細胞內化學組分測

1、細胞內化學組分測定分析技術流式細胞技術流式細胞技術 流式細胞技術流式細胞計基本結構 流式細胞計的基本結構流式細胞計主要由四部分組成。它們是：n流動室和液流系統(tǒng)；n激光源和光學系統(tǒng)；n光電管和檢測系統(tǒng)；n計算機和分析系統(tǒng)。 原理 待測樣品(如細胞、染色體、精子或細菌等)經熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過殼液包圍的進樣管而進入流動室，排成單列的細胞，由流動室的噴嘴噴出而成為細胞液流，并與入射激光束相交。細胞被激發(fā)而產生熒光，由放在與入射的激光束和細胞液流成 90處的光學系統(tǒng)收集之。光學系統(tǒng)中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長。熒光檢測器為光電倍增管。

2、散射光檢測器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細胞大小有關。激光光源光收集系統(tǒng)：濾光片光收集系統(tǒng)：光電倍增管液流系統(tǒng)：流動室、液流驅動系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)facs vantage diva 科研型（大型機）應用舉例 流式細胞術在細胞生物學、分子遺傳學、微生物學、免疫學、分子生物學以及臨床腫瘤學、臨床血液學等諸多領域都有廣泛應用 ：1.在細胞生物學方面的應用 細胞生物學是fcm應用最廣泛也是最基本的領域，細胞周期分析是其基本分析內容之一，而實施的技術途徑是通過測定細胞周期各時相的dna含量來達到的 。 2在免疫學方面的應用： fcm以它的快速、靈活及定量的特點被廣泛地應用于免疫學的基

3、礎研究和臨床應用的各個方面，尤其是結合單克隆抗體技術，在免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫監(jiān)測、機體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現(xiàn)代免疫技術的重要組成部分?；诿庖呒夹g是免疫細胞化學分析技術的基礎，我們著重介紹fcm在免疫應用中的技術問題。 3.在遺傳學研究的應用： 用流式細胞術測定染色體dna含量,可得到染色體頻率分布圖，稱為流式染色體核型分析。同類型染色體出現(xiàn)一個峰，峰的面積代表這種類型染色體的豐度。流式染色體核型分析技術不僅能快速分析核型，而且能分選出不同類型的染色體,做成人類每條染色體的dna文庫，可用于人類基因組研究、遺傳病和癌癥的診斷的研究。

4、4在腫瘤學研究的應用： 腫瘤細胞一般都含有異常數量的 dna。在大多數實體瘤和急性白血病中都發(fā)現(xiàn)有非整倍體的細胞，由于流式細胞術樣品制備方法簡單，測定結果精確，能快速得到有關dna倍性的信息,因而能提供有價值的診斷數據。如果在測量 dna含量的同時，再測定其他參數（如不同類型的中等纖維蛋白，蛋白質含量、細胞大小、核質比等）則可進一步提高診斷的可靠性。 。 此外，流式細胞術在血液學、微生物學、分子生物學等領域中也得到廣泛的應用。 流式細胞術正在向高靈敏、高速度、多參數測量、獲取形態(tài)學信息等方面發(fā)展。 放射自顯影技術 放射自顯影技術是利用感光材料的感光特性，使之感受放射性核素的涉嫌后，通過顯影和定

5、影而得到和標本中偶那個放射性示蹤劑所在部位、強度完全一致的銀粒影像的技術，所得到的圖像稱之為放射自顯影影像。原理 將放射性同位素（如14c和3h）標記的化合物導入生物體內，經過一段時間后，將標本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經一定時間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標本中標記物的準確位置和數量，放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對標記上放射性的化合物進行定位或相對定量測定。 n1.發(fā)射電子： 核乳膠被發(fā)射源帶電粒子作用 負電的鹵素離子中釋放電子 agbr+ ag+br-+e-n離子對形成：當電離離子通過溴化銀晶

6、體時形成許多離子對n3.銀原子形成：溴離子所發(fā)出的電子被帶正電的銀離子所俘獲。e-+ag+ agn4.潛影形成：俘獲電子的過程，是還原過程，很多帶正電的銀原子被還原，在溴化銀分子中形成潛影。n5.顯影、定影形成：顯影：是形成潛影的鹵化銀晶體在顯影過程中被還原成銀鹽顆粒，顯出影像定影：未形成潛影的晶體通過定影而溶解 放射自顯影成像圖片用途 放射自顯影術（radioautography）用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。應用舉例 研究藥物、營養(yǎng)物質、毒物在器官、組織、細胞中的分布、運轉，以及分析其合成、更新、蓄積作用機理等。研究特異性標

7、記前體（如胸腺嘧啶核苷酸dna前體）的滲入部位、特點、影響因素等，探討生物活性分子代謝部位機理。標記抗體或藥物在離體那個同位素標記。標本上顯示抗原或抗體位置，祚定位示蹤。用于核算中堿基程序的檢測原位雜交時其探針用同位素標記。特點定位精確，靈敏度高，分辨率好，能保存相當長時間；操作簡便，無需復雜設備；可供定量研究和雙同位素示蹤；將形態(tài)、機能和代謝地研究統(tǒng)一起來；研究某些大分子在體內地動態(tài)變化過程。 免疫組織化學技術 免疫組織化學技術是用顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項技術。原理 先將組織或細胞中的某些化學物質提取出

8、來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結合，將抗原放大，由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來（常用顯色劑dab顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內發(fā)生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。 n1、免疫熒光方法 是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上

9、熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用比較廣。n2、免疫酶標方法 免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術?；驹硎窍纫悦笜擞浀目贵w與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標技術是目前最常用的技術。 本方法與免疫熒光技術相比的主要優(yōu)點是：定位準確，對

10、比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。n3、免疫膠體金技術 免疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌a蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。 免疫組織化學技術照片用途 組織

11、或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。應用舉例 1 確定細胞類型通過特定抗體標記出細胞內相應抗原成分，以確定細胞類型。如角蛋白是上皮性標記，前列腺特異性抗原僅見于前列腺上皮，甲狀腺球蛋白抗體是甲狀腺濾泡型癌的敏感標記，而降鈣素抗體是甲狀腺髓樣癌的特有標記。有些細胞（如表皮內朗格漢斯細胞、黑色素細胞、淋巴結內指突狀和樹突狀網織細胞）光鏡下不易辨認，但免疫組化標記（s-100蛋白等）能清楚顯示其形態(tài)。2 辨認細胞產物利用某些細胞產物為抗原制備的抗體，可作為相應產物的特殊標記，如內分泌細胞產生的各種激素，

12、大多數可用免疫組化技術標記出來，據此可對內分泌腫瘤作功能分類，檢測分泌異位激素的腫瘤等。 3 了解分化程度大多數標記物都有其特定的分布部位，如上皮細胞膜抗原（ema）著色部位在細胞膜上，但差分化乳癌胞漿內也可出現(xiàn)陽性顆粒；角蛋白的含量也與分化程度有關，低分化或未分化癌含量較低、染色較弱。4 鑒定病變性質通過標記ig輕鏈（、）可區(qū)分部分b細胞性淋巴瘤與b細胞反應性增生，前者常表達單一的ig輕鏈（+/+），后者常為多ig輕鏈（+、+）。而標記bcl-2蛋白在區(qū)別濾泡型淋巴瘤和反應性濾泡增生上有相當的意義。在濾泡型淋巴瘤，90%以上腫瘤性濾泡細胞有bcl-2的高表達；而在濾泡反應性增生時，濾泡反應中

13、心的細胞不表達bcl-2蛋白，而套細胞則表達。n5 發(fā)現(xiàn)微小轉移灶某些癌的早期轉移有時與淋巴結內竇性組織細胞增生不易區(qū)別。用常規(guī)病理組織學方法要在一個組織中認出單個轉移性腫瘤細胞或幾個細胞是不可能的，而采用免疫組化方法（如用上皮性標志）則十分有助于微?。ò┺D移灶的發(fā)現(xiàn)。對轉移性腫瘤也可借助免疫組化標志尋找原發(fā)瘤，如骨組織內有前列腺特異性抗原陽性細胞，提示前列腺癌轉移。n6 探討腫瘤起源或分化表型一些來源不明的腫瘤長期爭論不休，最后通過免疫組化標記取得共識。如顆粒性肌母細胞瘤，曾被認為是肌源性的，但該腫瘤肌源性標記陰性，而神經性標記陽性，證明為神經來源（可能來自神經鞘細胞）。分化很差的腫瘤病理

14、上常按細胞形態(tài)分為梭形細胞腫瘤、小圓細胞腫瘤等，通過多種標記的聯(lián)合應用，也可能確定其來源。n7 確定腫瘤分期判斷腫瘤是原位還是浸潤及有無血管、淋巴管侵襲與腫瘤分期密切相關。用常規(guī)病理方法判斷有時是十分困難的，但用免疫組化法可獲得明確結果。如采用層粘連蛋白和型膠原的單克隆抗體可清楚顯示基底膜的主要成分，一旦證實上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸潤癌了，其預后是不同的。用第八因子相關蛋白、荊豆凝集素等顯示血管和淋巴管內皮細胞的標記物則可清楚顯示腫瘤對血管或淋巴管的浸潤。對許多腫瘤的良惡性鑒別及有無血管或淋巴管浸潤，這是主要的鑒別依據，同時也有治療及預后意義。 特點n1、特異性強 免疫學的基本原理決定了抗原與抗體之間的結合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，lca顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時才會出現(xiàn)交叉反應。n2、敏感性高 在應用免疫組化的起始階段，由于技術上的限制，只有直接法、間