提質(zhì)粒原理五之歐陽(yáng)歌谷創(chuàng)作

1、提質(zhì)粒原理五歐陽(yáng)歌谷()堿裂解法抽提質(zhì)粒原理堿裂解法從大腸桿菌制備質(zhì)粒是從事分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)室每 天都要用的常規(guī)技術(shù)。為了方便理解這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提 用到三種溶液：溶液 150 mM 葡萄糖 /25 mM TrisCi / 10 mM EDTAH &0;溶液 II0.2 N NaOH / 1%SDS;溶液III3M醋酸鉀/ 2 M醋酸。讓我們先來(lái)看看溶液I的作用。任何生物化學(xué)反應(yīng)首先要控制好 溶液的H因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)H值的TrisCi溶液是再自然不 過(guò)的了。那么50mM葡萄糖是干什么的呢？說(shuō)起來(lái)不可思議加 了匍萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)中夬速沉積到管 子的底部。因

2、此如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身 而言幾乎沒(méi)有任何影響。所以說(shuō)溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子 的螯合劑配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用杲：抑制DNase的 活性和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá)10 mM的EDTA無(wú) 非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果 不加EDTA其實(shí)也沒(méi)什么大不了的只要不磨洋工只要是在不太長(zhǎng) 的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提就不用怕DNA會(huì)迅速被降解因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTAO如果珈天你手上正好缺了溶液I 可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告訴你只要用等體積的水或LB培養(yǎng) 基來(lái)懸浮菌體就可

3、以了。有一點(diǎn)不能忘的是菌體一定要懸浮均勻 不能有結(jié)塊。輪到溶液II 了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2%的SDS等體 積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH無(wú)非是 為了保證NaOH沒(méi)有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不 知道其實(shí)破細(xì)胞的主要杲堿而不是SDS所以才叫堿法抽提。事 實(shí)上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng) 物細(xì)胞碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer （雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle （微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下）自然就難

4、高效率抽提得到質(zhì)粒。如果 只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒因?yàn)镾DS也是堿性的只是 弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA 變性以便沉淀這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)DNA變性 復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要冋既然是NaOH溶解的細(xì)胞那為 什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩 點(diǎn)：第一時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)千萬(wàn)不要這時(shí)候去接因?yàn)樵谶@樣的碩性條 件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二必須溫柔混合（象對(duì)待 女孩子一樣）不然基因組DNA也會(huì)斷裂?；蚪MDNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩后廁我再詳細(xì)說(shuō)明。歐陽(yáng)歌谷創(chuàng)編每個(gè)人都知道溶液01加入后就會(huì)有大量的沉淀但大部分人卻不明 白

5、這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的 沉淀。如果你這樣懷疑往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液 看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)顯然與SDS的加入 有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會(huì)怎樣呢也會(huì)有少量的沉淀但 量上要少得多顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然SDS 不是遇酸發(fā)生的沉淀那會(huì)不會(huì)杲遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的 SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是 會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了 SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KC1你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的 多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfa

6、te)遇到鉀離 子后變成了十二烷基硫酸鉀(otassium dodecylsulfate,DS)而DS 是水不溶的因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)溶液III加入后的沉淀實(shí) 際上杲鉀離子置換了 SDS中的納離子形成了不溶性的DS而高濃 度的鹽使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合平 均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉 淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了讓人高興的杲大腸桿菌的基因 組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象因?yàn)榛蚪MDNA 太長(zhǎng)了長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被DS給共沉淀了盡管SDS并不與 DNA分子結(jié)合。那么2M的醋酸又杲為什么而加的呢？ 是為了中和NaOH因?yàn)?

7、長(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA所以要中和之?；蚪MDNA 旦 發(fā)生斷裂只要是50-100 kb大小的片斷就沒(méi)有辦法再被DS共沉 歐陽(yáng)歌谷創(chuàng)編2021年2月1淀了。所以堿處理的時(shí)間要短而且不得激烈振蕩不然最后得到的 質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入瓊脂糖電泳可以觀察到一 條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液10加入后基因組DNA無(wú)法快速?gòu)?fù)性就被沉 淀了這杲天大的誤會(huì)因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好DNA分子在中 性溶液中都是溶解的。NaOH本來(lái)是為了溶解細(xì)胞而用的DNA分 子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物與它是不杲沉淀下來(lái)其實(shí)沒(méi)有關(guān)系。溶 III加入并混合均勻后在冰上放置目的是為了 DS沉淀更充分一 點(diǎn)。不要

8、以為DS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了其實(shí) 還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提然 后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA不然時(shí)間一長(zhǎng)就 會(huì)因?yàn)榛烊氲腄Nase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的這里做個(gè)全的 介紹。酚（henol）對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿按道理應(yīng)該用酚來(lái)最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉但是水飽 和酚的比重略比水重碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氟酸 M）離心后酚相會(huì)跑到上層不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加 入氯仿后可以增加比重使得酚/氯仿始終在下層方便水相的回收； 還有一點(diǎn)酚與水有很大的互溶性如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量 的酚溶

9、解到水相中而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反 應(yīng)）應(yīng)此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的 酚去除而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提跑到水相中的酚則少得多微量的酚在乙醇沉淀時(shí)就合被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能 正常進(jìn)行。至于異戊醇的添加其作用主要是為了讓離心后上下 層的界更加清晰也方便了水相的回收?；厥蘸蟮乃嗪凶銐蚨嗟柠}因此只要加入2倍體積的乙醇在 室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來(lái)。這時(shí)候如 果放到20C時(shí)間一長(zhǎng)反而會(huì)導(dǎo)致大量鹽的沉淀這點(diǎn)不同于普通的 DNA酒精沉淀回收所以不要過(guò)分小心了。高濃度的鹽會(huì)水合大量 的水分子因DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果

10、沉 淀就用70%的乙醇多洗幾次每次在室溫放置一個(gè)小時(shí)以上并用ti 將沉淀打碎就能得到好的樣品。得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase(50ug/ml)的TE緩沖液進(jìn)行溶解不然大量未降解的RNA會(huì)干 擾電泳結(jié)果的。瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí)多數(shù)情況下你 能看到三條帶但千萬(wàn)不要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線性和開(kāi)環(huán)這 三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA不信的話你用 EcoRI來(lái)線性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳就會(huì)看到線性質(zhì)粒DNA 的位置與這三條帶的位置不一樣。其實(shí)這三條帶以電泳速度的快 慢而排序分別是超螺旋、幵環(huán)和復(fù)制中間體(即沒(méi)有復(fù)制完全的 兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起)。如果你不小心在溶液II加入后過(guò)度

11、振蕩 合有第四條帶這條帶泳動(dòng)得較慢遠(yuǎn)離這三條帶杲20100kb的大腸 桿菌基因組DNA的片斷。補(bǔ)充1. A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)最佳測(cè)量值的范圍為0.1至1.0o如 歐陽(yáng)歌谷創(chuàng)編2021年2月1果不在此范圍稀釋或濃縮樣品使之在此范圍內(nèi)；如果吸光度小于0.05檢查是否存在操作因素（如移液不準(zhǔn)確樣品內(nèi)有懸浮物等） 影響。DNA樣品的A260吸光度值杲否>0.1o （請(qǐng)注意這個(gè)值 跟儀器無(wú)關(guān)核酸的吸光度必需大于0.1其值才有效和可靠因?yàn)闃?品中的雜質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會(huì)對(duì)光有一定吸收其值朗伯-比爾定律：A吸光值10入射光強(qiáng)度I投射光強(qiáng)度c吸光物質(zhì)的摩爾濃度（mol/L）d

12、光通過(guò)的液層厚度（cm）摩爾吸光系數(shù)（Lmollcml）2. A280nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)比值可進(jìn)行核酸樣品純 度評(píng)估:純DNA的A260/A280比值為1.8純RNA為2.0。如果 比值低表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染需要純化樣 品。比值=15相當(dāng)于50%蛋白質(zhì)/DNA溶液3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)比值可逬行核酸樣品純度評(píng)佶:純DNA和RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染需要純化歐陽(yáng)歌谷創(chuàng)編2021年2月1樣品。A230產(chǎn)生負(fù)值主要是由于在很低DNA濃度的溶液中的一 些其他成分的干擾所導(dǎo)致的。在下一個(gè)測(cè)定中需要降低樣品的稀 釋度A230的負(fù)值會(huì)被校正。4. A320nm 或 A340nm為檢測(cè)溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應(yīng)該接近0.0。如果 不是標(biāo)明溶液中有懸浮物需要純化樣品。純樣品的A320 般是 0o5. A260/A280 和 A260/A230是核酸純度的指示值純度好的DNA在H78.5下其比值應(yīng)該在2.0 或2.