細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1SIRT1活性比色法定量檢測(cè)試劑盒中文.doc

1、細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白 1 (SIRT1 )活性比色法定量檢測(cè)試劑盒(中文版)主要用途細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)比色探針對(duì)硝基苯胺標(biāo)記人工合成的乙?；?p53 多肽底物，經(jīng)過(guò) SIRT1 脫乙?；?，被位點(diǎn)特異性氨基肽酶水解，釋放黃色對(duì)硝基苯胺， 即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí) 驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品 (動(dòng)物、人體) 、核蛋白樣品、 部分或完全純化酶樣品中 SIRT1 的活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。技術(shù)背景人體組蛋白脫乙酰基

2、酶(histone deacetylase； HDAC )家屬分成三類共20多個(gè)蛋白：種類I(class I)與酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8,存在于細(xì)胞核中；種類II(class II)與酵母Hda1蛋白同源，包括 HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化 結(jié)構(gòu)域含有鋅，且曲古菌素A ( trichostatin A ； TSA)敏感。種類III (class III )為NAD +輔助因子必需，又稱為 sirtuins，與酵母 Sir2( Silent Information Regulator 2

3、)同源，包括 SIRT1 至7等，為曲古菌素 A( trichostatin A ； TSA)不敏感型賴氨酸脫乙?；?lysyl-deacetylase)。催化賴氨酸脫乙酰基反應(yīng)，以及由NAD +和乙酰(acetyl)基團(tuán)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的煙酰胺(nicotinamide )和O-乙酰ADP核糖(O-acetyl-ADP-ribose )。SIRT1位于細(xì)胞核內(nèi)，與酵母Sir2同源性最高。其功能在于調(diào)節(jié)p53活性和抑制細(xì)胞凋亡?；谌斯ず铣傻囊阴；痯53 ( 379 至382氨基酸位點(diǎn))多肽底物 Ac-Arg-His-Lys-Lys ( Ac )具有抗氨基肽酶切離的功能，首先使用比色染料對(duì) 硝基苯胺

4、(p-Nitroaniline ； p-NA )來(lái)標(biāo)記乙?；痯53多肽底物，其次進(jìn)行脫乙?；詈蟮孜镞M(jìn)一步在氨基 肽酶的催化酶解，釋放出具有強(qiáng)烈吸光值的黃色對(duì)硝基苯胺(波長(zhǎng) 405nm) ，由此來(lái)定量測(cè)定沉默調(diào)節(jié)蛋 白 1 的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：Sirt1Ac-Arg-His-Lys-Lys (Ac) -p-NA + NAD 宀 Ac-Arg-His-Lys-Lys- p-NA + nicotinamide + O-acetyl-ADP-ribose氨基肽酶Ac-Arg-His-Lys-Lys- p-NAAc-Arg-His-Lys-Lys + p-NA產(chǎn)品內(nèi)容裂解液( Reagent A)

5、 分離液( Reagent B) 清理液( Reagent C) 萃取液( Reagent D) 緩沖液( Reagent E) 底物液( Reagent F) 終止液( Reagent G) 酶解液( Reagent H) 補(bǔ)充液( Reagent I) 產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)20 毫升80 毫升80 毫升5 毫升3 毫升100 微升200微升200微升500微升1份保存方式保存 緩沖液(Reagent E)、底物液(Reagent F)、終止液(Reagent G)和 酶解液(Reagent H)在20 C冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4 C冰箱里；底物液(Reagent D)避免光照，有效保證

6、6月用戶自備磷酸鹽緩沖溶液(PBS):用于清洗細(xì)胞樣品15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器1.5 毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器(微型)臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育96 孔板或 100 微升厘米光徑比色皿：用于反應(yīng)和比色的容器酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于比色分析實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將-20 C冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。一、樣品準(zhǔn)備I. 準(zhǔn)備好75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞(1至5 X 107細(xì)胞)2 小心抽去培養(yǎng)液3. 小心加入 10 毫升用戶自備的磷酸鹽緩沖溶液(PBS) ，覆蓋生長(zhǎng)表面4. 小心抽去清理液5. 使用細(xì)胞

7、刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意： 避免使用胰酶消化 )6. 加入1毫升 裂解液(Reagent A),混勻細(xì)胞7. 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管8. 強(qiáng)力渦旋震蕩 10秒9. 置于冰槽里孵育 15 分鐘10. 加入4毫升預(yù)冷的 分離液(Reagent B),混勻II. 放進(jìn)4C臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1300g12. 小心抽去上清液13. 加入 4 毫升預(yù)冷的 清理液( Reagent C)14. 放進(jìn)4C臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1300g15. 小心抽去上清液16. 小心加入100微升預(yù)冷的 萃取液(Reagent D)，混勻17. 轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的 1.5毫升離心管18. 超聲

8、處理 30 秒19. 置于冰槽里孵育 30 分鐘20. 放進(jìn)4C微型臺(tái)式離心機(jī)離心 10分鐘，速度為 16000g (或13000RPM，例如EPPENDORF 5415)21. 小心移取上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管22. 移取 10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意： 建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 HL 30030.1 )23. 即刻放進(jìn)70 C保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作測(cè)定準(zhǔn)備1 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等） ，置于冰槽里2. 設(shè)定好酶標(biāo)儀或分光光度儀（溫度為 30C）:波長(zhǎng)405nm，并置零3 緩沖液（ Reagent E） 置于室溫下均衡溫度三、活性測(cè)

9、定（一） 終點(diǎn)法活性測(cè)定1. 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對(duì)照和待測(cè)樣品2. 分別移取 55 微升 緩沖液（ Reagent E） 到相應(yīng)孔里3. 分別加入 5 微升 底物液（ Reagent F）4. 分別加入20微升 補(bǔ)充液（Reagent I）或待測(cè)樣品（50微克核蛋白或200微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋白）（注意： 樣品須清澈 ）5. 輕輕搖動(dòng) 96 孔板 30 秒6. 放進(jìn)30C培養(yǎng)箱里，孵育 60分鐘，避免光照7. 分別加入 10 微升 終止液（ Reagent G）8. 分別加入 10 微升 酶解液（ Reagent H）9. 輕輕搖動(dòng) 96 孔板 30 秒10 .在30 C培

10、養(yǎng)箱里，孵育 30分鐘11 .即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到 100 微升 1 厘米光徑比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)12.活性計(jì)算：（ 1）酶標(biāo)儀檢測(cè)（樣品讀數(shù)背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10 （體系容量；毫升）-0.02 （樣品容量；毫升）X 10.5 （毫 摩爾吸光系數(shù)）X 1 （反應(yīng)時(shí)間；小時(shí)）X 0.6 （光徑距離；厘米）=單位/毫升-（樣品蛋白濃度）毫克/ 毫升=單位/毫克單位=微摩爾對(duì)硝基苯酚/小時(shí)（ 2）比色皿檢測(cè)（樣品讀數(shù)背景讀數(shù)） X 樣品稀釋倍數(shù) X 0.10（體系容量；毫升） -0.020（樣品容量；毫升） X 10.5 （毫摩爾吸光系數(shù)）X 1 （反應(yīng)時(shí)間；小時(shí)

11、）=單位/毫升-（樣品蛋白濃度）毫克/毫升=單位/毫克單位=微摩爾對(duì)硝基苯酚/小時(shí)二） 酶動(dòng)法活性測(cè)定1. 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對(duì)照和待測(cè)樣品2.分別移取 65 微升 緩沖液（ Reagent E） 到相應(yīng)孔里3.分別加入 5 微升 底物液（ Reagent F）4.分別加入20微升 補(bǔ)充液（Reagent 1）或待測(cè)樣品（50微克核蛋白或200微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋白）（注意： 樣品須清澈 ）5.輕輕搖動(dòng) 96 孔板 30 秒6.放進(jìn)30 C培養(yǎng)箱里，孵育 2分鐘，避免光照7.分別加入 10 微升 酶解液（ Reagent H）8.輕輕搖動(dòng) 96 孔板 5 秒9.即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或

12、轉(zhuǎn)移到 100微升 1 厘米光徑比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)：間隔5 分鐘，讀數(shù) 6次（共 30 分鐘） 獲得吸光讀數(shù)10.活性計(jì)算：1） 酶標(biāo)儀檢測(cè)（樣品讀數(shù)背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升）-0.02 （樣品容量；毫升）X 10.5 （毫 摩爾吸光系數(shù)）X 30 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 0.6 （光徑距離；厘米）=單位/毫升-（樣品蛋白濃度）毫克/ 毫升=單位/毫克單位=微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘（ 2）比色皿檢測(cè)（樣品讀數(shù)背景讀數(shù)） X 樣品稀釋倍數(shù) X 0.10（體系容量；毫升） -0.020（樣品容量；毫升） X 10.5 （毫摩爾吸光系數(shù)）X 30 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）=

13、單位/毫升-（樣品蛋白濃度）毫克/毫升=單位/毫克單位=微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘注意事項(xiàng)1 本產(chǎn)品為 20 次操作，包括背景對(duì)照2 操作時(shí)，須戴手套3 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需 1 次4 樣品須澄清，至關(guān)重要5.樣品處理時(shí)，避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF、烷基胺（alkyl amine ）等6 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測(cè)定7. 濾波器可以使用波長(zhǎng) 400nm 替代 405nm8. 測(cè)定值由低到高變化；酶動(dòng)法測(cè)定可以持續(xù) 60 分鐘9. 測(cè)定值吸光讀數(shù)越高，表明酶活性越高10. 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底11. 待測(cè)樣本為核蛋白樣品，其蛋白濃度為 50微克/20微升；待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液