歡迎各位老師及同學(xué)

1、歡迎各位老師及同學(xué)！ 香鱗毛蕨的轉(zhuǎn)錄組測序香鱗毛蕨的轉(zhuǎn)錄組測序 報(bào)告人：佟偉霜 2012.01.07 轉(zhuǎn)錄組是什么轉(zhuǎn)錄組是什么-what 1 轉(zhuǎn)錄組的常用方法轉(zhuǎn)錄組的常用方法-how 2 RNA-Seq能做什么？能做什么？ 3 我們是怎樣做的？我們是怎樣做的？ 4 我們的結(jié)果如何？我們的結(jié)果如何？ 5 Contents 1.轉(zhuǎn)錄組是什么？轉(zhuǎn)錄組是什么？ DNADNA轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄的 所有所有RNARNA mRNAmRNA 轉(zhuǎn)錄組即特定細(xì)胞在某一功能狀轉(zhuǎn)錄組即特定細(xì)胞在某一功能狀 態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的的 總和，包括總和，包括mRNA和和ncRNA。 n 基因芯片技術(shù)基

2、因芯片技術(shù) Microarray n 基因表達(dá)序列分析技術(shù)基因表達(dá)序列分析技術(shù) Serial analysis of gene expression，SAGE n 大規(guī)模平行測序技術(shù)大規(guī)模平行測序技術(shù) Massively parallel signature sequencing，MPSS n RNA 測序技術(shù)測序技術(shù) RNA sequencing，RNA-seq 2.轉(zhuǎn)錄組是怎樣做的轉(zhuǎn)錄組是怎樣做的-常用方法常用方法 J 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： J 成本適中，其對較高表達(dá)成本適中，其對較高表達(dá) 的基因檢測比較準(zhǔn)確，數(shù)的基因檢測比較準(zhǔn)確，數(shù) 據(jù)分析軟件較多，整個(gè)方據(jù)分析軟件較多，整個(gè)方 法較為成熟法較為

3、成熟 L 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： L 對低表達(dá)基因檢測敏感度對低表達(dá)基因檢測敏感度 不夠，前期工作基礎(chǔ)要求不夠，前期工作基礎(chǔ)要求 較高，而且很難檢測出融較高，而且很難檢測出融 合基因轉(zhuǎn)錄、多順反子轉(zhuǎn)合基因轉(zhuǎn)錄、多順反子轉(zhuǎn) 錄等異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物錄等異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.常用方法常用方法-基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù) 流程流程 RNA cDNA Hydrization with microarrys Transcriptme RNA cDNA Anchoring enzyme cDNA fragment Ligated with linker cDNA fragment with linker Tagging enzy

4、me Tag Ligation and PCR diTag Anchoring enzyme Concatemers Sequecing Transcriptme J 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： J 不需基因序列的信息，能夠不需基因序列的信息，能夠 全局性地檢測所有基因的表全局性地檢測所有基因的表 達(dá)水平，可顯示基因差異，達(dá)水平，可顯示基因差異， 可獲得未知基因特別是那些可獲得未知基因特別是那些 低拷貝基因低拷貝基因 J 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： J 文庫構(gòu)建流程長，技術(shù)要求文庫構(gòu)建流程長，技術(shù)要求 高，單條短序列標(biāo)簽所含的高，單條短序列標(biāo)簽所含的 基因信息很少，不適于遺傳基因信息很少，不適于遺傳 信息缺乏的植物信息缺

5、乏的植物 2.常用方法常用方法-基因表達(dá)序列分析技術(shù)基因表達(dá)序列分析技術(shù) 流程流程 RNA cDNA Cloned to adaptor vectors cDNA library with adaptors PCR cDNA fragment with adaptors T4 polymerase dGTP ss cDNA fragment with adaptors Load on microbeads and sequncing Transcriptme J 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： J 獲得更長的短標(biāo)簽，因而獲得更長的短標(biāo)簽，因而 精度更高；此外，精度更高；此外，MPSS 技術(shù)特有的微球熒光測序技術(shù)

6、特有的微球熒光測序 可直接高通量讀出序列，可直接高通量讀出序列， 簡化了測序過程簡化了測序過程 L 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： L 涉及涉及PCR 擴(kuò)增、克隆等可擴(kuò)增、克隆等可 能會(huì)產(chǎn)生堿基偏向性的操能會(huì)產(chǎn)生堿基偏向性的操 作步驟，從而影響轉(zhuǎn)錄本作步驟，從而影響轉(zhuǎn)錄本 的正確識(shí)別的正確識(shí)別 2.常用方法常用方法-大規(guī)模平行測序技術(shù)大規(guī)模平行測序技術(shù) 流程流程 轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組測序 RNARNA片段化片段化 (200-700(200-700 bp bp) ) 用連有用連有Oligo(dT)Oligo(dT)的的 磁珠富集磁珠富集mRNAmRNA（真）（真） 隨機(jī)引物引導(dǎo)隨機(jī)引物引導(dǎo) cDNAcDNA合成合成

7、去除去除rRNArRNA富集富集mRNAmRNA （原核生物）（原核生物） cDNAcDNA片段片段 (200-700 bp)(200-700 bp) 反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA 加接頭加接頭 總總RNARNA2.常用方法常用方法-RNA-Seq流程流程 2.常用方法常用方法-RNA-Seq J 提供更多信息，可以得到用基因芯片難以得到的轉(zhuǎn)提供更多信息，可以得到用基因芯片難以得到的轉(zhuǎn) 錄可變剪接序列錄可變剪接序列 J 對低表達(dá)基因的檢測更加準(zhǔn)確，并且可以定量確定對低表達(dá)基因的檢測更加準(zhǔn)確，并且可以定量確定 轉(zhuǎn)錄水平。轉(zhuǎn)錄水平。 J RNA-seq 技術(shù)得到的標(biāo)簽長度技術(shù)得到的標(biāo)簽長度(由

8、采取的高通量測由采取的高通量測 序技術(shù)的讀長而定，可達(dá)序技術(shù)的讀長而定，可達(dá)400 bp)比比SAGE 和和MPSS 顯著增加，提高了識(shí)別轉(zhuǎn)錄本的特異性和準(zhǔn)確性顯著增加，提高了識(shí)別轉(zhuǎn)錄本的特異性和準(zhǔn)確性 J 成本更低成本更低 有參考基因組有參考基因組 -轉(zhuǎn)錄組重測序轉(zhuǎn)錄組重測序 轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組測序 2. RNA-Seq -分類分類 無參考基因組無參考基因組 -轉(zhuǎn)錄組從頭組裝轉(zhuǎn)錄組從頭組裝 2. RNA-Seq -數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 n基因表達(dá)差異分析基因表達(dá)差異分析 n檢測基因融合檢測基因融合 n基因結(jié)構(gòu)的優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)的優(yōu)化 n鑒定基因的可變剪接鑒定基因的可變剪接 n新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測

9、nSNPSNP分析分析 nUnigeneUnigene功能注釋功能注釋 nUnigene Gene Ontology Unigene Gene Ontology 分類結(jié)構(gòu)的優(yōu)化分類結(jié)構(gòu)的優(yōu)化 nUnigene Unigene 表達(dá)差異分析表達(dá)差異分析 n蛋白編碼區(qū)預(yù)測（蛋白編碼區(qū)預(yù)測（CDSCDS） nUnigene Pathway Unigene Pathway 富集分富集分 析析 有參考基因組有參考基因組 -轉(zhuǎn)錄組重測序轉(zhuǎn)錄組重測序 無參考基因組無參考基因組 -轉(zhuǎn)錄組從頭組裝轉(zhuǎn)錄組從頭組裝 2. RNA-Seq -無參考基因組的數(shù)據(jù)分析流程無參考基因組的數(shù)據(jù)分析流程 原始序列數(shù)據(jù)原始序列數(shù)

10、據(jù) UnigenesUnigenes 基因注釋基因注釋 Unigene Unigene 表達(dá)量注釋表達(dá)量注釋預(yù)測編碼蛋白框（預(yù)測編碼蛋白框（CDSCDS）Unigene Unigene 功能注釋功能注釋 UnigeneUnigene表達(dá)差異分析表達(dá)差異分析UnigeneUnigene的的GOGO和和PathwayPathway分析分析 GOGO功能顯著性富集分析功能顯著性富集分析 PathwayPathway顯著性富集分析顯著性富集分析 Clean readsClean reads n SWISS-PROT的網(wǎng)址是：的網(wǎng)址是：http:/www.ebi.ac.uk/swissprot/ SWI

11、SS-PROT是經(jīng)過注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，由歐洲生是經(jīng)過注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，由歐洲生 物信息學(xué)研究所物信息學(xué)研究所(EBI)維護(hù)。維護(hù)。 n COG庫的網(wǎng)址是：庫的網(wǎng)址是：/COG 蛋白質(zhì)直系同源簇蛋白質(zhì)直系同源簇(COGs)數(shù)據(jù)庫是對細(xì)菌、藻類和真核生數(shù)據(jù)庫是對細(xì)菌、藻類和真核生 物的物的21個(gè)完整基因組的編碼蛋白，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分類個(gè)完整基因組的編碼蛋白，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分類 構(gòu)建而成。構(gòu)建而成。 n KEGG的網(wǎng)址是：的網(wǎng)址是：http:/www.genome.ad.jp/kegg/ 京都基因和基因組百科全書京都基因和基因組百科

12、全書(KEGG)是系統(tǒng)分析基因功能，是系統(tǒng)分析基因功能， 聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識(shí)庫。聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識(shí)庫。 n NCBI的的BLUST網(wǎng)址是：網(wǎng)址是： /BLAST/ 2. RNA-Seq -常用數(shù)據(jù)庫常用數(shù)據(jù)庫 3. RNA-Seq能做什么？能做什么？ -應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用領(lǐng)域 n單核苷酸突變單核苷酸突變 n選擇性剪接選擇性剪接 n可選啟動(dòng)子可選啟動(dòng)子 n等位基因的差異等位基因的差異 表達(dá)表達(dá) nRNARNA編輯編輯 n融合基因融合基因 n基因（轉(zhuǎn)錄本）基因（轉(zhuǎn)錄本） 的精確結(jié)構(gòu)的精確結(jié)構(gòu) n各種器官的基因各種器官的基因 表達(dá)

13、模式表達(dá)模式 n不同發(fā)育階段的不同發(fā)育階段的 基因表達(dá)模式基因表達(dá)模式 n動(dòng)植物疾病動(dòng)植物疾病 n作物抗逆性、適作物抗逆性、適 應(yīng)性研究應(yīng)性研究 n分子育種分子育種 n藥用植物代謝途藥用植物代謝途 徑分析徑分析 功能基因組功能基因組癌癥及復(fù)雜疾病癌癥及復(fù)雜疾病農(nóng)業(yè)及藥用植物農(nóng)業(yè)及藥用植物 3. 3. RNA-Seq能做什么能做什么? ? - 實(shí)例（有參考基因組）實(shí)例（有參考基因組） Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome. 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)

14、驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 研究目的研究目的 全面了解水稻全面了解水稻 基因表達(dá)情況基因表達(dá)情況 愈傷組織愈傷組織 根尖（根尖（14d） 莖尖（莖尖（14d） 葉（葉（2 stages） 稻花稻花/稻穗（稻穗（3 stages） 總測序量總測序量28G,每個(gè)樣本每個(gè)樣本 不低于不低于5 M的的SE reads 鑒定了鑒定了28563個(gè)基因的個(gè)基因的5 和和3UTR 區(qū)域區(qū)域 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)7232個(gè)新轉(zhuǎn)錄本個(gè)新轉(zhuǎn)錄本,新新 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度低，且轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度低，且 具有組織表達(dá)特異性具有組織表達(dá)特異性 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)23800個(gè)可變剪接個(gè)可變剪接 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)1356個(gè)融合基因個(gè)融合基因 Genome Res.

15、 2010 May;20(5):646-54. 3. 3. RNA-Seq能做什么能做什么? ? - 實(shí)例（有參考基因組）實(shí)例（有參考基因組） Characterization of Transcriptional Complexity during Berry Development in Vitis vimifera Using RNA-Seq 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 選取在成熟季節(jié)開花后選取在成熟季節(jié)開花后5,10, 5,10, 和和1515個(gè)星期葡萄分別代表葡萄個(gè)星期葡萄分別代表葡萄 果實(shí)成熟的著果期果實(shí)成熟的著果期, ,始熟期和成熟期始熟期和成熟期; ;分別選分別選3 3

16、棵向陽樹和棵向陽樹和3 3棵背棵背 陰樹，每棵樹相應(yīng)位置隨機(jī)摘取陰樹，每棵樹相應(yīng)位置隨機(jī)摘取1010個(gè)漿果，該實(shí)驗(yàn)設(shè)個(gè)漿果，該實(shí)驗(yàn)設(shè)2 2個(gè)重復(fù)個(gè)重復(fù) ，分別作為樣本池進(jìn)行，分別作為樣本池進(jìn)行total RNAtotal RNA提取。提取。 Plant Physiology, April 2010, Vol. 152, pp. 17871795 3 3個(gè)個(gè)stagesstages共測了共測了2.2G2.2G的數(shù)據(jù)量，的數(shù)據(jù)量，82.4%82.4%的的readsreads可以定位到可以定位到1 1 個(gè)（個(gè)（66.6%66.6%）或多個(gè)（）或多個(gè)（15.8%15.8%）基因組位置）基因組位置 將測

17、序所得將測序所得reads reads 與與referencereference（8.4X8.4X框架圖）數(shù)據(jù)比較，鑒框架圖）數(shù)據(jù)比較，鑒 定出定出85,870 85,870 個(gè)個(gè)SNPSNP 3. 3. RNA-Seq能做什么能做什么? ? - 實(shí)例（有參考基因組）實(shí)例（有參考基因組） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)385個(gè)基因具有個(gè)基因具有AS（alternative splicing），其中只在一），其中只在一 個(gè)漿果發(fā)育個(gè)漿果發(fā)育stage發(fā)生發(fā)生AS有有210個(gè)基因，只在兩個(gè)漿果發(fā)育個(gè)基因，只在兩個(gè)漿果發(fā)育 stage發(fā)生發(fā)生AS有有97個(gè)基因，只在三個(gè)漿果發(fā)育個(gè)基因，只在三個(gè)漿果發(fā)育s

18、tages都發(fā)生了都發(fā)生了 AS有有78個(gè)基因個(gè)基因 鑒定了新的基因，發(fā)現(xiàn)了鑒定了新的基因，發(fā)現(xiàn)了glutathione-S-transferase(GST)家族家族 的的53個(gè)新基因，個(gè)新基因，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中轉(zhuǎn)錄因子家族中28個(gè)新基因，這些基因個(gè)新基因，這些基因 因?yàn)楸磉_(dá)豐度低、缺少探針序列而無法被芯片檢測到因?yàn)楸磉_(dá)豐度低、缺少探針序列而無法被芯片檢測到 隨機(jī)選取隨機(jī)選取15個(gè)基因進(jìn)行個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)12個(gè)基因個(gè)基因qRT- PCR結(jié)果與結(jié)果與RNA-Seq相一致相一致 3. 3. RNA-Seq能做什么能做什么? ? - 實(shí)例（無參考基因組）實(shí)例（無參考基

19、因組） The Genetic Map of Artemisia annua L. Identifies Loci Affecting Yield of the Antimalarial Drug Artemisinin 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 研究目的研究目的 構(gòu)建與青蒿素構(gòu)建與青蒿素 產(chǎn)量相關(guān)的遺產(chǎn)量相關(guān)的遺 傳圖譜傳圖譜 濃縮的嫩葉濃縮的嫩葉, , 成熟葉片成熟葉片, ,及及 花芽上的腺毛花芽上的腺毛 細(xì)胞細(xì)胞 Science 327, 328 (2010) 3 RNA-Seq能做什么能做什么? - 實(shí)例（無參考基因組）實(shí)例（無參考基因組） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 香鱗毛蕨香鱗毛蕨 Dryopter

20、is fragrans(L.)Schott 鱗毛蕨科鱗毛蕨鱗毛蕨科鱗毛蕨 屬多年生蕨類植物。該屬植物所含有的酚類化合物具有較強(qiáng)屬多年生蕨類植物。該屬植物所含有的酚類化合物具有較強(qiáng) 的驅(qū)蟲、抑制腫瘤、抗病毒和殺菌作用。在我國北部地區(qū)，的驅(qū)蟲、抑制腫瘤、抗病毒和殺菌作用。在我國北部地區(qū)， 民間流傳香鱗毛蕨能治療各種皮膚病，因此近年來受到國內(nèi)民間流傳香鱗毛蕨能治療各種皮膚病，因此近年來受到國內(nèi) 外學(xué)者的高度關(guān)注。外學(xué)者的高度關(guān)注。 4.4.我們是怎樣做的？我們是怎樣做的？ 4.4.我們是怎樣做的？我們是怎樣做的？ 組培的香鱗毛蕨無菌苗組培的香鱗毛蕨無菌苗 Ck：25 48h；1:4 48h；2:35

21、 48h 獲得與香鱗毛蕨溫光處理?xiàng)l件下酚類代獲得與香鱗毛蕨溫光處理?xiàng)l件下酚類代 謝相關(guān)基因謝相關(guān)基因 5. 5. 我們的結(jié)果如何？我們的結(jié)果如何？ 結(jié)果結(jié)果 (6).(6).預(yù)測編碼預(yù)測編碼 蛋白框（蛋白框（CDSCDS） (1).產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì) (5).Unigene(5).Unigene代代 謝通路分析謝通路分析 (4).Unigene(4).Unigene 的的GOGO分類分類 (2).組裝結(jié)果組裝結(jié)果 (3).Unigene 功能注釋功能注釋 (8).(8).差異差異UnigeneUnigene 的的GOGO分析和分析和 PathwayPathway分析分析 (7).Unigene(

22、7).Unigene表表 達(dá)差異分析達(dá)差異分析 5. 5. 我們的結(jié)果如何？我們的結(jié)果如何？ - ( (1) 產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì) Samples Total Reads Total Nucleotides (nt) Q20 percentage N percentage GC percentage * CK26,775,8742,409,828,66092.36%0.00%49.57% 127,039,8502,433,586,50091.31%0.00%48.68% 227,047,3802,434,264,20092.47%0.00%49.88% 表表1.1.測序產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)測序產(chǎn)量統(tǒng)計(jì) Tab

23、.1 Yield statistical of RNA-Seq 5.5.我們的結(jié)果如何？我們的結(jié)果如何？ - (2)組裝結(jié)果組裝結(jié)果 ContigScaffoldUnigene ck1731377538056095 11894697713052561 21792148832264292 表表2 測序序列統(tǒng)計(jì)測序序列統(tǒng)計(jì) Tab. 2 Distribution fragment of RNA-Seq 5. 我們的結(jié)果如何？我們的結(jié)果如何？ - (2)組裝結(jié)果組裝結(jié)果 圖1 CK 的Unigene的長度分布圖 Fig.1Unigene length distribution of sample C

24、K 5.5.我們的結(jié)果如何？我們的結(jié)果如何？ - (2)組裝結(jié)果組裝結(jié)果 圖2 All-Unigene 的Gap（N）分布圖 Fig.2 Gap distribution of All-Unigene 5.5.我們的結(jié)果如何？我們的結(jié)果如何？ - (2)組裝結(jié)果組裝結(jié)果 綜合所有樣品得到的綜合所有樣品得到的UnigeneUnigene序列：序列： 原始組裝結(jié)果：原始組裝結(jié)果：All-UnigeneAll-Unigene共共6671666716 可確定方向的序列（可確定方向的序列（5-35-3）：）：All-Unigene.5-3.faAll-Unigene.5-3.fa 無法確定方向的序列：無

25、法確定方向的序列：All-Unigene.no_orientation.faAll-Unigene.no_orientation.fa Unigene10_All size 3699 gap 8 0.21% GCAAGGAGCACATGTGTGACTGATGAAGGTAACCT GAAGCAAGCTGCTCA GCTTAATATTTTTGAGACCTCGACTCAACCAACCAA GGAGGGTCCCTCAG ATCCTTCAGATAANNNNNNNNGTTACAATCTTGCTT GCAAATAGAATCTT 5. 5. 我們的結(jié)果如何我們的結(jié)果如何- (3)Unigene3)Unigen

26、e功能注釋功能注釋 其中預(yù)測只有一般功能的序列最多為其中預(yù)測只有一般功能的序列最多為4305條，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)及核結(jié)構(gòu)相關(guān)序列最少分別為條，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)及核結(jié)構(gòu)相關(guān)序列最少分別為4和和3條；其中與次生代謝產(chǎn)物的運(yùn)條；其中與次生代謝產(chǎn)物的運(yùn) 輸和代謝相關(guān)序列有較多為輸和代謝相關(guān)序列有較多為1051條，與各種氨基酸，糖類，脂類代謝的較多。條，與各種氨基酸，糖類，脂類代謝的較多。 5. 我們的結(jié)果如何？我們的結(jié)果如何？ - (4) Unigene的的GO分類分類 基因的分子功能基因的分子功能 6316 細(xì)胞組分相關(guān)細(xì)胞組分相關(guān) 27529 參與的生物過程參與的生物過程 21417 5101 5. 5. 我

27、們的結(jié)果如何？我們的結(jié)果如何？ - (5) 代謝通路分析代謝通路分析 Pathway All genes with pathway annotation (18989) Pathway ID Metabolic pathways 代謝途徑代謝途徑5012 (26.39%)ko01100 Biosynthesis of secondary metabolites次生代謝產(chǎn)次生代謝產(chǎn) 物合成途徑物合成途徑 2788 (14.68%)ko01110 Spliceosome 剪接體剪接體1384 (7.29%)ko03040 Plant-pathogen interaction 植物病原體交互作用植物病原體交互作用1128 (5.94%)ko04626 Protein processing in endoplasmic reticulum內(nèi)質(zhì)內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工 573 (3.02%)ko0