內(nèi)蒙古大學(xué)生物技術(shù) 基因工程大實(shí)驗(yàn)開(kāi)題報(bào)告

1、學(xué)號(hào)00811047 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系基因工程實(shí)驗(yàn)室本科基因工程大實(shí)驗(yàn)開(kāi)題報(bào)告論文題目： 納豆激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建 及在大腸桿菌中的表達(dá) 學(xué)生姓名： 燕孟嬌 年 級(jí)： 2008 專 業(yè)： 生物技術(shù) 指導(dǎo)教師： 蘇慧敏 2011年 8 月7 日學(xué)生姓名張婷民族漢性別女出生年月1990年8月論文題目納豆激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)開(kāi)題時(shí)間2011年8 月1日結(jié)題時(shí)間2011年 8月7 日項(xiàng)目來(lái)源本科生基因工程大實(shí)驗(yàn)課一、立論依據(jù)“納豆激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)”項(xiàng)目的選題和研究的意義，國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)分析，主要參考文獻(xiàn)及出處：納豆激酶(natto

2、kinase簡(jiǎn)稱NK)是一種枯草桿菌蛋白激酶，是在納豆發(fā)酵過(guò)程中由納豆枯草桿菌(Bacillus subtilisl natto)產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶。納豆激酶(NarroKunase，NK)由食品納豆中提取或納豆菌發(fā)酵生產(chǎn)，是一種分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于 UK、SK、tPA的蛋白質(zhì)，并可由腸道，吸收，納豆激酶的體外、體內(nèi)溶栓性質(zhì)通過(guò)實(shí)驗(yàn)也已得到確定，同時(shí)得出納豆激酶的體內(nèi)溶栓活性為纖溶酶的四倍，在體內(nèi)作用迅速、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，還能激活體內(nèi)的tPA，使之溫和、持續(xù)地提高血液的纖溶活性。納豆激酶的物理、生化特點(diǎn)： 1)納豆激酶是在納豆發(fā)酵過(guò)程中由納豆枯草桿菌(Bacillus subtilisl natto

3、)產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶（單鏈多肽酶），分子量為27728道爾頓。 2)納豆激酶在溫度超過(guò)50時(shí)迅速變性失活，但反復(fù)凍融對(duì)其影響不大。 3)納豆激酶在PH值從7升至12時(shí)，10min內(nèi)穩(wěn)定；PH值低于5時(shí)，迅速變性失活。胃酸環(huán)境中的PH值只有1.2到2之間，納豆激酶根本無(wú)法通過(guò)。4)納豆激酶與粘性物質(zhì)混合后，在PH值2-3的酸性環(huán)境中，還能保持不超過(guò)7.5%的活性。 5)納豆激酶是大分子的單鏈多肽酶，可被腸道消化液（糜蛋白酶、胰蛋白酶、小腸液等）分解成氨基酸片段或分子量更小的肽鏈。同其它生物活性物質(zhì)一樣，納豆激酶的分秘表達(dá)受多種因素的影響。納豆激酶基因在體外轉(zhuǎn)錄有兩個(gè)啟動(dòng)位點(diǎn)，之間被15個(gè)核苷

4、酸隔開(kāi)；體內(nèi)轉(zhuǎn)錄也在這兩個(gè)位點(diǎn)或其附近。下游位點(diǎn)(P：)具有一個(gè)獨(dú)特的d”識(shí)別序列。Moran等人對(duì)該基因的d”啟動(dòng)子和其它兩種枯草芽孢桿菌的d”啟動(dòng)子做了比較，比較了它們的保守堿基序列，在一35區(qū)P：?jiǎn)?dòng)子的共有序列為5個(gè)堿基；在一10區(qū)共有序列為8個(gè)堿基兩區(qū)之間被15個(gè)堿基隔開(kāi)。另外兩個(gè)堿基區(qū)可能調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)一個(gè)是在啟動(dòng)子上游35bp處的二分體對(duì)稱區(qū)，另外就是mRNA 上核糖體結(jié)臺(tái)位點(diǎn)，mRNA 上核糖體結(jié)臺(tái)位點(diǎn)序列為：pppAAAAG一0 0 A_0 00 U。 此外在納豆激酶基因的105-336bp處編碼了一段有77個(gè)氨基酸的蛋白肽(pmpeptide)，其有可能參與調(diào)節(jié)納豆激酶的

5、活性。納豆激酶的表達(dá)同其它枯草桿菌蛋白酶一樣受葡萄糖阻遏和被許多SpoO 孢子形成突變株阻斷，另外Cat A、hpr、Scoe突變株位點(diǎn)可以提高其表達(dá)。參考文獻(xiàn)1謝秋玲,孫奮勇,廖美德,張玲,汪炬. 納豆激酶原基因的克隆及表達(dá)J華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2002, (06).2 朱立成,張耀洲. 納豆激酶原核表達(dá)純化及多克隆抗體的制備J浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版), 2006, (04) .3 Hong-Bo Hu,Shan-Jing Yao,Le-He Mei,Zi-Qiang Zhu,Byung-Ki Hur. Partial purification of nattokinase fr

6、om Bacillus subtilis by expanded bed adsorptionJ Biotechnology Letters, 2000,22, (17) .4 付利，楊志興.納豆激酶的研究與應(yīng)用J,生物工程進(jìn)展.1995,15(15):46-49.5陳麗娟,沙長(zhǎng)青,任永春等.納豆激酶溶解血栓機(jī)制J,中國(guó)生物工程雜志,2003,23(4):53-56.6 丁貴平,蔡正森,王正剛.納豆激酶的分離純化及生化研究J,氨基酸和生物資源,2001,23(3):13-16.7 閆達(dá)中，許芳，李潔.納豆激酶基因克隆及其在大腸桿菌中活性表達(dá)研究J,湖北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2003,25(1

7、):69-72.8 NaKamura T, Yamagata Y, Ichishima E J. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN of Bacillus Subtilis(natto)J.Biosci Biotech Biochem,1992, 56(11):1869-1871.二、實(shí)驗(yàn)方案1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題：1.1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：、PCR擴(kuò)增NK。、將NK PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T連接成過(guò)渡質(zhì)粒。、連接pET-trx與NK，構(gòu)建表達(dá)載體pET-trx-NK。、轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE

8、3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、SDS-PAGE鑒定。1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：、學(xué)習(xí)基因工程的基本研究方法。、熟悉基因工程常規(guī)儀器的使用。、培養(yǎng)基因工程研究的嚴(yán)密邏輯和科學(xué)理念。、建立做好原始實(shí)驗(yàn)記錄的習(xí)慣。1.3擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題：、PCR擴(kuò)增NK。、過(guò)渡質(zhì)粒以及表達(dá)載體的構(gòu)建。、感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化。、在E. coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)NK。、SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白。2 實(shí)驗(yàn)思路、方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析：2.1、實(shí)驗(yàn)思路及方法：2.1.1、PCR擴(kuò)增NKPCR引物： NK 上游 5-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3 BamH I NK 下游 5-GAAT

9、TCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3 EcoR I PCR產(chǎn)物大?。?37bpPCR條件:94變性30s，60 退火30s，72 延伸30 s2.1.2、NK的亞克隆將NK PCR產(chǎn)物與pMD19-T連接過(guò)夜，構(gòu)建pMD19-T-NK過(guò)渡質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)入DH5感受態(tài)菌中。2.1.3、表達(dá)載體的構(gòu)建EcoRI和BamHI雙酶切pMD19-T-NK過(guò)渡質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-trx，回收NK片段和pET-trx，連接pET-trx與NK，構(gòu)建表達(dá)載體pET-trx-NK。2.1.4、誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白將pET-trx-NK轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并用

10、SDS-PAGE鑒定。2.2、技術(shù)路線提質(zhì)粒pMD1-T-NK、pET-trx。PDU/PDLpMD19-TPCR擴(kuò)增NKpET-trxpMD19-T-NKEcoRI和BamHINKpET-trx連接連接pET-trx-NKDH5a感受態(tài)菌pET-trx-NKBL21(DE3)感受態(tài)菌BL21(DE3)感受態(tài)菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE檢測(cè)3. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)度（10天之內(nèi)）：第一天下午：講解儀器，發(fā)放移液器等，滅菌（搖菌試管、培養(yǎng)皿），搖pET-trx、pMD18T-NK,配置培養(yǎng)基第二天上午：提質(zhì)粒pET-trx、pMD18T-NK下午：PCR擴(kuò)增NK，與pMD19-T連接過(guò)夜；倒平板，要D

11、H5第三天上午：作感受態(tài)DH5，EcoRI和BamHI雙酶切pET-trx下午：pMD19-T-NK連接液轉(zhuǎn)化DH5涂板；回收pET-trx第四天上午：七點(diǎn)挑pMD19-T-NK平板克隆，搖菌8-10h下午：七點(diǎn)提質(zhì)粒pMD19-T-NK第五天上午：EcoRI和BamHI雙酶切pMD19-T-NK驗(yàn)證；回收NK下午：NK與pET-trx連接過(guò)夜第六天上午：七點(diǎn)pET-trx-NK連接液轉(zhuǎn)化DH5，涂板下午：挑pET-trx-NK克隆，搖菌；搖BL21第七天上午：做感受態(tài)BL21,提質(zhì)粒pET-trx-NK下午：Hind酶切驗(yàn)證；轉(zhuǎn)化BL21，涂板過(guò)夜第八天上午：七點(diǎn)搖菌（包括空BL21）；練習(xí)

12、組裝SDS電泳模具下午：OD600=0.5時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)3h，離心集菌第九天上午：灌膠加樣電泳2-3h，染色45min,脫色下午：觀察脫色膠，轉(zhuǎn)入清水，照相4. 預(yù)期實(shí)驗(yàn)成果：SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)可觀測(cè)到大小約為33-40KD的蛋白質(zhì)大量表達(dá)。5. 曾參與與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)的學(xué)習(xí)和研究工作積累以及已取得的工作成績(jī)：（學(xué)過(guò)基因工程課程、讀過(guò)相關(guān)的文獻(xiàn)、寫(xiě)過(guò)有關(guān)的綜述、參加過(guò)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或研究課題、獲得過(guò)相關(guān)的學(xué)術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)情況等）曾學(xué)過(guò)基因工程等相關(guān)課程。6. 請(qǐng)運(yùn)用已學(xué)過(guò)的課堂知識(shí)結(jié)合看過(guò)的有關(guān)研究文獻(xiàn)，提一個(gè)你認(rèn)為適合本科生基因工程實(shí)驗(yàn)課教學(xué)的基因工程大實(shí)驗(yàn)方案DREB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)干旱、高鹽和低鹽下逆境誘導(dǎo)基因表達(dá)起重要作用。本方案擬將DREB