細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)宋曉萍PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)宋曉萍細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)宋曉萍 目錄目錄 基本原理基本原理 1 質(zhì)粒提取擴(kuò)增質(zhì)粒提取擴(kuò)增 2 3 4 常見問題及解決方案常見問題及解決方案 5 影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的因素影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的因素 轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染方法 第1頁/共36頁 基本原理基本原理 1 將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染 研究內(nèi)容：研究內(nèi)容：研究和控制真核細(xì)胞基因功能 應(yīng)應(yīng)用：用：基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物 學(xué)試驗(yàn) 第2頁/共36頁 常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù) 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 外源 DNA 既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性 DNA

2、比超螺旋 DNA 轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色體中概率很小，大約 1/104 轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素 B 磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后 24-72 小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果， 常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白， 半乳糖苷酶等來幫助檢測。

3、第3頁/共36頁 第4頁/共36頁 脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理基于電荷吸引原理，先形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，散布在細(xì)胞周圍，然后通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。 第5頁/共36頁 1. promega公司 Promega轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品適合于人HeLa，Hep G2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；倉鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆蟲S19等等細(xì)胞系的RNAi轉(zhuǎn)染。 2. Invitrogen公司 Lipofetamine2000，適合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各種常用細(xì)胞系的RNAi轉(zhuǎn)

4、染。 3. 轉(zhuǎn)染FAQs： 轉(zhuǎn)染試劑的選擇轉(zhuǎn)染試劑的選擇 脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)比懸浮細(xì)胞高出很多倍，所以，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率要明顯低于貼壁細(xì)胞。 懸浮細(xì)胞是用的電穿孔法。 第6頁/共36頁 質(zhì)粒提取擴(kuò)增質(zhì)粒提取擴(kuò)增 2 質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)的一種環(huán)狀的小分子DNA，是進(jìn)行DNA重組的常用載體。 將細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后從大腸桿菌中收獲大量質(zhì)粒的過程。 將質(zhì)粒 DNA 導(dǎo)入細(xì)菌的過程 1、質(zhì)粒的轉(zhuǎn) 化 感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞在 CaCl2低滲溶液中膨脹為球狀（感受態(tài)細(xì)菌的制備，略）。質(zhì)粒 DNA 與 CaCl2 形成抗 DNase 羥基 - 磷酸鈣復(fù)合物黏附于細(xì)菌表面，經(jīng) 42

5、短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收 DNA 復(fù)合物。在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，外源基因得到表達(dá)。 BL21(DE3)一般用于外源基因的原核表達(dá)， DH5a，TG1和HB2151一般用于重組質(zhì)粒的克隆和擴(kuò)增 TG1長得慢，菌落較小，轉(zhuǎn)化效率高，用于普通的克隆測序，BL21(DE3)長的快，菌落較大，轉(zhuǎn)化效率低點(diǎn)，主要用于原核表達(dá)。 第7頁/共36頁 感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞特點(diǎn)特點(diǎn)用途用途 TG1長得慢，菌落較小，轉(zhuǎn)化效率高，用于普通的克隆測序 DH5aE.coli DH5a在使用pUC系列質(zhì)粒載體 轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的半乳糖 苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。可用

6、于藍(lán) 白斑篩選鑒別重組菌株。 常用于分子克隆、質(zhì)粒 提取和蛋白質(zhì)表達(dá)。 BL21(DE3)該菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌 體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列） 的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于 噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染 色體上。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白。 長的快，菌落較大，轉(zhuǎn)化效率低點(diǎn)。 一般用于外源基因的原 核表達(dá) JM109該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行 DNA轉(zhuǎn)化或用M13 phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn) 染時(shí)，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多 肽和JM09編碼的LacZM15進(jìn)行互 補(bǔ)，從而顯示半乳糖苷酶活性， 由此很容易鑒別重組體菌株 分子克隆、質(zhì)粒提取和 蛋白質(zhì)表達(dá)。

7、第8頁/共36頁 I.細(xì)菌鋪板：加入抗生素（終濃度是50ug/ml-100ug/ml） II.挑選菌落：從LB培養(yǎng)基上挑選菌落備用 III.細(xì)菌培養(yǎng)：37攝氏度培養(yǎng)箱中以180rpm搖動(dòng)1214h，使大腸桿菌繁殖 IV.堿裂解抽提：采用細(xì)胞裂解的方式，從含目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌菌液中將質(zhì)粒提取出來 2、質(zhì)粒的提取擴(kuò)增 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化具體方法省略 NOTE: I.不同的感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率不同，選擇合適的E.coli II.1ng的cccDNA就可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞飽和，DNA量過多會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 III. 轉(zhuǎn)化時(shí)為提高轉(zhuǎn)化效率，質(zhì)粒加入E.coli培養(yǎng)1h后可離心棄上清后用剩余的菌液涂布。 第9頁

8、/共36頁 在質(zhì)粒提取過程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等的原因，可能使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂。所以，多數(shù) 質(zhì)粒粗提取物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒： 15,000bp 10,000bp 7,500bp 5,000bp ErbB2 ErbB2 ErbB2 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（超螺旋 ）： 質(zhì)粒的兩條鏈沒有斷裂； 開環(huán)DNA： 質(zhì)粒的一條鏈斷裂；松弛的環(huán)狀分子； 線形DNA： 質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；線性分子 第10頁/共36頁 Q1：原先測序鑒定沒有問題的細(xì)菌，：原先測序鑒定沒有問題的細(xì)菌，37搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常搖菌后發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒大小或序列出現(xiàn)異常? 這種情況出現(xiàn)的幾率較小，常出現(xiàn)在較大質(zhì)?；虮容^特

9、殊的序列中。 解決辦法： 1.降低培養(yǎng)溫度，在2025下培養(yǎng)，或室溫培養(yǎng)可明顯減少發(fā)生概率。 2.使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質(zhì)粒復(fù)制更加穩(wěn)定。 3.質(zhì)粒抽提有一個(gè)酶切不完全的原因就是溶液中的NaOH濃度過高造成的 常見問題及解決方案常見問題及解決方案 第11頁/共36頁 Q2：未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決：未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低，如何解決? 1. 大腸桿菌老化，細(xì)菌發(fā)生溶菌，可減少培養(yǎng)時(shí)間或者試試平板培養(yǎng)， 2. 質(zhì)?？截悢?shù)低，質(zhì)粒抽提過程很大程度上是受細(xì)菌生長情況決定的，剛活化的菌比負(fù)80保存菌種所培養(yǎng)出來的菌液狀態(tài)好，保存久的菌株可能會(huì)

10、造成質(zhì)粒濃度低，質(zhì)粒丟失等不明原因。 3. 菌體中無質(zhì)粒，質(zhì)粒丟失。每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查抗生素使用濃度是否正確。判斷生長的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養(yǎng)液，如果菌液呈漂絮狀，情況很好。如果呈泥水狀，即看不到絮狀，則可能提不出好的質(zhì)粒，或者沒有質(zhì)粒。 4.堿裂解不充分，菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高。 5.吸附柱過載： 第12頁/共36頁 6.質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí)) ：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。 7.乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。 8.洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液

11、會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。 9.洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60后使用，有利于提高洗脫效率。 10.洗脫體積太?。弘S著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。 11.洗脫時(shí)間過短：洗脫時(shí)間對回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置1min可達(dá)到較好的效果。 第13頁/共36頁 3 轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染方法 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染1 1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染2 2 3 3 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染 第14頁

12、/共36頁 細(xì)胞培養(yǎng)用品細(xì)胞培養(yǎng)用品表面積（表面積（mm2/孔）孔）細(xì)胞密度細(xì)胞密度培養(yǎng)基（培養(yǎng)基（l/孔）孔） 96孔板501.5104-5.0104100l 48孔板1003.0104-1.0105200l 24孔板2008.0104-2.0105500l 12孔板4011.6105-4.01051.0ml 6孔板9623.0105-8.01052.0ml 35mm9623.0105-8.01052.0ml 60mm28271.0106-2.51066.0ml 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)用品細(xì)胞培養(yǎng)用品siRNA/DNA培養(yǎng)基終體積培養(yǎng)基終體積Lipo2000（siRNA/DN

13、A） 96孔板5pmol/0.2g100l0.25l/0.5l 24孔板20pmol/0.8g500l1l/2l 12孔板40pmol/1.6g1.0ml2l/4l 6孔板100pmol/4.0g2.0ml5l/10l 35mm100pmol/4.0g2.0ml5l/10l 60mm600pmol/8.0g5.0ml10l/20l 推薦的推薦的DNA:Lipo2000=1:0.5-1:5（ug：ul） siRNA:Lipo2000=1:0.01-1:0.1（pmol：ul） 第15頁/共36頁 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染1 1 1.轉(zhuǎn)染前一天鋪板：5.0-8.0104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5ml正常

14、培養(yǎng)基。 2.24h后的細(xì)胞融合達(dá)到70%-90%的密度。 3.轉(zhuǎn)染： （1）50ul無血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）+20pmol siRNA（或0.8ugDNA），柔和混勻，室溫孵育5min （2） 50ul無血清培養(yǎng)基+1ul lipo2000（DNA+2ul lipo2000）柔和混勻，室溫孵育5min。 （3）將DNA加入Lipo2000中，輕柔混勻，室溫孵育20min 4.將24孔板中的正常培養(yǎng)基換為無血清的培養(yǎng)基（Opti-MEM）1.9ml。 5.將100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）復(fù)合物混勻逐滴加入孔中，輕輕搖勻。 6.4-6h后，換培養(yǎng)基（全

15、培），48-72小時(shí)監(jiān)測轉(zhuǎn)染水平。 7. 轉(zhuǎn)染效率： 綠色熒光蛋白看熒光 mRNA水平，48h后收樣品，做PCR 蛋白水平，72h后收蛋白，做WB。 第16頁/共36頁 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 2 2 1.轉(zhuǎn)染前一天鋪板：5.0-8.0104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5ml正常培養(yǎng)基。 2.24h后的細(xì)胞融合達(dá)到70%-90%的密度。 3.轉(zhuǎn)染： （1）50ul無血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）+20pmol siRNA（或0.8ugDNA），柔和混勻，室溫孵育5min （2） 50ul無血清培養(yǎng)基+1ul lipo2000（DNA+2ul lipo2000）柔和混勻，室溫孵育5min。 （3）將DN

16、A加入Lipo2000中，輕柔混勻，室溫孵育20min 4.將24孔板中的正常培養(yǎng)基換為無血清的培養(yǎng)基（Opti-MEM）1.9ml。 5.將100ulsiRNA/Lipo2000（DNA/Lipo2000）復(fù)合物混勻逐滴加入孔中，輕輕搖勻。 6.4-6h后，換培養(yǎng)基（全培），48-72小時(shí)監(jiān)測轉(zhuǎn)染水平。 7. 加相應(yīng)的抗生素篩選，一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素。挑出單后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2 第17頁/共36頁 1確定抗生素作用的最佳濃度： 不同的 細(xì)胞株 對各種抗生素有不同的敏感性,因此在篩選前要做預(yù)試驗(yàn),確定抗生素對所選擇細(xì)胞的最低作用濃度. 提前 24 小時(shí)在 96

17、孔板或 24 孔板中接種細(xì)胞 8 孔,接種量以第二天長成 25%單層為宜,置 CO2 孵箱中 37培養(yǎng)過夜. 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基, 抗生素濃度按梯度遞增0,（50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000 g/ml）. 培養(yǎng) 10-14 天以絕大部分（90%） 細(xì)胞死亡 濃度為準(zhǔn), 篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)可比該濃度適當(dāng)提高一個(gè)級別,維持時(shí)使用篩選濃度的一半. 2 轉(zhuǎn)染 48-72 小時(shí)后按 1: 10 的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在 6 孔板中傳代,換為含預(yù)試驗(yàn)中 確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基.在6 孔板內(nèi)可見單個(gè)細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)可見單個(gè) 細(xì)胞分裂 繁殖形成單個(gè)抗性集落. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞

18、的穩(wěn)定篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選 第18頁/共36頁 3. 挑選單克隆. 濾紙片法：用消毒的 5x5mm 濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在 單細(xì)胞 集落上 10-15 秒,取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于 24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng). 細(xì)胞在 24 孔板中長滿后轉(zhuǎn)入 25cm2 培養(yǎng)瓶中,長滿后再轉(zhuǎn)入 75cm2 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng). 有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的 10 倍稀釋（10-2-10-10）,將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到 96孔板中培養(yǎng),7- 10天后,選擇單個(gè)克隆生長的孔再一次進(jìn)行克隆. 4. ELISA或 Westernblot檢測單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的 表達(dá)水平存在差異因此

19、可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達(dá)量最高的克隆傳代并保種. 第19頁/共36頁 3 3 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染 一、概述一、概述 反轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，但有反轉(zhuǎn)錄酶，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下首先將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，再在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白酶作用下擴(kuò)增的一類病毒。它有三個(gè)基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白。 二、二、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點(diǎn)： (1) 轉(zhuǎn)染范圍廣，可以感染各種細(xì)胞類型，如淋巴細(xì)胞或肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等; (2) 轉(zhuǎn)入的外源基因可完全整合 (3) 對細(xì)胞感染率高，基因轉(zhuǎn)移

20、率在10%-100% (4) 感染細(xì)胞不產(chǎn)生病變，可建立細(xì)胞系長期持續(xù)表達(dá)外源基因 逆轉(zhuǎn)錄病毒通常分兩種：簡單的（有時(shí)又稱為致癌病毒或-逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒，如鼠白血病病毒）和復(fù)雜的（如慢病毒慢病毒）。這些亞型間主要的差異在于復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒存在一些附屬基因和調(diào)控基因，而簡單的則沒有。 第20頁/共36頁 當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補(bǔ)作用共同完成病毒裝配,該病毒顆?？筛腥酒渌拗骷?xì)胞，此時(shí)目的基因進(jìn)入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生目的蛋白。宿主細(xì)胞不能像包裝細(xì)胞那樣為缺失結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白，因而在宿主細(xì)胞內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生新的

21、感染性病毒顆粒,保證了該載體在生物制品領(lǐng)域的生物安全性問題。 三、三、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝原理逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝原理 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)共由兩部分組成： 缺陷病毒本身 包裝細(xì)胞系提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結(jié)構(gòu)蛋白 去除了正常的蛋白編碼序列而保留了復(fù)制和包裝信號(hào)，通過分子克隆技術(shù)將目的基因插入此載體上 第21頁/共36頁 第22頁/共36頁 轉(zhuǎn)染前一天，取對數(shù)生長的HEK293T細(xì)胞5104個(gè)/孔種于24孔板中，500lDMEM+10%FBS培養(yǎng)基/孔，設(shè)立空白組及p-BABE-EGFE-野生型及突變型質(zhì)粒組，置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長至80 90%融合時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染

22、。 取0.5gp-BABE-EGFR野生型及突變型質(zhì)粒+0.45gp-BABE-gag+0.05g p-BABE-VSV質(zhì)粒分別稀釋于50l無雙抗無血清的DMEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻，室溫放置5分鐘。 取2.5L LipofectamineTM 2000稀釋于50l無雙抗無血清DMEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻，室溫下靜置5 分鐘。 將轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA 稀釋液輕柔混合均勻，室溫靜置20分鐘。 用無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基洗細(xì)胞2-3次，并換上400l新鮮的無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基。 將質(zhì)粒和LipofectamineTM2000混合物100l逐滴加入孔中，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板，使混合物均勻覆

23、蓋細(xì)胞。 46h后（可鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)確定轉(zhuǎn)染時(shí)間），去掉轉(zhuǎn)染試劑，用DMEM完全培養(yǎng)基洗兩遍，加入500l DMEM完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞板置于37 、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)48h后，1000rpm，4，離心5min，收集48h病毒上清，并換上500L新鮮的10%FBS DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，1000rpm，4，離心5min，收集72h病毒，收集的病毒可以直接用于感染，也可凍于-80用于后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)。 1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝 第23頁/共36頁 （1）種板：在感染前1218h，取對數(shù)生長的NIH 3T3 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以5104/孔種于24孔板中

24、，置于37 、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 （2）第一次感染：取0.5ml 48h病毒上清+0.5ml 10%FBS DMEM培養(yǎng)基+4g/ml polybrene，加入NIH 3T3細(xì)胞中，置于37 、5% CO2 培養(yǎng)箱中感染16h。 （3）第二次感染：去除上述培養(yǎng)基，并向NIH 3T3 細(xì)胞中加入0.5ml 72h病毒上清+0.5ml 10%DMEM培養(yǎng)基+4g/ml polybrene ，置于37 、5% CO2 培養(yǎng)箱進(jìn)行第二次感染，感染24h后，加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選。 2、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH3T3細(xì)胞細(xì)胞 第二次感染后，加入8g/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選，每3天換一液

25、，待長出陽性克隆，抗生素減半維持，繼續(xù)篩選14天，挑取單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存細(xì)胞。 3、篩選穩(wěn)定表達(dá)、篩選穩(wěn)定表達(dá)p-BABE-EGFR野生型及突變型質(zhì)粒的野生型及突變型質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞株細(xì)胞株 第24頁/共36頁 逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒可能會(huì)整合到人的細(xì)胞中?？赡軙?huì)整合到人的細(xì)胞中。 所以進(jìn)行病毒操作時(shí)必須在生物安全柜所以進(jìn)行病毒操作時(shí)必須在生物安全柜 中進(jìn)行，帶口罩，廢液密閉回收用中進(jìn)行，帶口罩，廢液密閉回收用84滅滅 活，槍頭、離心管等也要滅活。活，槍頭、離心管等也要滅活。 第25頁/共36頁 血清血清 血清會(huì)影響復(fù)合物的形成，降低轉(zhuǎn)染效率 陽離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時(shí)會(huì)

26、有所不同， 因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進(jìn)行優(yōu) 化。大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健 康。對于對血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用OPTI- MEM培養(yǎng)基，一種營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn) 染培養(yǎng)基中使用血清。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì) 胞，建議使用LIPOFECTAMINE 2000。 1 4 影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的因素影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的因素 第26頁/共36頁 培養(yǎng)基中的抗生素培養(yǎng)基中的抗生素 抗生素，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加 物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體 試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降 低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)

27、致轉(zhuǎn)染效率低。 2 第27頁/共36頁 3細(xì)胞維護(hù)和培養(yǎng)的演變細(xì)胞維護(hù)和培養(yǎng)的演變 一般低的細(xì)胞代數(shù)（50）能確?；蛐筒蛔?。轉(zhuǎn)染前 細(xì)胞最好經(jīng)過1-2次傳代，以保證細(xì)胞生長旺盛，容易轉(zhuǎn) 染。注意，貼壁細(xì)胞生長到幾乎匯片時(shí)就要趕快進(jìn)行下一 次傳代，千萬不要使細(xì)胞保持融合超過24小時(shí)，因?yàn)橐?旦長滿了，細(xì)胞們就“故步自封”不思轉(zhuǎn)染啦?；盍Τ渑娴?年輕細(xì)胞更容易接受外來的新鮮事物。 第28頁/共36頁 4細(xì)胞鋪板密度細(xì)胞鋪板密度 一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密 度為2106-4106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí) 細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。 鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活

28、性和細(xì)胞產(chǎn)量。 5 DNA 質(zhì)量質(zhì)量 DNA 質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。 一般的轉(zhuǎn)染技 術(shù) （如脂質(zhì)體等） 基于電荷吸引原理，如果 DNA 不純， 如帶少量的鹽離子， 蛋白， 代謝物污染都 會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。 第29頁/共36頁 常見問題及解決方案常見問題及解決方案 5 Q1：轉(zhuǎn)染效率低：轉(zhuǎn)染效率低 （1）沒有使用優(yōu)化的陽離子脂質(zhì)體試劑。選擇針對您的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)染效率可能最高的陽離子脂質(zhì)體試劑。 （2）沒有使用優(yōu)化條件。 優(yōu)化陽離子脂質(zhì)體試劑和DNA的量。 （3）DNA-陽離子脂質(zhì)體試劑復(fù)合物在存在血清條件下形成。 在復(fù)合體形成時(shí)不要使用血清。 （4）存在抑制劑。 不要使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。 （5）不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。 細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染時(shí)融合度為70%90%。 第30頁/共36頁 （7）陽離子脂質(zhì)體試劑