1295.龍須菜活性多糖提取、分離純化、結(jié)構(gòu)及其活性的研究

1、 學(xué)位論文題 目：龍須菜活性多糖提取、分離純化、結(jié)構(gòu)及其活性的研究英文題目：isolation and characterization of soluble activity polysaccharide from the red seaweed gracilaria lemaneiformis (gracilaria, rhodophyta)專 業(yè)： 食品科學(xué)研究方向：食品生物技術(shù)姓 名： 指導(dǎo)教師： 教授二oo八年五月二十日目 錄摘要 i abstractiii 第一章 引言11.1龍須菜的研究概況21.1.1龍須菜概況11.1.2龍須菜的營(yíng)養(yǎng)成分11.1.3龍須菜的藥理活性21.2海藻

2、多糖的生物活性研究21.2.1抗腫瘤作用21.2.2抗心血管疾病作用31.2.3抗病毒作用41.2.4抗氧化作用51.2.5 抗輻射作用51.2.6抗突變作用61.2.7 護(hù)膚潤(rùn)膚功能61.2.8增強(qiáng)免疫力作用61.3 海藻多糖的構(gòu)效關(guān)系71.3.1 多糖的組成和糖苷鍵的關(guān)系71.3.2 多糖中的硫酸根離子與多糖功能的關(guān)系81.3.3多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)與多糖功能的關(guān)系81.4海藻多糖應(yīng)用前景和研究趨勢(shì)91.4.1 海藻多糖的應(yīng)用前景91.4.2 海藻多糖的研究趨勢(shì)91.5本研究的內(nèi)容和預(yù)期目標(biāo)101.5.1研究?jī)?nèi)容101.5.2預(yù)期目標(biāo)10第二章 分離龍須菜活性多糖的方法研究112.1 材料與方法

3、112.1.1試驗(yàn)材料和前處理112.1.2試劑和儀器112.1.3活性多糖的提取122.1.4 實(shí)驗(yàn)方法122.1.4.1 粗多糖溶出率測(cè)定122.1.4.2多糖含量測(cè)定132.1.4.3 蛋白含量測(cè)定132.1.4.4 硫酸基含量測(cè)定142.1.4.5 3,6-內(nèi)醚半乳糖和半乳糖含量測(cè)定152.1.4.6 高效陰離子色譜法測(cè)定單糖組成162.1.4.7 淋巴細(xì)胞免疫試驗(yàn)172.1.4.8 抗病毒試驗(yàn)172.1.5 數(shù)據(jù)處理182.2 結(jié)果與分析182.2.1 龍須菜粗多糖膠體和非膠體部分的溶出率、多糖含量、蛋白含量和免疫活性比較182.2.2不同提取水溫對(duì)龍須菜非膠體粗多糖的溶出率、蛋白含

4、量和多糖含量的影響182.2.3不同提取水溫對(duì)龍須菜非膠體粗多糖的單糖組成和比例的影響202.2.4不同提取水溫對(duì)龍須菜非膠體粗多糖中的硫酸基、3,6-內(nèi)醚半乳糖和半乳糖含量的影響212.2.5不同提取水溫對(duì)龍須菜非膠體粗多糖免疫活性和抗病毒活性的影響222.3 討論242.4 小結(jié)25第三章 龍須菜多糖提取工藝優(yōu)化及其活性的研究263.1材料與方法263.1.1 材料和前處理263.1.2 試劑和儀器263.1.3 活性多糖的提取263.1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)273.1.5試驗(yàn)方法273.1.6數(shù)據(jù)處理273.2 結(jié)果與分析273.2.1龍須菜非膠體多糖的提取工藝優(yōu)化273.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3

5、03.3 討論303.4 小結(jié)30第四章 龍須菜活性多糖的純化及其活性研究314.1 材料與方法314.1.1試驗(yàn)材料和前處理314.1.2 試劑和儀器314.1.3活性多糖的提取314.1.4非膠體粗多糖（ngf）的離子柱層析純化324.1.5多糖的純度鑒定324.1.6試驗(yàn)方法324.1.7 數(shù)據(jù)處理324.2 結(jié)果與分析324.2.1龍須菜粗多糖的分離純化334.2.1.1 陰離子交換柱層析334.2.1.2 ngfw和ngfs的得率、多糖和蛋白含量比較334.2.1.3 ngfw和ngfs的免疫活性和抗病毒能力比較344.2.1.4 ngfw和ngfs的單糖組成和比例344.2.1.5

6、 ngfw和ngfs硫酸基、3,6-內(nèi)醚半乳糖和半乳糖含量比較354.2.2 ngfs純度鑒定354.2.2.1 凝膠柱層析鑒定364.3 討論364.4 小結(jié)37第五章 龍須菜活性均一多糖結(jié)構(gòu)解析及其構(gòu)效關(guān)系的研究385.1 材料和方法385.1.1 材料385.1.2試劑和儀器385.1.3 試驗(yàn)方法385.1.3.1 3,6-內(nèi)醚半乳糖和半乳糖含量測(cè)定385.1.3.2 高效陰離子色譜法測(cè)定單糖組成395.1.3.3 紅外光譜（ir）分析395.1.3.4 核磁共振（nmr）分析395.2 結(jié)果與分析395.2.1 ngfs的單糖組成405.2.2 ngfs的紅外譜（ir）分析405.2

7、.3 ngfs的核磁共振譜（nmr）分析415.3 討論435.4 小結(jié)44全文討論45全文總結(jié)48本論文創(chuàng)新點(diǎn)49不足與展望49參考文獻(xiàn)50附 錄 58附錄一 名詞縮寫58附錄二 相關(guān)實(shí)驗(yàn)圖譜60致謝 72攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄73龍須菜活性多糖提取、分離純化、結(jié)構(gòu)及其活性的研究摘 要本文首次以免疫活性為篩選指標(biāo)、用凍溶除膠法分離活性多糖，運(yùn)用化學(xué)和色譜雙重分析方法系統(tǒng)深入地研究了龍須菜（gracilaria lemaneiformis）活性多糖的提取優(yōu)化、分離純化以及粗多糖和均一多糖的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)和活性。研究結(jié)果表明：1、通過凍溶法得到龍須菜膠體多糖(ngf)和非膠體多糖(sgf

8、)，其中sgf的溶出率和多糖含量均顯著高于ngf,但ngf的免疫活性極顯著高于sgf(p0.01)；2、不同提取水溫對(duì)龍須菜非膠體粗多糖的得率影響顯著(n=24, p0.01), 50水溫提取時(shí), 龍須菜非膠體粗多糖的得率最高9.110.31%, 蛋白含量最低僅為4.380.13%, 當(dāng)提取水溫超過60時(shí), 非膠體粗多糖的得率顯著下降;龍須菜非膠體粗多糖均表現(xiàn)出顯著的體外免疫活性, 其中50提取水溫組的活性顯著高于其它各溫度組,各組沒有表現(xiàn)出抗hsv-型和型病毒活性; 各組非膠體粗多糖的3,6內(nèi)醚半乳糖含量在15-20%之間, 而半乳糖的含量則在30-40%之間，其中內(nèi)醚半乳糖和半乳糖之和占已

9、知總糖的90以上,50提取水溫組硫酸基含量略高于其它組。3、對(duì)50水溫提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)對(duì)溶出率有著較大的影響,提取3次得率最高為13.63，提取1次僅為7.63， 但提取次數(shù)、料水比和提取時(shí)間對(duì)非膠體粗多糖的多糖含量、蛋白含量、免疫活性均無顯著影響,通過正交實(shí)驗(yàn)和結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)能耗因素,確定最佳提取工藝為: 提取水溫為50 ， 料水比為1:40(質(zhì)量比), 提取2次, 每次浸提3小時(shí)。4、用離子色譜法對(duì)ngf進(jìn)行分離得到鹽相（ngfs）和水相（ngfw）, ngfs的得率、3,6內(nèi)醚半乳糖和半乳糖含量分別為：51.104.10、27.830.23和62.101.88顯著高于水相的

10、0.600.13、17.980.23和29.310.34 (p 0.01), 水相的多糖種類、多糖含量、蛋白含量和免疫活性要高于鹽相; 從得率和純度兩方面考慮選擇ngfs繼續(xù)研究。5、ngfs由50.3的-d-半乳糖，40.5的3,6-內(nèi)醚-l-半乳糖和9.2的-l-半乳糖-6-硫酸基組成，硫酸基的含量為10.32。l/d的比率為1.01（-d-半乳糖和3,6-內(nèi)醚-l-半乳糖-l-半乳糖-6-硫酸基），和瓊脂糖的比率接近。結(jié)構(gòu)為：4-3,6-內(nèi)醚-l-半乳糖(13)-d-半乳糖 1片斷，-l-半乳糖的c-6位可能被硫酸基取代。關(guān)鍵詞：龍須菜、多糖、凍融、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、生物活性isola

11、tion and characterization of soluble activity polysaccharide from the red seaweed gracilaria lemaneiformis (gracilaria, rhodophyta)abstractred seaweed gracilaria lemaneiformis is a very important aquaculture species in china, japan and korea. the present research is the first one to use immune activ

12、ity as a powerful criteria to optimize extraction process. by the freeze-thaw process to remove soft-gelling fraction(sgf), the crude polysaccharide of non-gelling fraction(ngf) was separated and purified, then their chemical compositions, structures and bioactivities were evaluated by the chemical

13、methods, infrared(ft ir) and nuclear magnetic resonance (nmr) spectroscopy and bioassays. the results are as the following:1. by the freeze-thaw process, the water-extracts were separated into soft-gelling fraction(sgf) and non-gelling fraction(ngf). the extraction rate and polysaccharide content of

14、 sgf were significantly higher than those of ngf from g. lemaneiformis while the ngf had higher immune activity than the sgf. 2. as the water-extracting temperature had a significant effect on extraction rate (n=24, p0.01), the significantly highest extraction rate could be found on the treatment wi

15、th the water-extracting temperature of 50 . it is a evidence that the water extract of ngf from 50 treatment had a highest polysaccharide content (9.11%) but with lowest protein level (4.38%). when the water-extracting temperature exceed 50 , the decreasing trend could be found on the extraction rat

16、e. the crude polysaccharide of ngf from all treatments had a significantly immune activity, but no bioactivity could be found on anti-virus to hsv-and hsv-. for all treatments, although the crude extract of ngf from 50 had a slightly high sulfate ester content than that from the other treatments, no

17、 dramatic difference could be found on 3,6- anhydro-galactose and galactose. the content of 3,6- anhydro-galactose was between 15-20% of dry crude polysaccharide of ngf, while the total galactose content ranges from 30% to 40% for all treatments. more than 90% of total polysaccharide were 3,6- anhyd

18、ro-galactose and galactose.3. with water-extracting temperature of 50 , the extraction process was optimized by the orthogonal test. although the extracting time had more direct effect on extraction rate of g. lemaneiformis, there were no significant differences on polysaccharide content, protein le

19、vel and immune activity of nine groups of crude polysaccharides. based on these results and energy consumption in the practical process, the optimal extraction condition is as the following: adding 40 times amount of water, extracting two times with 3 hours for each time.4. by the deae sepharose f.

20、f., the ngf was separated in two phases, salt phase of ngf (ngfs) and water phase of ngf (ngfw). the recovery rate, 3,6- anhydro-galactose and galactose contents are 51.10%, 27.83% and 62.10%, respectively for ngfs, which were significantly higher than those of ngfw. however, the ngfw had higher cru

21、de polysaccharides content, protein level and immune activity compared to ngfs. based on the results of the recovery rate and purity, the ngfs was furthered studied. water soluble polysaccharide ngfs from gracilaria lemaneiformis was characterized by infrared(ft ir) and nuclear magnetic resonance (n

22、mr) spectroscopy. 5. the composition of the polysaccharide（ngfs） in wt% was determined as: -d- galp (50.3)，3,6- anhydro -l- galp（40.5）and -l- galp -6-sulfate（9.2）.the sulfate content for 10.32. 1d and 2d nmr techniques were employed in order to assign the spin system of polysaccharide without partia

23、l degradation. the structure is composed of 4-3,6-anhydro-l-galp(13)-d-galp 1segments，with the possibility of a -l- galp unit substituted at the 6-position by sulfate ester.key words: gracilaria lemaneiformis; polysaccharides; freeze-thaw process; isolation and purification; characterization; bioact

24、ivity龍須菜活性多糖提取、分離純化、結(jié)構(gòu)及其活性的研究第一章 引 言多糖是構(gòu)成生物體的一類十分重要的有機(jī)化合物，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。多糖的種類各異，在生物體中行使著不同的功能。因此，關(guān)于多糖的研究越來越受到研究人員的關(guān)注。當(dāng)今研究表明，海藻中含有豐富的多糖。海藻是海洋植物中數(shù)量和品種最多的一類，其體內(nèi)的生物活性物質(zhì)研究已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。其中，海藻多糖是目前最具有應(yīng)用前景的一類生理活性物質(zhì)。1.1龍須菜的研究概況1.1.1龍須菜概況龍須菜（gracilaria lemaneiformis）屬于紅藻門（rhodophta），杉藻目（gigartinales），江籬屬（gracia

25、laria greville）,原產(chǎn)于我國(guó)的山東沿海和日本的沖繩島,2000年初，中國(guó)科學(xué)院海洋研究所、廣東海洋資源研究發(fā)展中心和南澳縣科技興海辦公室合作開展了龍須菜移植東海的研究獲得了成功，經(jīng)過三年的推廣，廣東南澳島龍須菜養(yǎng)殖已達(dá)到規(guī)模化生產(chǎn)，平均產(chǎn)量達(dá)到5.25t/1000m2，給廣東、福建等海域的開發(fā)提供了有力的支撐，隨著龍須菜產(chǎn)量的迅速增加，海藻生物活性的逐步被認(rèn)識(shí)開發(fā)，對(duì)龍須菜的研究、開發(fā)應(yīng)用也引起了人們的廣泛關(guān)注1。1.1.2 龍須菜的營(yíng)養(yǎng)成分范曉等2報(bào)道的山東青島龍須菜總糖、海藻膠、粗纖維含量分別為42.57、26.72、3.4,龍須菜粗蛋白含量為19.14，而脂肪含量只有0.5

26、，是屬于高蛋白低脂藻種，其蛋白質(zhì)中有較多的藻膽蛋白3。龍須菜含有18種氨基酸，總量為1 5.45，其中必需氨基酸占42，此外還含有具生理活性的?；撬帷Ｋ被岱N類及其比例與其他藻類基本相似，以天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸居多。龍須菜含有人體全部必需氨基酸，它們的構(gòu)成比例與fao關(guān)于人體攝入必需氨基酸組成的推薦標(biāo)準(zhǔn)模式比較，除賴氨酸含量相對(duì)低些外，其他必需氨基酸比例較為平衡。分析結(jié)果表明，龍須菜不僅蛋白質(zhì)含量高，且必需氨基酸所占比例較高，種類齊全、比例適宜，是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)資源4。余杰等4研究表明南澳島龍須菜富含人體必需的fe、zn等微量元索，其k含量較高，k、mg的總量是na的2倍多，這有

27、利于改善人體鉀鈉平衡，對(duì)高血壓和心臟病人有益。1.1.3 龍須菜的藥理活性龍須菜既是提取瓊膠的優(yōu)質(zhì)原料，又是人類的綠色保健食品和珍稀的海洋蔬菜，還是養(yǎng)殖鮑魚等海洋動(dòng)物的優(yōu)良飼料。由于以往龍須菜產(chǎn)量不多且多數(shù)用于生產(chǎn)瓊脂，所以對(duì)其活性多糖研究較少。而目前龍須菜在廣東等地已實(shí)現(xiàn)規(guī)?；B(yǎng)殖,對(duì)龍須菜的藥理活性研究也越來越受到重視。龍須菜粗多糖占干重的30 左右， 有較高的研究利用價(jià)值。鄧志峰等5、牛榮麗等6分別報(bào)道了龍須菜多糖、甲醇提取物具有抗腫瘤作用；陳美珍7的研究發(fā)現(xiàn)龍須菜多糖具有顯著的抗突變活性和顯著的清除自由基活性。因而可開發(fā)成藥用多糖或保健品多糖， 以擴(kuò)大其使用范圍， 提高龍須菜的經(jīng)濟(jì)利用

28、價(jià)值。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的大量研究已證明海藻多糖具有多種藥理作用。因此，加快對(duì)海藻多糖的研究與開發(fā)利用已越來越受到世界各國(guó)的重視。我國(guó)的海藻資源十分豐富，以廉價(jià)海藻資源作原料，以生物工程技術(shù)為手段，從中提取出各種海藻多糖，使其應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等方面，這將對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要的作用和意義。1.2 海藻多糖的生物活性研究海藻多糖是海藻中重要組成部分，到目前為止，能進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的海藻多糖只有褐藻膠、瓊膠、卡拉膠，叉紅藻膠等,這些海藻多糖， 除具有傳統(tǒng)的工業(yè)價(jià)值外，近年來研究表明，由于海藻多糖是由多個(gè)相同的或不相同的單糖基通過糖苷鍵相連形成的高分子量碳水化合物，與其他多糖一樣具有多種生物活性及藥用

29、功能，諸如抗病毒、抗腫瘤、抗輻射、抗突變、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抗氧化和增強(qiáng)免疫力等,隨著對(duì)海洋生物多糖研究的深入，海藻多糖將成為一種非常有開發(fā)前景的抗癌輔助藥和免疫調(diào)節(jié)劑，為癌癥病人戰(zhàn)勝病魔帶來新的福音。1.2.1 抗腫瘤作用海藻多糖抑制腫瘤的效果，一般認(rèn)為不是直接作用于腫瘤細(xì)胞，而是作為生物免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能而間接抑制或殺死腫瘤細(xì)胞的，如能促進(jìn)淋巴因子激活殺傷細(xì)胞(lak)、自然殺傷細(xì)胞(nk)活性，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子等8。鈍頂螺旋藻多糖以0.31.5 gl劑量對(duì)b37乳腺癌細(xì)胞的抑制率可達(dá)68.0 ，對(duì)k562白血病細(xì)胞抑制率為46.0。當(dāng)螺旋藻多糖分別以300、15

30、0和75 mgkg灌胃給藥時(shí)，對(duì)小鼠s180肉瘤的抑瘤率分別為55.2 ，44.6和33.8；對(duì)h22小鼠肝癌的抑瘤率分別為47.1 、36.4和31.0 ，對(duì)eac小鼠腹水癌的抑瘤率分別為56.9 、44.7 和22.8 ，同時(shí)具有明顯提高荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的作用。用mtt法檢測(cè)顯示螺旋藻多糖具有提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和促進(jìn)nk細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的作用，經(jīng)治療后的小鼠其脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-2的功能增強(qiáng)9。螺旋藻多糖還能使處于緩解期急性白血病病人的nk細(xì)胞活性恢復(fù)正常10。海帶多糖las是從海帶laminarin japonica aresch中提取的一種由l-巖藻糖、d-半乳糖等糖基組

31、成的硫酸多糖類化合物，對(duì)小鼠肉瘤s180的抑制率可達(dá)86.511。皺海帶laminarin religiosa中提取的硫酸多糖腹腔，50 mg(kgd)對(duì)l1210載瘤小鼠的存活率能延長(zhǎng)33。鼠尾藻中分離的多糖giv-a在體內(nèi)對(duì)艾氏希腹水癌也有選擇性抑制活性12。除上述海藻多糖以外，紫菜多糖、羊棲菜多糖、昆布多糖、海蒿子多糖、海蘿聚糖等都有抗腫瘤及增強(qiáng)免疫力作用。亨氏馬尾藻、半葉馬尾藻、裂葉馬尾藻、叉開綱地藻、波狀網(wǎng)翼藻、角叉菜、銅藻、鈍形凹頂藻、拳狀松藻和刺松藻等提取的多糖都有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。1.2.2 抗心血管疾病作用海藻多糖在抗心血管系統(tǒng)方面的藥理活性主要包括降血壓、降血脂、降血糖、抗

32、凝血、抗血栓和抗動(dòng)脈粥樣硬化等。海洋硫酸多糖dps是一種從海藻中提取分離并經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾后獲得的硫酸多糖類化合物，可顯著降低腎性高血壓大鼠的動(dòng)脈壓，其降壓機(jī)制與dps促進(jìn)體內(nèi)no的合成或釋放及降低血管緊張素和內(nèi)皮素-的生成有關(guān)。dps對(duì)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或白介素-所致的大鼠血管平滑肌(vsmc)增殖也有明顯的抑制作用，隨堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或白介素-濃度的增加抑制作用減弱。dps抑制vsmc增殖作用，可能也是dps降壓作用機(jī)制13。巖藻多糖是抗凝血?jiǎng)?，有很高的抗凝血酶，具有很高的抗血脂活性，它主要分布在多葉泡葉藻、溝鹿角菜、旋生墨角藻及海帶、索藻等海藻中。法國(guó)科學(xué)家還研究發(fā)現(xiàn)巖藻聚糖的分

33、子量越大，抗凝血活性也越高14。巖藻聚糖硫酸酯(lmsf)還在降血脂和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化方面具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值15。藻酸雙酯鈉(pss)是一種類肝素藥物，具有抗凝作用，卻無明顯導(dǎo)致出血傾向的副作用，pss抗凝效價(jià)相當(dāng)于肝素的33.9，1 mg=41.7單位(肝素)，口服抗凝作用為劑量依賴性，其機(jī)制為抗凝血酶樣作用12。pss除具有降血脂、抗凝血、抗血栓作用外，還可以降低血液粘滯度和改善微循環(huán)等作用。但經(jīng)臨床應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)的反應(yīng)率為5-2316。其換代產(chǎn)品甘糖酯(pgms)對(duì)治療急性腦梗死的臨床和實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究，證明其療效高，副作用小，為防治心血管病的新藥。海帶多糖可作抗凝劑，抗凝血癥、對(duì)病

34、毒的生長(zhǎng)和發(fā)育起抑制作用，并能降低血清中所包含的膽固醇在內(nèi)的類脂含量。它主要分布在海帶屬、墨角藻、酸藻等各屬褐藻中及剛毛藻、蕨藻等各屬綠藻中。由鼠尾藻、萱藻、石莼藻中提取硫酸多糖均有顯著的抗血小板凝聚作用17；褐藻淀粉硫酸酯(ls)具有抗凝血、降血脂及降低膽固醇等作用，臨床使用肯定其效果。枝管藻多糖顯著抑制飼喂高脂飼料大鼠的甘油三酯水平的升高，顯著降低高脂血癥大鼠的血清總膽固醇和甘油三酯含量，但對(duì)血清低密度酯蛋白和高密度酯蛋白含量的變化幾乎無影響；明顯降低高脂血大鼠血清活性氧、丙二醛含量，提高血清超氧化物歧化酶活性。枝管藻多糖能顯著改善高脂血大鼠體內(nèi)過氧化狀態(tài)，但其抗高脂血效果低于陽性對(duì)照藥煙

35、酸肌醇酯18。孔石莼多糖也具有顯著的降血脂作用，且血清中脂蛋白膽固醇的改善狀況呈明顯的劑量依賴性，高劑量組的降脂活性與陽性對(duì)照藥煙酸肌醇酯相近19。螺旋藻多糖(psp)能有效地降低血糖，10010-6、20010-6濃度時(shí)血糖降低率分別為23.6與30.120。石莼多糖在不同劑量50、200 mg/ kg時(shí)均可明顯降低四氧嘧啶引起的大鼠高血糖反應(yīng)，但對(duì)正常小鼠無影響21。羊棲菜多糖也有良好的降血糖作用22，而且可作為降血脂藥物的功能成分對(duì)高血脂患者以及由高血脂引起的動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖和冠心病患者產(chǎn)生極為有益的影響23。紫菜多糖有增強(qiáng)心肌收縮力、降血脂、抗凝血、降低血粘度、抑制血栓形成的作用，對(duì)

36、預(yù)防動(dòng)脈硬化、改善心肌梗死癥狀有重要意義24。1.2.3 抗病毒作用自1958年girber等發(fā)現(xiàn)gelidum canilagenium提取出的多糖和卡拉膠具有抗流感b和抗腮腺炎病毒后，科學(xué)家逐漸發(fā)現(xiàn)海藻多糖對(duì)多種病毒有抗性。海洋硫酸多糖911是從海藻中提取分離并經(jīng)分子修飾而成的硫酸多糖類化合物。911體外能明顯抑制hiv-1的復(fù)制，體內(nèi)對(duì)猴免疫缺陷病毒(siv)的增殖也具有明顯抑制作用。提示911體內(nèi)外對(duì)艾滋病毒的增殖均有明顯抑制作用，其作用機(jī)制與干擾病毒與細(xì)胞吸附、抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性及提高機(jī)體免疫功能有關(guān)，有望成為一類作用于多環(huán)節(jié)的新型抗艾滋病海洋藻類藥物25。用紅藻多糖對(duì)牛免疫缺陷病

37、毒(biv)的生長(zhǎng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抑制作用，其抑制率分別為85.96和88.65。與臨床批準(zhǔn)使用的抗aids藥物疊氮脫氧胸腺嘧啶(相似率89.52)近似，證實(shí)了其作為抗aids藥物的可行性26。太平洋裂膜藻中的硫酸多糖是hiv病毒轉(zhuǎn)錄酶的特異性抑制劑，而且對(duì)其它病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶也有抑制作用27。從鹿角藻及墨角藻提取的硫酸多糖可以在體外與肝病毒(biv)作用28。褐藻糖膠具有抗rna和dna病毒的作用，實(shí)驗(yàn)表明，它對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒型，柯薩奇b3和a16型病毒,腺病毒型,?？尚筒《居忻黠@的抑制作用。海帶多糖具有抗hiv的作用29。1.2.4 抗氧化作用抗氧化近年來的研究表明，過多的活性氧自

38、由基對(duì)吞噬細(xì)胞本身及其他細(xì)胞、組織及生物大分子有破壞作用，而脂質(zhì)過氧化加速又可造成正常細(xì)胞的破壞和死亡。海藻硫酸多糖(sps)具有清除活性氧的作用,是有效的自由基清除劑，低濃度的sps對(duì)多形核白細(xì)胞(pmn)呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的活性o2- 的作用是直接清除；而高濃度的sps除直接清除pwn呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的o2-外，尚能部分抑制pwn活性，阻止o2-的生成30。鼠尾藻和銅藻多糖經(jīng)遠(yuǎn)紫外線照射24h后，清除超氧陰離子的水平明顯下降，但卻能顯著抑制氧自由基對(duì)過不飽和脂肪酸的氧化作用。褐藻多糖(bsp)在體外具有較強(qiáng)的清除fenton反應(yīng)和光照h2o2產(chǎn)生的oh和黃嘌呤黃嘌呤氧化酶和光照核黃素產(chǎn)生的o2-的作

39、用，是一種很好的抗氧化劑；同時(shí)它還能明顯清除白細(xì)胞呼吸爆發(fā)時(shí)產(chǎn)生的o2-而且較大濃度時(shí)也能部分抑制白細(xì)胞呼吸爆發(fā)，抑制自由基對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷而增強(qiáng)免疫功能31。bsp可使體內(nèi)sod，gshpx活性增加，并使脂質(zhì)過氧化程度降低，同時(shí)使移植腫瘤生長(zhǎng)受到抑制32。bsp能夠清除自由基，減低氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞dna損傷程度，有利于維護(hù)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。因此bsp可作為一種預(yù)防性抗氧化營(yíng)養(yǎng)素，用于預(yù)防氧化應(yīng)激引起的疾病33。鈍頂螺旋藻多糖能顯著增強(qiáng)機(jī)體抗氧化及抗自由基損傷的能力34，極大螺旋藻多糖具有顯著的清除oh的活性35。羊棲菜多糖可顯著降低l615。小鼠全血及肝脾脂質(zhì)過氧化物的含量，提高過氧化

40、物酶和超氧化物歧化酶的活性，具有清除過多自由基與抗脂質(zhì)過氧化的作用。海藻多糖作為人體的抗氧化劑，具有抗衰老與防治疾病的作用。1.2.5 抗輻射作用范曼芳和陳瓊?cè)A1988年指出，螺旋藻多糖具有抗輻射能力。郭寶江等1992年研究表明，這種天然物質(zhì)除能增強(qiáng)骨髓細(xì)胞的增殖活性外，還能顯著減輕小鼠骨髓細(xì)胞和蠶豆根尖細(xì)胞的輻射遺傳損傷，大大降低輻射引起的突變頻率。龐啟深等1988年通過用多糖作照射前和照射后處理的比較，表明多糖有明顯提高核酸內(nèi)切酶對(duì)損傷dna的切除活性和增強(qiáng)dna修復(fù)合成的作用。用鈍頂螺旋藻多糖12510-6處理的小鼠其抗輻射能力大大提高，在受到致死劑量60co射線照射后的存活率比對(duì)照組提

41、高33,并表明螺旋藻多糖能促進(jìn)照射后小鼠造血功能的恢復(fù) 36。以101o-6、15010-6和30010-6劑量腹腔注射巖藻糖膠,可使受4.5gy60co射線照射的小鼠白細(xì)胞分別增加19.1、47.6和61.3,使淋巴細(xì)胞分別增加24.2、58.3 和66.937。1.2.6 抗突變作用劉力生等1991年指出，螺旋藻多糖能消除免疫抑制劑(環(huán)磷酰胺)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制作用。螺旋藻多糖對(duì)環(huán)磷酰胺(cy)引起的balb/c小鼠造血功能等損傷具保護(hù)作用。當(dāng)給小鼠cy時(shí)，若能同時(shí)給予100 x 10-6螺旋藻多糖，就能大大減輕cy引起的造血功能障礙(p0.01)、體重下降的程度(p0.02)并能明顯降

42、低動(dòng)物的死亡率(p0.05) 38。對(duì)不同培養(yǎng)階段的cd3ak細(xì)胞具有明顯的刺激增殖作用，使培養(yǎng)23d的cd3ak細(xì)胞仍具較高的殺傷腫瘤細(xì)胞(k562 cel1)的活性(46.5-5o) 39。海帶多糖對(duì)cy誘發(fā)的小鼠骨髓細(xì)胞微核率有明顯的抑制效果，其抑制率達(dá)6o.7,這說明海帶多糖能拮抗小鼠染色體的突變。且隨著濃度的增加抑制率有所增強(qiáng)40。1.2.7 護(hù)膚潤(rùn)膚功能海藻是一種優(yōu)良的潤(rùn)膚劑，這不僅因?yàn)楹Ｔ逯械幕钚晕镔|(zhì)能與皮膚蛋白結(jié)合形成保濕性的凝膠，而且它還可以通過水合作用在皮膚的表面形成保護(hù)膜，防止水分蒸發(fā)。研究人員對(duì)大量繁殖在沿海潮汐的綠海藻進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其中的硫酸化多糖具有明顯的保濕作用

43、41。1.2.8 增強(qiáng)免疫力作用自2o 世紀(jì)7o年代以來，人們對(duì)糖類物質(zhì)的生物學(xué)功能有了新的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)多糖及糖復(fù)合物參與了細(xì)胞的各種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如免疫細(xì)胞間信息的傳遞與感受。日本研究人員對(duì)可食海藻laminaria japonica的熱溶提取物多糖進(jìn)行研究。在內(nèi)毒素?zé)o響應(yīng)c3h/hcj小鼠實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出脾細(xì)胞dna合成活性的提高，并且對(duì)小鼠的抗金葡球菌的吞噬細(xì)胞的消化活性具有促進(jìn)作用，并對(duì)細(xì)胞質(zhì)分裂, interlenkin-la的釋放和腫瘤壞死因子a也有相同的促進(jìn)作用。進(jìn)一步研究表明，此海藻多糖對(duì)脾細(xì)胞多克隆抗體(igm和igg)的生成上有促進(jìn)作用。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等)。另外據(jù)報(bào)道

44、螺旋藻多糖、巖藻聚糖等海藻多糖可刺激實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人類免疫細(xì)胞增殖，增強(qiáng)免疫力42-44。海藻多糖在500 10-6-20001o-6劑量范圍內(nèi)能明顯的提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫功能45，增加小鼠的足腫脹度和抗體生成細(xì)胞數(shù)，提高小鼠的體液和細(xì)胞免疫46。螺旋藻多糖能夠非常明顯地促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞對(duì)絲裂原刀豆素a的增殖反應(yīng)，提高小鼠機(jī)體的免疫功能47。螺旋藻多糖能明顯地促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞對(duì)絲裂原刀豆素a 的增殖反應(yīng)，提高小鼠機(jī)體的免疫功能47。極大螺旋藻胞外多糖可提高小鼠nk的活力，促進(jìn)白細(xì)胞介素產(chǎn)生及增強(qiáng)淋巴細(xì)胞和混合淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能48。螺旋藻多糖還能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬

45、率和吞噬指數(shù)，提高外周血中t淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和血清溶血素的含量49。顯示出螺旋藻多糖不僅能提高動(dòng)物非特異性的細(xì)胞免疫功能，還能促進(jìn)機(jī)體特異性的免疫功能。硒是人體必須的微量元素之一，但無機(jī)硒化合物毒性大，使硒的應(yīng)用受到限制。通過對(duì)單細(xì)胞綠藻類的富硒培養(yǎng)，使硒取代海藻多糖分子上部分硫，得到海藻硒多糖。經(jīng)毒性和三致實(shí)驗(yàn)證明，海藻硒多糖無毒，無蓄積性毒性，無致突變作用，能增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，具有腫瘤的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)海藻硒多糖對(duì)小鼠各項(xiàng)免疫功能的影響均強(qiáng)于等同劑量的無機(jī)硒和單純海藻多糖，它具備了二者的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)效應(yīng)，能夠發(fā)揮硒和多糖的彼此協(xié)同作用50?？傊?，海藻多糖在哺乳動(dòng)物中已證實(shí)能增強(qiáng)特異

46、性免疫功能和非特異性免疫功能，可增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力及對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫的功能51。1.3 海藻多糖的構(gòu)效關(guān)系海藻多糖是一類多組分的混合物。至今為止，對(duì)其結(jié)構(gòu)的研究主要集中于其所包含的糖單元及含量。如褐藻(ascophyllum nodosum)細(xì)胞壁中的多糖包括25的l-廣巖藻糖、26的d-木糖、19的d-己四醇醛酸、13的硫酸鹽和12的蛋白質(zhì)52。而從研究報(bào)道來看，海藻多糖的活性和單糖組成、糖苷鍵、硫酸基和空間構(gòu)象等有密切的關(guān)系。1.3.1 多糖的組成和糖苷鍵的關(guān)系抗腫瘤多糖結(jié)構(gòu)研究表明:從菌體中提取得到的活性多糖一般由葡萄糖組成，而且葡聚糖主鏈上一般均有1, 6糖苷鍵。如從奇

47、果菌屬分離出來的具有抗腫瘤活性的奇果菌多糖(grifolan)，基本結(jié)構(gòu)是-l, 3結(jié)合的直鏈葡萄糖，3分子中有1分子的-1, 6側(cè)鏈葡聚搪53。從豬岑菌種的菌體中分離得到多種多糖級(jí)分，其抗腫瘤活性的部分也是帶(1-6)一支鏈的一(13)-d-葡聚糖54。從香菇中提取得到的抗腫瘤多糖，也是由一(1-3)結(jié)合的直鏈葡聚糖構(gòu)成，以5個(gè)單糖殘基分子上有2個(gè)分子的比率，在葡萄糖殘基6位有d結(jié)合的側(cè)鏈葡萄糖分子55。酵母菌中提取得到葡萄甘露聚糖(glucomannan)，其活性好象與d一葡萄糖的含量和鍵合方式有關(guān)。由植物中提取的抗腫瘤活性多糖一般由半乳糖醛酸等組成，ilien je.等從紫松果竹(ech

48、incana prupurea)分離的由阿拉伯糖和半乳糖等組成的多糖，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞壞死因子56。有些果聚糖也具有抗不同腫瘤的活性，如高等植物一支黃花(solidago virgaurea)的-1, 2結(jié)合的果聚糖，具有抗腫瘤作用57許多高等植物的多糖均有激活補(bǔ)體的作用，補(bǔ)體蛋白上存在的識(shí)別點(diǎn)可以識(shí)別多糖結(jié)構(gòu)。山田陽城58等研究了從當(dāng)歸、艾葉、改仁、柴胡、紫根等植物中提取的具有抗補(bǔ)體活性的多糖后，發(fā)現(xiàn)這些多搪大多為酸性雜多糖，其酸性部分主要是半乳糖醛酸和葡萄搪醛酸。1.3.2 多糖中的硫酸根離子與多糖功能的關(guān)系實(shí)驗(yàn)證明,硫酸鹽陰離子對(duì)硫酸化多糖抑制hiv病毒是離子結(jié)構(gòu)。如小分子量的

49、牛膝多搪有增強(qiáng)免疫力的作用，但不抗病毒，引入一定量的硫酸基團(tuán)后，就有了較強(qiáng)的抗乙型肝炎病毒hbsag和hbeag的活性59,60。具有抗腫瘤活性的香菇多糖在硫酸化以后，也就具有了抗hiv的活性，能夠抑制hiv- i產(chǎn)生的細(xì)胞病變61。硫酸根在抑制hiv-1i生長(zhǎng)的過程起了重要作用62。并且這種作用不僅與濃度呈劑量關(guān)系，而且與分子中硫酸鹽含量有關(guān)，硫酸鹽含量越高，其抗hiv活性越強(qiáng)。一般每個(gè)單糖單位含有2-3個(gè)so42一能夠獲得最佳的抗hiv-i活性。1.3.3 多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)與多糖功能的關(guān)系多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系至今還不十分清楚，但可以肯定的是高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)功能的影響比一級(jí)結(jié)構(gòu)更重要，而決定高

50、級(jí)結(jié)構(gòu)的重要因素又是多糖分子鏈和鏈外的氫鍵。抗腫瘤活性研究中，分子量5萬以上具有三重結(jié)構(gòu)的多糖才有抗腫瘤活性。經(jīng)x射線分析表明具有抗腫瘤活性的香菇多糖及列褶多糖均有-三股繩狀螺旋型立體構(gòu)型。如果在香菇多糖中加入尿素或二甲亞砜.使分子的立體構(gòu)型發(fā)生改變，則其活性也就會(huì)喪失63。在另一方面，主鏈同是-1, 3結(jié)構(gòu)，又有-1, 6側(cè)鏈的葡聚糖，有些具有較強(qiáng)的活性，而有些卻沒有活性。如伏岑多糖(pachyman)、昆布多糖(lamiraran)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)雖然與香菇多搪相似，但它們沒有抗腫瘤活性。但是如果多搪中的一些-1, 6支鏈，用類似于高碘酸氧化和smith降解的方法將其切去，就可以獲得具有強(qiáng)烈抗

51、腫瘤活性的多糖，x射線分析表明此時(shí)己經(jīng)形成了三重構(gòu)造64。此外多糖的粘度、溶解度、分子量、游離輕基、乙酰化和x-化作用都對(duì)其生物活性產(chǎn)生影響65-67。1.4 海藻多糖應(yīng)用前景和研究趨勢(shì)1.4.1 海藻多糖應(yīng)用前景海藻多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗突變、抗輻射和增強(qiáng)免疫力等作用。近年來，國(guó)內(nèi)外專家們均致力于海藻多糖的藥理功能、生物活性功能的研究，取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展68。因此，以廉價(jià)海藻為物質(zhì)基礎(chǔ)，以生物工程為技術(shù)手段，在醫(yī)藥、食品、飼料、化工和化妝品等行業(yè)生產(chǎn)出大批量有重要價(jià)值的產(chǎn)品69，應(yīng)該成為學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界共同奮斗的方向與目標(biāo)。海藻多糖類研究有望成為今后生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。1.4.2 海藻多

52、糖研究趨勢(shì)雖然近年來海藻多糖類物質(zhì)的研究取得了很大的進(jìn)展，但是無論是從國(guó)內(nèi)還是國(guó)外來看，海藻多糖類化合物的研究和蛋白質(zhì)、核酸的研究相比，還有很大的差距，這主要表現(xiàn)在以下的幾個(gè)方面67:(1)多糖結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系到現(xiàn)在還研究不多，而且還不太完善，這可能和多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜和臨床研究太少有關(guān)，因此目前尋找高活性的多糖具有較大的盲目性。同時(shí)也缺乏修飾已有的多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)而人工合成多糖的依據(jù)。人們初步認(rèn)為多糖的生物活性與其一級(jí)及高級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量、溶解度等有關(guān)，但尚缺乏規(guī)律性的科學(xué)論據(jù)和結(jié)論。大多還是憑科學(xué)家們的推測(cè)和分析，而對(duì)多糖的構(gòu)象和晶體結(jié)構(gòu)研究幾乎還是空白。(2)多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定方法還遠(yuǎn)未達(dá)到自動(dòng)化、微量化和

53、標(biāo)準(zhǔn)化。由于多糖中的每個(gè)單糖殘基都有多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，這是糖昔鍵具有多種連接的可能性，而c1的構(gòu)型又有和兩種，這種結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使多搪的結(jié)構(gòu)測(cè)定遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)測(cè)定要困難的多。近年來運(yùn)用質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)測(cè)定多糖的結(jié)構(gòu)取得了一定進(jìn)展，但是還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到成熟和可靠的程度。(3)多糖的異構(gòu)體數(shù)目巨大，這使得人工合成非常的困難。如糖分子有六個(gè)碳原子，其上的功能基團(tuán)都可以進(jìn)行反應(yīng)，因此合成時(shí)形成的異構(gòu)體數(shù)目與單體的數(shù)目和種類呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。(4)多糖在體內(nèi)的作用機(jī)制還未十分明了。雖然多糖的種種生物活性己經(jīng)被多個(gè)試驗(yàn)證明，但是多糖在生物體內(nèi)的真正的作用機(jī)制，包括多糖在細(xì)胞膜或脂質(zhì)體表面的構(gòu)象和作用、多糖

54、和磷脂及蛋白締合的化學(xué)和物理進(jìn)程以及這類分子聚集體所形成的微環(huán)境與它們的生物功能之間的關(guān)系等都還不十分清楚，有待深入研究。(5)多糖的樣品的制取十分困難，多糖類化合物多是具有很強(qiáng)極性的非電解質(zhì)物質(zhì)或是弱電離物質(zhì)，其提純較為困難。對(duì)于一種確定分子量范圍的多糖分子來說，亦不一定是一個(gè)單一物質(zhì)，而可能是有一定分子量分布的混合物，與蛋白質(zhì)不同，多糖類化合物幾乎不能得到其晶體，這為后續(xù)的分析也增加了難度。1.5 本研究的內(nèi)容和預(yù)期目標(biāo)1.5.1研究?jī)?nèi)容（1）比較不同提取水溫對(duì)龍須菜多糖的生化組成和活性的影響并篩選出最佳提取溫度（2）龍須菜多糖提取工藝優(yōu)化及其活性的研究（3）采用合適的分離純化條件以活性為

55、靶標(biāo)對(duì)龍須菜多糖進(jìn)行分離純化，獲得均一多糖（4）對(duì)獲得的均一多糖進(jìn)行理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的研究。1.5.2 預(yù)期目標(biāo)（1）建立最佳龍須菜活性多糖的提取分離方案；（2）篩選出最具活性的多糖組分，為龍須菜多糖保健品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)； （3）通過分離純化得到新的有活性的化合物；（4）通過結(jié)構(gòu)解析確定活性多糖的結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步構(gòu)效關(guān)系研究做依據(jù)。第二章 分離龍須菜活性多糖的方法研究龍須菜(gracilaria lemaneiformis)屬于紅藻門(rhodophyta), 杉藻目(gigartinales), 江蘺科(gracilariaceae), 江蘺屬(gracilaria), 是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)海藻之一

56、, 近年來已在山東、浙江、福建、廣東和海南等省沿海進(jìn)行大規(guī)模栽培4, 有研究表明龍須菜多糖具有抗腫瘤、抗氧化和抗突變等多種生理活性四、五、7、70, 因此, 龍須菜多糖的研究和利用已引起人們的重視71-74。有研究表明適當(dāng)升高浸提水溫有利于提高龍須菜總粗多糖的溶出率和瓊膠的提取率7、72, 但是多糖的得率和活性之間不存在正相關(guān)，過高的提取水溫提取的多糖可能會(huì)降低海藻多糖的免疫或抗病毒活性75, 因此, 確定合適的提取水溫對(duì)于龍須菜活性多糖的提取和利用具有十分重要的意義, 然而迄今為止尚未見有關(guān)不同浸提水溫對(duì)龍須菜多糖的生化組成和免疫活性的研究, 這非常不利于龍須菜多糖的開發(fā)利用。另一方面, 由于龍須菜和其它江籬類似水提粗多糖中含有較多的膠體, 而粗多糖在冷凍后可分為膠體部分和非膠體部分, 且膠體部分的免疫活性遠(yuǎn)低于非膠體部分75、76, 因此, 龍須菜多糖的開發(fā)利用應(yīng)該特別關(guān)注其非膠體部分。但是, 目前的龍須菜活性多糖的提取工藝中通常沒有采用凍融步驟去除膠體4、5、7、70、74, 這不僅降低了粗多糖活性, 而且不利于活性多糖的分離和純化(由于膠體具有很