1就是加有熒光染色劑的樣品在紫外光 下拍攝的照片。將實驗樣品與DNA標準樣 品同時電泳，比對2者的條帶位置，就可 以鑒定分離出的DNA的分子量或構型。 瓊脂糖凝膠電泳可以： （1）用于DNA切膠回收；（2）用于 DNA分離；（3）用于佐證DNA是否重組、 質粒等是否切開以及其他分子生物學 研究。 第一次討論課第一次討論課 （2 2） 第第3 3組組 口腔口腔14011401班班 原理 方法 注意事項 結果鑒定 人類細胞質 RNA提取 原理 方法 RT-PCR的原 理、方法 原理 結果分析 應用 瓊脂糖凝膠 電泳結果分 析及其應用 人類細胞質人類細胞質RNARNA提取提取

12、 真核細胞總RNA主要由 rRNA（80-85%）、tRNA 和核內小分子RNA(10- 15%)、mRNA（1-5%）組 成，其中rRNA、tRNA和 mRNA位于細胞質中。 RNA提取實質就是將細胞 裂 解，釋放RNA，并通 過不同方式去除蛋白、 DNA等雜質最終獲得高純 度RNA產(chǎn)物的過程。 AAAAAA AAAAAA tRNA mRNA rRNA 人類細胞質人類細胞質RNARNA提取提取 RNA是一類極易降解的分子， 要得到完整的RNA必須最大限 度地抑制提取過程中內源性及 外源性核糖核酸酶對RNA的降 解。在分離RNA的過程中，用 抑制劑以抑制RNA酶的活性。 RNA提取對樣品的新鮮

13、性要求 非常高，獲取樣品后最好立即 提取RNA，若無條件立即實驗， 應于-80或液氮中保存樣品， 取出樣品后立即在低溫下研磨 裂解細胞，以防RNA降解。 建立一個無RNA酶的環(huán)境 Trizol法 2021-7-13 DEPC,焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 RNA操作時最常用的RNase抑制劑，對核酸酶有很強的 抑制作用。作用機制是與蛋白質中的活性基團組氨酸結合， 使蛋白質變性。 使用方法：用來去除溶液中的RNase 。RNA提取中 所有液體試劑都應該用DEPC處理。 有效濃度：0.05%-0.1%，室溫磁力攪拌20分鐘。 滅活條件：高壓消毒，或70 C 1 h。 在Tris溶液中半衰期為1.25m

14、in。 儲存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。 人類細胞質人類細胞質RNARNA提取提取 Trizol是一種苯酚與異硫氰酸胍(GTC) 的混合物。 異硫氰酸胍可裂解細胞，并使RNA與蛋 白質分離。酸性苯酚促使RNA進入水相，離 心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白質保 留在有機相中。轉移水相，加入異丙醇沉 淀RNA，從而得到純化的總RNA。 人類細胞質人類細胞質RNARNA提取提取 破碎組 織 分離 RNA 沉淀RNA 融解 RNA 保存 RNA 洗滌RNA l 可以用鹽酸胍、硫 氰酸胍、蛋白酶K等 破碎組織 l 加入-ME可抑制 RNA酶的活性 l 一般用酚、氯仿 等有機溶劑，

15、加 入少量異戊醇， 離心。RNA分 層于上部。 l 一般用乙醇、 3M NaAc 或異丙醇 l 使用70%乙醇洗滌， 洗滌后可以曬干或烤 干乙醇（但是不能過 于干燥，否則不易溶 解） 人類細胞質人類細胞質RNARNA提取提取 u塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高壓滅菌。 u有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水 沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然 后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。 u所有的玻璃器皿均應在使用前于180的高溫下干 烤6h或更長時間。 u配制的溶液應盡可能用0.1% DEPC在37處理12h以 上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓

16、滅 菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制， 然后經(jīng)濾膜過濾除菌。 RNARNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活 人類細胞質人類細胞質RNARNA提取提取 u全程佩戴一次性手套。皮膚帶有 細菌和外源性核糖核酸酶，可能 污染RNA。 2021-7-13 4內因：核糖殘基的2和3位置帶有羥 基，易被水解 4外因：內源、外源RNA酶含量豐富， 加熱后仍能夠正確折疊恢復活性，不 易失活 人類細胞質人類細胞質RNARNA提取提取 完整的RNA的電泳可明顯地觀察到28S和18S兩條 帶，并且28S大約是18S的兩倍寬。 若兩條帶不明顯, 則說明R

17、NA部分降解。 人類細胞質人類細胞質RNARNA提取提取 RT-PCR RT-PCR 原理及方法原理及方法 逆轉錄逆轉錄PCRPCR原理及方法原理及方法 知識背景 基因表達 RT-PCR原理簡介 RNA cDNA 目的目的 片段片段 PCR RT l實質聚合酶鏈式反應（PCR）廣泛應 用的變形. 知識背景 RT (reverse transcription ） 即逆轉錄，指以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指 導下的DNA合成。逆轉錄過程是RNA病毒的復制形式之 一，需逆轉錄酶的催化。 RNA cDNA 逆轉錄 RT 逆轉錄酶的選擇 RNA cDNA 逆轉錄酶 逆轉錄酶（reverse

18、transcriptase）是存在于RNA病毒體 內的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性： 1.依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條 鏈； 2.Rnase水解活性：由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA 形成的雜交分子； 3.依賴DNA的DNA聚合酶活性:以反轉錄合成的第一條DNA單 鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA鏈。 4.常見的有哺乳動物型,最適溫度37度，禽類最適溫度42度 48 RT實驗要素-決定反應的特異性和靈敏性 * 分離高質量分離高質量RNA * 使用高活性的逆轉錄酶使用高活性的逆轉錄酶 * 提高逆轉錄酶保溫溫度提高逆轉錄酶保

19、溫溫度 * 減少基因組減少基因組DNA污染污染 知識背景 PCR (Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以 母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變 性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板 DNA互補的子鏈DNA的過程。 是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異的在體 外擴增任何目的的DNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序 列分析，基因表達調控，基因多態(tài)性研究等許多方 面。 PCR RT-PCR方法 引物的設計 引物特異性決定PCR的特異性 A.引物長度:一般為1530bp B.堿基分布:四種堿基最好應隨機分布，避免嘌呤或 嘧啶的

20、聚集存在 C. 3端要求：3端必須與模板嚴格互補，不能進行任 何修飾，也不能有形成任何二級結構的可能。 D.引物自身二級結構：引物自身不應存在互補序列 E.引物之間的二級結構 F.同源序列。 G.5端無嚴格限制 標準的PCR過程分為三步 DNA變性 （90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單 鏈DNA 退火 （50-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局 部雙鏈。 延伸 （70-75）：在Taq酶（72左右，活性最佳梯度PCR儀） 的作用下，以dNTP為原料，從引物的3端開始以從53端 的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈 三步一個循環(huán)，以此往復， PCR: PCR

21、的基本流程：的基本流程： 94oC, 45 sec 55oC, 1 min 72oC, 2 min 退火溫度的變化是根據(jù)退火溫度的變化是根據(jù) 引物的引物的GC比例確定或估比例確定或估 計的；計的； 退火時間的變化是根據(jù)退火時間的變化是根據(jù) 引物的長度調整的。引物的長度調整的。 熱啟動：熱啟動： 避免發(fā)夾結構或其避免發(fā)夾結構或其 他二級結構影響引他二級結構影響引 物的退火。物的退火。 兩種方式加入兩種方式加入DNA聚合酶：聚合酶： 熱啟動結束后暫停熱啟動結束后暫停PCR反應，在反應，在PCR儀儀 上直接趁熱加入上直接趁熱加入DNA pol； 熱啟動結束后將反應管迅速放在冰上，熱啟動結束后將反應管迅速放在冰上， 然后加入然后加入DNA pol。 55 PCR RT-PCR RNA cDNA 目的目的 片段片段 PCR RT RT-PCR的兩種方法 RT-PCR的兩種方法 %二步法 RT-PCR的兩種方法 %一步法 RT-PCR兩種方法的比較 RT-PCR的應用 分析基因的轉錄產(chǎn)物 獲得目的基