冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉殼肌大分子物質(zhì)及組織結(jié)構(gòu)的影響

1、冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉殼肌大分子 物質(zhì)及組織結(jié)構(gòu)的影響崔瑞穎，焦學(xué)芹，祖鐵紅，張志勝*，崔波，張欣彩(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,保定 071000)摘要:以海灣扇貝閉殼肌TBA值s肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性及組織的顯微鏡觀察為指標(biāo), 研究了不同冷凍方式(-251) ?冰箱冷凍s(-351) ?冰柜冷凍s(-801) ?超低溫冷凍和液 氮冷凍對(duì)海灣扇貝閉殼肌大分子物質(zhì)及組織結(jié)構(gòu)的影響o研究結(jié)果表明:相同冷凍方式條件 下,凍藏時(shí)間對(duì)其TBA值及肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性影響顯著(p0.05):相同凍藏時(shí)間條 件下,不同的冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉殼肌的TBA值影響差異均顯著(p0.

2、05),液氮處理對(duì)肌原纖 維蛋白Ca2+-ATPase活性影響與其他處理間差異顯著(p0.05),其他3種處理間差異不顯著o由光 學(xué)顯微鏡下圖片可知,液氮處理對(duì)海灣扇貝閉殼肌肌肉纖維的影響最小,與新鮮閉殼肌的結(jié)構(gòu) 最相近,(-251) ?冰箱冷凍對(duì)閉殼肌肌肉纖維結(jié)構(gòu)破壞最大o因此,選擇(-351) ?冰柜冷凍 海灣扇貝閉殼肌對(duì)大分子物質(zhì)及組織結(jié)構(gòu)的變化影響較好o 關(guān)鍵詞:冷凍方式:海灣扇貝:閉殼肌:大分子:結(jié)構(gòu)中圖分類號(hào):TS 254.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1005-9989(2014)02-0134-05Effects of different freezing processes

3、on biomacromolecules and structure of Argopecten irradiams muscleCUI Rui-ying, JIAO Xue-qin, ZU Tie-hong, ZHANG Zhi-sheng*, CUI Bo, ZHANG Xin-cai(Food Science and Technology College, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000)Abstract: Taking TBA, the Ca2+-ATPase activity in myofibrillar prote

4、in and the structure of Argopecten irradiams muscle as the indexes, the effects of 4 different freezing processes, such as (-251) refrigerator freezing, (-351) refrigerator freezing, (-801) ultra-low temperature freezing and liquidnitrogen freezing, on biomacromolecules and structure of Argopecten i

5、rradiams muscle were studied. Results showed that: At the same freezing process, TBA and the Ca2+-ATPase activity in myofibrillar protein change signifienatly at different frozen storage time (p0.05); at the same frozen storage time, TBA changesignifienatly at different freezing processes (p0.05), t

6、he Ca2+-ATPase activity in myofibrillar protein change signifienatly between liquid nitrogen freezing and other freezing processes (p0.05). By optical microscope images, Argopecten irradiams muscle structure by liquid nitrogen freezing similar to the freshmuscle structure. The change of muscle fiber

7、 structure is the largest by (-251) refrigerator freezing of Argopecten irradiams muscle. So, (-351) refrigerator freezing was better on on biomacromolecules and收稿日期：2013-06-28*通訊作者基金項(xiàng)目：國(guó)家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201205031)o 作者簡(jiǎn)介：崔瑞穎(1989),女,河北廊坊人,碩士研究生,主要從事畜產(chǎn)品加工原理及技術(shù)研究的工作o 134 structure of Argopecten irradia

8、ms muscle.Key words: freezing processes; Argopecten irradiams; muscle; biomacromolecules; structure海灣扇貝(Argopecten irradias)屬瓣鰓綱異柱目 扇貝科扇貝屬，又稱大西洋內(nèi)灣扇貝，是我國(guó)重 要的經(jīng)濟(jì)品種之一。但是由于時(shí)域及地域限制， 冷凍保存及運(yùn)輸尤為重要。冷凍肉的質(zhì)量取決于冷凍方式、存儲(chǔ)溫度、 時(shí)間和解凍方法1。凍結(jié)速率會(huì)對(duì)肉品質(zhì)產(chǎn)生影 響2-3。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)畜肉、魚蝦類冷凍方式的研 究比較豐富，研究表明：常用的冷凍裝置包括連 續(xù)凍結(jié)隧道、螺旋凍結(jié)裝置和風(fēng)冷擱架凍結(jié)裝置 對(duì)畜

9、肉、魚蝦類品質(zhì)的影響不是很明顯，凍藏時(shí) 間對(duì)于品質(zhì)的影響比較明顯4-7。然而，關(guān)于冷凍ATPase活性測(cè)定一次。從低溫冰箱中取出樣品， 20 條件下解凍2 h。1.4 TBA值的測(cè)定采用崔珺等8-9 的方法，取5 g絞碎的貝肉 放入燒杯，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸(含0.1% EDTA)，攪拌30 min，用雙層濾紙過濾。取5 mL 上清液加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，于90 水 浴保溫30 min。取出冷卻1 h，加入5 mL氯仿，搖 勻，靜置分層后再取上清液在532、600 nm處比色 記錄吸光值。光密度在0.30.5之間最合適，若濃 度過大需經(jīng)稀釋。方式對(duì)海灣扇

10、貝閉殼肌大分子物質(zhì)變化方面的報(bào) 道仍較少。TBA(mg/kg)=(A (155W)532-A600)0.0572.61000/本實(shí)驗(yàn)將新鮮的海灣扇貝閉殼肌進(jìn)行不同的 冷凍處理：(-251) 冰箱冷凍、(-351) 冰柜 冷凍、(-801) 超低溫冷凍和液氮冷凍，研究 各冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉殼肌大分子物質(zhì)及組織 結(jié)構(gòu)的影響，以期為海灣扇貝加工技術(shù)開發(fā)提供 理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料新鮮海灣扇貝(Argopecten irradiams)：市售， 產(chǎn)自秦皇島，整貝質(zhì)量為(302) g。1.2 儀器GL 20G高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器 廠；UV 2800紫外分光光度計(jì)：尤尼柯儀器有

11、限 公司；FA2104電子天平(d=0.001 g)：上海天平儀 器廠；JJ-2組織攪碎機(jī)：長(zhǎng)沙市光大科學(xué)儀器有 限公司；(-251) 、(-351) 冰箱：海爾公 司；(-801) 超低溫冰箱：SANYO公司；DPL- 175焊接絕熱氣瓶液氮罐：張家港中集圣達(dá)因低 溫裝備；BX51光學(xué)顯微鏡：Olympus有 限公司。1.3 閉殼肌的處理將新鮮的海灣扇貝取完整閉殼肌，然后清 洗，分別置于(-251) 冰箱、(-351) 冰 柜、(-801) 超低溫冰箱和液氮冷凍，然后在 (-251) 條件下凍藏，每隔1個(gè)月對(duì)樣品TBA 值測(cè)定一次，每隔15 d對(duì)樣品肌原纖維蛋白Ca2+-式中：W為貝肉的質(zhì)量

12、(g)，與TBA反應(yīng)的物 質(zhì)的質(zhì)量(TBARS)以每千克中丙二醛的 毫克數(shù)表示。1.5 肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的測(cè)定1.5.1 肌原纖維蛋白的提取 采用劉美華10的方 法，取貝肉10 g研碎，邊研邊加入100 mL預(yù)冷的 高離子濃度鹽溶液，研磨15 min，然后加入4倍冰 水稀釋，攪勻，冷凍離心(4000 r/min10 min0)，取沉淀。重復(fù)上述操作3次，最后得到的 沉淀物用Tris-HCl緩沖液勻漿攪勻。定容至100 mL，所得的肌原纖維懸濁液供Ca2+-ATPase活性 的測(cè)定。1.5.2 肌原纖維蛋白含量測(cè)定 采用雙縮脲法11進(jìn) 行蛋白濃度的測(cè)定。1.5.3 蛋白標(biāo)準(zhǔn)

13、曲線的繪制 牛血清蛋白溶液可以 作為測(cè)量蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線用。取6支試管， 以表1加入各試劑12。表1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)試劑/mL01234510 mg/mL的牛血清蛋白溶液00.20.40.60.8 1.0蒸餾水1.00.80.60.40.2 0雙縮脲4.04.04.04.04.0 4.0540加入雙縮脲試劑后，在25 下放置30 min， 在540 nm下測(cè)其吸光度。以0 mg/mL牛血清蛋白溶 液做參比，測(cè)A 。以蛋白值含量(mg/mL)為橫坐標(biāo)、A540為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.0456X-Y=0.1034X+0.0021，R2=0.9999。0.0026，R2=0.9973

14、。0.61.6 組織切片的制作和鏡檢將海灣扇貝閉殼肌樣品用固定液(10%甲醛)0.S0.40.30.20.10Z=0.04S6Y0.0026 32 =0.9973固定24 h以上，在固定約12 h時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行修 整。將樣品修整為5 mm5 mm3 mm的塊狀， 固定后的樣品用自來水沖洗24 h，分別轉(zhuǎn)入70% 乙醇(2 h)、85%乙醇(3 h)、95%乙醇(1 h)、無水0.10246810121(NH1N-)圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線1.5.4 Ca2+-ATPase活性的測(cè)定 采用萬建榮13的方 法進(jìn)行測(cè)定。活性=(A-B)/t酶蛋白質(zhì)量 式中：A為1 mL反應(yīng)生成的磷酸量；B為空白值，mo

15、l； T為反應(yīng)時(shí)間，min。酶蛋白質(zhì)量為1 mL肌原纖維蛋白質(zhì)懸 濁液所含的酶量，mg。無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：(1)準(zhǔn)確稱取在105 下干燥的磷酸二氫鉀 0.4394 g，配成1000 mL，得到100 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ) 備液溶液，取10 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，定容至100 mL， 即得10 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。(2)取7支試管，以表2依次加入各試劑。表2 無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)乙醇(1 h)和無水乙醇(1 h)進(jìn)行脫水，然后用二甲苯進(jìn)行30 min、2次的透明處理，60 條件 下，石蠟透蠟(重復(fù)3次)，包埋；切塊修整后， 切5 m厚的切片(縱切)。切片用蘇木精染色， 脫色，酒精程序脫水后伊紅復(fù)染，制

16、成標(biāo)本。 切片觀察使用OlympusBX41生物顯微鏡，拍攝典 型的組織圖像14-15。1.7 數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS17.0對(duì)所測(cè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 結(jié)果與分析2.1 不同冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉殼肌TBA值的 影響不同貯藏時(shí)間及不同冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉 殼肌TBA值的影響見圖3。(2Sd1) 0.7 (3Sd1) (80d1) 0.6 5 #1(NH1LH)0.S試劑/mL10 g/mL的無機(jī)磷01234560.40.3標(biāo)準(zhǔn)溶液00.5 1.0 2.03.04.05.0硫酸鉬酸銨溶液1.01.0 1.0 1.01.01.01.0Elon試劑0.50.5 0.5 0.50.50.50.5 蒸餾

17、水 8.5 8.0 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 0.20.1001234S1(3)加入各試劑后，振蕩混勻。室溫發(fā)色 45 min，在640 nm處測(cè)其吸光度。以0 g/mL的圖3 不同貯藏時(shí)間冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉殼肌TBA值的 影響640標(biāo)準(zhǔn)溶液做參比，測(cè)A。以無機(jī)磷的含量(g/由圖3可以發(fā)現(xiàn)，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，海灣扇640mL)為橫坐標(biāo)、A0.6為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：貝閉殼肌的TBA值整體呈上升趨勢(shì)，在01、45月上升幅度明顯，且相同冷凍方式下，貯藏時(shí)間0.S0.40.30.20.10Z = 0.1034Y + 0.002132 = 0.999901234S 61(H1N-)圖

18、2 無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)海灣扇貝閉殼肌TBA值的影響顯著(p0.05)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，相同貯藏時(shí)間，4種不同冷凍方式對(duì)閉 殼肌的TBA值的影響差異性顯著(p0.05)。隨貯藏 時(shí)間延長(zhǎng)，(-251) 冰箱冷凍條件下，TBA值的 上升幅度最大；液氮冷凍條件下，TBA值的上升 幅度最小。在冷藏過程中，氧化反應(yīng)產(chǎn)生苦味和代謝風(fēng) 味，引起腐敗變質(zhì)。在這個(gè)階段中，引起腐敗的主導(dǎo)作用還是微生物和酶。引起海灣扇貝閉殼肌 TBA值上升的原因很多，凍結(jié)使閉殼肌中的自由 水含量減少，但卻增加了剩余溶液的濃度，使氧 化加快。當(dāng)溫度達(dá)-4 時(shí)，氧化速率最大，隨 著溫度下降至-18 ，氧化速率開始緩慢下降，-3018 范圍內(nèi)

19、，氧化速率明顯下降；不同冷凍 條件下，溫度越低，對(duì)微生物及酶的抑制作用越 明顯，使氧化作用更緩慢16。2.2 不同冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉殼肌Ca 2+-ATPase活性的影響不同貯藏時(shí)間及不同冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉 殼肌Ca2+-ATPase活性的影響見圖4。(2Sd1) (3Sd1) (80d1) $B2+ 51B TF1(NPM1J1NJOeNH )21.S10.S用10倍物鏡、10倍目鏡進(jìn)行觀察，新鮮海灣 扇貝閉殼肌組織結(jié)構(gòu)見圖5；冷凍樣品貯藏6個(gè)月 后，不同冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉殼肌組織結(jié)構(gòu)的 影響見圖6圖9。圖5 新鮮樣品組織結(jié)構(gòu)001S304S607S 901E圖4 不同貯藏時(shí)間冷凍方式

20、對(duì)海灣扇貝閉殼肌Ca2+-ATPase活性的影響由圖4可以發(fā)現(xiàn)，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，海灣 扇貝閉殼肌的肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性整體 呈下降趨勢(shì)，且下降幅度明顯，且相同冷凍條件 下，貯藏時(shí)間對(duì)海灣扇貝閉殼肌鹽溶性蛋白含量 的影響顯著(p0.05)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，相同貯藏時(shí) 間，液氮處理對(duì)肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性影 響與其他處理間差異顯著(p0.05)，其他3種處理 間差異不顯著。引起海灣扇貝閉殼肌肌原纖維蛋白Ca 2+ - ATPase活性下降的原因很多，可能與凍藏過程中 pH值的下降，組織的機(jī)械損傷及在凍藏過程中蛋 白質(zhì)的結(jié)合水凍結(jié)成冰晶析出，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子 之間形成非

21、共價(jià)鍵，也有可能是巰基氧化形成的 二硫鍵會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白重鏈的聚合，導(dǎo)致蛋白質(zhì) 發(fā)生變性17-19。不同冷凍條件下，液氮冷凍溫度 低，速度快，對(duì)其細(xì)胞破壞越小，蛋白的變性作 用減小，因此，液氮冷凍條件下比其他3種冷凍方 式對(duì)海灣扇貝閉殼肌的肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase 活性影響較小。2.3不同冷凍方式對(duì)海灣扇貝閉殼肌組織結(jié)構(gòu)的 影響圖6 (-251) 冰箱冷凍樣品組織結(jié)構(gòu)圖7 (-351) 冰柜冷凍樣品組織結(jié)構(gòu)圖8 (-801) 超低溫冷凍樣品組織結(jié)構(gòu)圖9 液氮冷凍樣品組織結(jié)構(gòu)由圖6圖9可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過不同冷凍條件， 海灣扇貝閉殼肌的肌肉纖維間有不同程度的間 隙，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，液氮冷凍處理海灣

22、扇貝閉殼肌 肌肉纖維相對(duì)其他3種處理方式組織結(jié)構(gòu)更加完 整，纖維斷裂比較少，與新鮮樣品組織結(jié)構(gòu)更相 近。(-251) 冰箱冷凍、(-351) 冰柜冷凍、 (-801) 超低溫冷凍處理?xiàng)l件下，組織結(jié)構(gòu)都 有不同程度的斷裂、間隙，但差異不大。引起肌肉纖維間隙的原因與凍結(jié)過程中形成 大量冰晶體造成機(jī)械損傷有關(guān)。也可能與凍藏過 程中酶反應(yīng)有關(guān)，氧化三甲胺分解成二甲胺和甲 醛，甲醛與肌肉蛋白質(zhì)形成交聯(lián)，引起質(zhì)構(gòu)的變 化，甚至形成“棉花狀”或“海綿狀”結(jié)構(gòu)的發(fā) 生20。液氮為-196 ，能夠迅速凍結(jié)，形成的冰 晶體體積小，數(shù)量多，對(duì)閉殼肌的組織結(jié)構(gòu)破壞 不大。其他3種處理，冷凍過程相對(duì)緩慢，造成不 同程度

23、的機(jī)械損傷，形成松散的組織結(jié)構(gòu)。3 結(jié)論相同冷凍方式條件下，凍藏時(shí)間對(duì)其TBA值 及肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性影響顯著(p 0.05)；相同凍藏時(shí)間條件下，4種不同的冷凍方式 對(duì)海灣扇貝閉殼肌的TBA值影響差異均顯著(p 0.05)，液氮處理對(duì)肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性 影響與其他處理間差異顯著(p0.05)，其他3種處 理間差異不顯著。4種不同的冷凍方式對(duì)海灣扇貝 閉殼肌肌肉纖維完整性的影響有很大差異。液氮 處理對(duì)海灣扇貝閉殼肌肌肉纖維的影響最小，與 新鮮閉殼肌的結(jié)構(gòu)最相近；(-801) 超低溫冷 凍、(-351) 冰柜冷凍依次次之，(-251) 冰 箱冷凍對(duì)閉殼肌肌

24、肉纖維結(jié)構(gòu)破壞最大。綜合實(shí) 驗(yàn)結(jié)果及生產(chǎn)成本，因此，選擇(-351) 冰柜 冷凍海灣扇貝閉殼肌對(duì)大分子物質(zhì)及組織結(jié)構(gòu)的 變化影響較好。參考文獻(xiàn)：1 Jasper W, Placzek R. In Conservacin de la carne por el fro. Ed Acribia,1980:1312 Berry B W. Changes in quality of all-beef and soy- extended patties as influenced by freezing rate, frozen storage temperature, and storage timeJ

25、. Journal of Food Science,1990,55(4):893-8973 Uttaro B, Aalhus J L. Effect of thawing rate on distribution of an injected salt and phosphate brine in beefJ. Meat Science,2007,65(3):480-4864 關(guān)志強(qiáng),蔣小強(qiáng),李敏,等.冷凍對(duì)波紋巴非蛤蛋白質(zhì)變性 的影響J.水產(chǎn)學(xué)報(bào),2005,29(6):837-8415 張婭楠,趙利,劉華,等.水產(chǎn)品的冷凍變性及魚糜抗凍劑 研究進(jìn)展J.南方水產(chǎn),2011,32(6):88-916 E Muela, C Saudo, M M Campo, et al. Effect of freezing method and frozen storage duration on instrumental quality of lamb throughout displayJ. Meat Science,2010,84:662- 6697 E Muela a, C Saudo a, M M Campo, et al. Effe