DNA聚合酶的定義

1、如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!DNA聚合酶的定義 發(fā)布時間： 2010-6-3 瀏覽次數(shù)： 775 次DNA聚合酶的定義DNA聚合酶（DNA polymerase）是細胞復(fù)制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5端點開始復(fù)制到3端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性。 真核細胞有5種DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶（定位于胞核，參與復(fù)制引發(fā)具53外切酶活性），（定位于核內(nèi)，參與修復(fù)，具53外切酶活性），（定位于線粒體，參與線粒體復(fù)制具53和35外切活性），（定位核，參與復(fù)制，具有35和

2、53外切活性），（定位于核，參與損傷修復(fù)，具有35和53外切活性）。原核細胞有3種DNA聚合酶，都與DNA鏈的延長有關(guān)。DNA聚合酶I是單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA 的延長；DNA聚合酶II則與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關(guān)；DNA聚合酶III在細胞中存在的數(shù)目不多，是促進DNA鏈延長的主要酶。1 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)在50年代的中期，A. Kornberg和他的同事們就想到DNA的復(fù)制必然是一種酶的催化作用，于是決心分離出這種酶并研究其結(jié)構(gòu)和作用機制。為了達到這個目的，他們分離的蛋白，然后加到體外合成系統(tǒng)中即同位素標(biāo)記的dNTP、Mg2及模板

3、DNA，經(jīng)過大量的工作，于1956年終于發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶（DNA polymerase ，DNA pol ）原來稱為Kornberg酶。以后又相續(xù)發(fā)現(xiàn)了DNA pol 和DNA pol 。開始人們以為DNA pol I是細菌中DNA復(fù)制主要的酶類，后來發(fā)現(xiàn)DNA pol 的突變株照樣可以復(fù)制，才清楚它并不是主角?，F(xiàn)在已經(jīng)知道在DNA復(fù)制中起主導(dǎo)作用的是DNA pol ，至于pol 的功能現(xiàn)在還不十分清楚。DNA聚合酶的共同特點是：2 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚

4、合DNA外還有其它功能。所有原核和真核的DNA聚合酶都具有相同的合成活性，都可以在3OH上加核苷酸使鏈延伸，其速率為1000 Nt/min。加什么核苷酸是根據(jù)和模板鏈上的堿基互補的原則而定的。E.coli的DNA pol 涉及DNA損傷修復(fù)，在半保留復(fù)制中起輔助的作用。DNA pol 在修復(fù)損傷中也是有重要的作用。DNA pol 是一種多亞基的蛋白。在DNA新鏈的從頭合成（de novo）中起復(fù)制酶的作用。DNA聚合酶的共性此酶最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，以后陸續(xù)在其他原核生物及微生物中找到。這類酶的共同性質(zhì)是:1以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA;2需要模板和引物的存在;3不能起始

5、合成新的DNA鏈;4催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3-OH末端;5催化DNA合成的方向是53。下面首先介紹大腸桿菌的DNA聚合酶，然后簡略說明一下其他原核生物的DNA聚合酶和真核生物DNA聚合酶。功能3 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!1聚合作用:在引物RNA-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐個將核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結(jié)合位點后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進3-OH與5-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯誤的核苷酸進入結(jié)合位點，則不能與模

6、板配對，無法改變酶的構(gòu)象而被3-5外切酶活性位點所識別并切除之。235外切酶活性校對作用:這種酶活性的主要功能是從35方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。當(dāng)反應(yīng)體系中沒有反應(yīng)底物dNTP時，由于沒有聚合作用而出現(xiàn)暫時的游離現(xiàn)象，從而被35外切酶活性所降解。如果提高反應(yīng)體系的溫度可以促進這種作用，這表明溫度升高使DNA生長鏈3末端與模板發(fā)生分離的機會更多，因而降解作用加強。當(dāng)向反應(yīng)體系加入dNTP，而且只加放與模板互補的上述核苷酸才會使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進行DNA的合成。由此推論，35外切酶活性的主要功能是校對作用，當(dāng)加入的核苷酸與模板不互補而游離時則被35外切酶切除，以

7、便重新在這個位置上聚合對應(yīng)的核苷酸。在某些T4噬菌體突變株中DNA復(fù)制的真實性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的35外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的35外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復(fù)制真實性好，變異率低?？梢?，35外切酶活性對DNA復(fù)制真實性的維持是十分重要的。5 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!353外切酶活性切除修復(fù)作用:53外切酶活性就是從53方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對部份(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是53。每次能切除1

8、0個核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激53外切酶活力達10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對岡崎片段5末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。4焦磷酸解作用:DNApol的這種活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無機焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi(dNMP)n-x+X(dNPPP)DNA5焦磷酸交換作用:催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應(yīng)。反應(yīng)式為32P32Pi+dNPPPdNP32P32P+PPiDNA最后兩種作用，都要求有較高濃度的PP

9、i，因此，在體內(nèi)由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。DNApol的DNA聚合酶活性和53外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應(yīng)叫缺口平移(Nick translation)。當(dāng)雙鏈DNA上某個磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時，DNApoI能從切口開始合成新的NDA鏈，同時切除原來的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣?32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標(biāo)記的DNA分子，可以用作探針進行分子雜交實驗。6 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!盡管DNApol是第

10、一個被鑒定的DNA聚合酶，但它不是在腸桿菌中DNA復(fù)制的主要聚合酶。主要證據(jù)如下:1純化的DNApol催化dNTP摻入的速率為667堿基/分，而體內(nèi)DNA合成速率要比此高二倍數(shù)量級;2大腸桿菌的一個突變株中，此酶的活力正常，但染色體DNA復(fù)制不正常;3而在另一些突變株中，DNApol的活力中只是野生型的1%，但是DNA復(fù)制卻正常，而且此突變株增加了對紫外線、烷化劑等突變因素的敏感性。這表明該酶與DNA復(fù)制關(guān)系不大，而在DNA修復(fù)中起著重要的作用。大腸桿菌DNA聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶(DNApolymerase，DNApol)這是1956年由ArthurKornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚

11、合酶，又稱Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點。6 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!(1)理化性質(zhì)：純化的DNApol由一條多肽鏈組成，約含1000個氨基酸殘基，MW（分子量）為109KD。分子含有一個二硫鍵和一個-SH基。通過二個酶分子上的-SH基與Hg2+結(jié)合產(chǎn)生二聚體，仍有活性。每個酶分子中含有一個Zn2+，在DNA聚合反應(yīng)起著很重要的作用。每個大腸桿菌細胞中含有約400個分子，每個分子每分鐘在37下能催化667個核苷酸摻入正在生長的DNA鏈。經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶處理后，酶分子分裂成兩個片段，大片段分子量為76KD，通常稱為Klenow片段

12、，小片段的分子量為34KD。此酶的模板專一性和底物專一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，也可以用核苷酸為底物。在無模板和引物時還可以從頭合成同聚物或異聚物。DNAPol在空間結(jié)構(gòu)上近似球體，直徑約65A。在酶的縱軸上有一個約20A的深溝(cleft)，帶有正電荷，這是該酶的活性中心位置，在此位置上至少有6個結(jié)合位點:1模板DNA結(jié)合位點;2DNA生長鏈或引物結(jié)合位點;3引物末端結(jié)合位點，用以專一引物或DNA生長鏈的3-OH;4脫氧核苷三磷酸結(jié)合位點;553外切酶活性位點，用以結(jié)合生長鏈前方的5-端脫氧核苷酸并切除之;635外切酶活性位點，用以結(jié)合和切除生長鏈上未配對的3-端核苷酸。7

13、 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!2、大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)：DNA聚合酶缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApol不是DNA復(fù)制的主要聚合酶。人們開始尋找另外的DNA聚合酶，并于1970年發(fā)現(xiàn)了DNApol。此酶MW為120KD，每個細胞內(nèi)約有100個酶分子，但活性只有DNApol的5%。該酶的催化特性如下：(1)聚合作用:該酶催化DNA的聚合，但是對模板有特殊的要求。該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙(gap)的單鏈DNA部份，而且該單鏈空隙部份不長于100個核苷酸。對于較長的單鏈DNA模板區(qū)該酶的聚合活性很低。但是用單鏈結(jié)合蛋白(SSBP)可以提高其聚合

14、速率，可達原來的50-100倍?；钚?，但無53外切酶活性。 (3)該酶對作用底物的選擇性較強，一般只能將2-脫氧核苷酸摻入到DNA鏈中。(4)該酶不是復(fù)制的主要聚合酶，因為此酶缺陷的大腸桿菌突變株的DNA復(fù)制都正常?？赡茉贒NA的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。3、大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)：DNA pol 全酶由多種亞基組成(見下表)，而且容易分解。大腸桿菌每個細胞中只有10-20個酶分子，因此不易獲得純品，為研究該酶的各種性質(zhì)和功能帶來了許多困難。直到不久前，才對其性質(zhì)和功能有所了解，但每個亞基的具體作用扔不十分清楚。盡管該酶在細胞內(nèi)存在的數(shù)量較少，但催化脫氧核苷酸摻入DNA鏈的速

15、率分別是DNA聚合酶的15倍和30倍。該酶對模板的要求與DNA聚合酶相同，最適模板也是鏈DNA中間有空隙的單鏈DNA，單鏈結(jié)合蛋白可以提高該酶催化單鏈DNA模板的DNA聚合作用。DNApol也有35和53外切酶活性，但是35外切酶活性的最適底物是單鏈?zhǔn)荄NA，只產(chǎn)生5-單核苷酸，不會產(chǎn)生二核苷酸，即每次只能從3端開始切除一個核苷酸。53外切酶活性也要求有單鏈DNA為起始作用底物，但一旦開始后，便可作用于雙鏈區(qū)。DNA聚合酶是細胞內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶，缺乏該酶的溫度突變株在限制溫度(non permissive temperature)內(nèi)是不能生長的，此種突變株的裂解液也不能合DNA，但加入D

16、NA聚合酶則可以恢復(fù)其合成DNA的能力。9 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!DNA聚合酶的組成亞基 分子量(103) 其它名稱a 140 dnaE蛋白，polC蛋白 25 10 83 52 dnaZ蛋白 32 dnaX蛋白 40 dnaN蛋白，copol大腸桿菌三種DNA聚合酶的特性9 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!功能 pol pol pol聚合作用53 + + +外切酶活性35 + + +外切酶活性53 + - +焦磷酸解和焦磷酸交換作用 + - +模板及引物的選擇完整的DNA雙鏈 - - -帶引物的長單鏈DNA + - -帶缺口的雙鏈DNA + -

17、-雙鏈而有間障的DNA + + +一般性質(zhì)分子量 1 09KD 120KD 140KD每細胞中的分子量 400 17-100 10-20結(jié)構(gòu)基因 polA polB polCT4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶(T4-DNApol)：近年來在枯草桿菌，鼠傷寒沙門氏桿菌等細胞及噬菌體T4、T5、T7中分離到NDA聚合酶，這里只介紹T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶相似，也是一條多肽鏈，分子量亦相近，但氨基酸組成不同，它至少含有15個半胱氨酸殘基。但是，它在作用上與大腸桿菌DNApol不同;1它無53外切酶活性;2它需要一條有引物的單鏈DNA作模板。在有缺口的雙鏈DNA作模板

18、時，需要有基因32蛋白的輔助(基因32蛋白在T4DNA復(fù)制中的作用和大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白的作用相似，基因32蛋白在復(fù)制叉處和單鏈DNA結(jié)合后可以促進雙鏈的進一步打開，并保持其單鏈狀態(tài)有利于新生鏈的合成);它利用單鏈DNA為模板進，可同時利用它作為引物，即此單鏈DNA的3端能環(huán)繞其本身的某一順序形成氫鍵配對，3端的未雜交部分即被T4DNA聚合酶的35外切酶活性切去，然后在其作用下從3-OH端開始聚合，合成該模板DNA的互補鏈，再以互補鏈為模板合成原來的單鏈DNA。11 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶：真核生物中也具有幾種DNA聚合酶

19、，但這些聚合酶都沒有35或53外切酶活性。其聚合反應(yīng)機制與原核生物的聚合一樣。主要的酶(占總量的80-90%)是DNA聚合酶，分子量為300KD，含有4個或5個亞基，主要負責(zé)染色體DNA的復(fù)制。DNA聚合酶，分子量為45KD，僅含有一條鏈，主要作用是修復(fù)核內(nèi)DNA。第三種聚合酶，分子量為140KD，存在于線粒體內(nèi)，負責(zé)催化線粒體DNA的復(fù)制。最近從兔的骨髓細胞質(zhì)中分離到一種新的DNA聚合酶，這種酶與上述真核生物的DNA聚合酶不同，而與原核生物的聚合酶類似，具有35核酸外切酶活性，稱為DNA聚合酶。另外，從酵母、原蟲等低真核生物中分離到一些DNA聚合酶。一般來說，這些低等生物都沒有低分子量的DN

20、A聚合酶，而且與原核生物的DNA聚合酶相似，有35外切酶活性。11 / 18如果您需要使用本文檔，請點擊下載按鈕下載!實驗室常用的耐熱DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶多應(yīng)用在PCR技術(shù)中。各種耐熱DNA聚合酶均具有5-3聚合酶活性，但不一定具有3-5和5-3的外切酶活性。3-5外切酶活性可以消除錯配，切平末端；5-3外切酶活性可以消除合成障礙。由于上述這些不同，可以將耐熱DNA聚合酶分為三類：一、普通耐熱DNA聚合酶Taq DNA 聚合酶由一種水生棲熱菌yT1株分離提取出，是發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合酶中活性最高的一種，達200,000單位/mg。具有5-3外切酶活性，但不具有3-5外切酶活性，因而在合成中對某些單核苷酸錯配沒有校正功能。TaqDNA聚合酶還要具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈3加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3突出的單A核苷酸尾；另一方面，在僅有dTTP存在時，它可將平端的質(zhì)粒的3端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3端突出的單T核苷酸尾。應(yīng)用這一特性，可實現(xiàn)PCR產(chǎn)物的T-A克隆法。Tt