分光光度法檢測蛋白質(zhì)含量PPT精選課件精選干貨

1、分光光度法檢測蛋白質(zhì)含量（ppt精選課件)2生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗 實驗室規(guī)則實驗室規(guī)則 實驗室安全及防護(hù)實驗室安全及防護(hù) 實驗室常用玻璃儀器實驗室常用玻璃儀器 實驗考試實驗考試3提前提前5 5分鐘到實驗室，不能遲到、早退、曠課，每遲到、早退分鐘到實驗室，不能遲到、早退、曠課，每遲到、早退一一次扣次扣1 1分，每曠課一次扣分，每曠課一次扣5 5分分。禁止在實驗室內(nèi)吃食品禁止在實驗室內(nèi)吃食品，如有違反者按遲到處理。，如有違反者按遲到處理。上課上課必須穿隔離衣必須穿隔離衣，不能穿拖鞋和吊帶背心，否則禁止進(jìn)入實驗，不能穿拖鞋和吊帶背心，否則禁止進(jìn)入實驗室。室。實驗期間實驗期

2、間手機(jī)必須設(shè)置在振動上手機(jī)必須設(shè)置在振動上，上課期間如急需接、打電話請，上課期間如急需接、打電話請到走廊上處理。到走廊上處理。在實驗室內(nèi)要保持安靜，不得嬉鬧、大聲說話。在實驗室內(nèi)要保持安靜，不得嬉鬧、大聲說話。認(rèn)真預(yù)習(xí)認(rèn)真預(yù)習(xí)認(rèn)真做實驗認(rèn)真做實驗養(yǎng)成良好的實驗習(xí)慣（實驗中、實驗結(jié)束后）養(yǎng)成良好的實驗習(xí)慣（實驗中、實驗結(jié)束后）值日生工作值日生工作4 預(yù)防火災(zāi)預(yù)防火災(zāi) 預(yù)防中毒預(yù)防中毒 外傷外傷5 吸量管吸量管* * * *( (示教示教) ) 試管試管 燒杯燒杯 量筒量筒67 實驗報告采取實驗報告采取網(wǎng)上提交網(wǎng)上提交的方式，實驗報告提交時間設(shè)定為的方式，實驗報告提交時間設(shè)定為3 3天天，即本次，

3、即本次實驗結(jié)束后第三天晚上實驗結(jié)束后第三天晚上1212點(diǎn)之前提交，點(diǎn)之前提交，過期無法再提交，本次實驗報告過期無法再提交，本次實驗報告則記為則記為0 0分分。 盡早提交報告盡早提交報告，不要等到最后期限，有時系統(tǒng)不穩(wěn)定，可能提交不上去。，不要等到最后期限，有時系統(tǒng)不穩(wěn)定，可能提交不上去。 直接將報告粘貼在框中直接將報告粘貼在框中，切記，切記不要以附件方式上傳不要以附件方式上傳，否則有可能文件打，否則有可能文件打不開，影響成績。不開，影響成績。 不要相互抄襲不要相互抄襲，一旦，一旦發(fā)現(xiàn)雷同卷則均記為發(fā)現(xiàn)雷同卷則均記為0 0分分。 若過期沒有提交報告，不要將報告發(fā)到老師郵箱，發(fā)也沒用，最終實驗若過

4、期沒有提交報告，不要將報告發(fā)到老師郵箱，發(fā)也沒用，最終實驗報告成績只記系統(tǒng)導(dǎo)出的成績。報告成績只記系統(tǒng)導(dǎo)出的成績。8實驗一實驗一分光光度技術(shù)及蛋白含量測定分光光度技術(shù)及蛋白含量測定9 理論理論 掌握分光光度技術(shù)的基本原理掌握分光光度技術(shù)的基本原理 了解分光光度計的基本構(gòu)造了解分光光度計的基本構(gòu)造 實驗實驗: : 利用分光光度技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定利用分光光度技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定 1. 1.雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量 2.2.考馬斯亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量考馬斯亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量 3. 3.紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量 10 一、概念一、概念

5、 利用物質(zhì)特有的利用物質(zhì)特有的吸收光譜吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定來鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項技術(shù)其含量的一項技術(shù) 。 應(yīng)用：應(yīng)用：定性、定量定性、定量 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高靈敏度高 精確度高精確度高 操作簡便、快速操作簡便、快速 n 分光光度技術(shù)（分光光度技術(shù)（spectrophotography）11二、工作原理二、工作原理v物質(zhì)對光線有選擇性吸收作用。物質(zhì)對光線有選擇性吸收作用。v每種物質(zhì)都具有其特征性的吸收光譜。每種物質(zhì)都具有其特征性的吸收光譜。v在一定條件下，物質(zhì)對光的吸收程度與該物質(zhì)在一定條件下，物質(zhì)對光的吸收程度與該物質(zhì) 的濃度成正比。的濃度成正比。 分光光度法所使用的光譜范圍：分光

6、光度法所使用的光譜范圍： 200nm 10m 200 400nm 400 760nm 760 10m 紫外光區(qū)紫外光區(qū) 可見光區(qū)可見光區(qū) 紅外光區(qū)紅外光區(qū)12如何定性？如何定性？ 利用利用吸收光譜曲線吸收光譜曲線鑒定化合物鑒定化合物 吸吸 光光 度度13 1.1.朗伯朗伯（lambert）定律定律 一束單色光通過一光吸收介質(zhì)時，其光強(qiáng)度隨吸收光介質(zhì)的一束單色光通過一光吸收介質(zhì)時，其光強(qiáng)度隨吸收光介質(zhì)的厚度厚度增增加呈指數(shù)減少。加呈指數(shù)減少。 i1/i0=e-k1l2.2.比爾比爾（beer）定律定律 一束單色光通過一光吸收介質(zhì)時，其光強(qiáng)度隨吸收光介質(zhì)的一束單色光通過一光吸收介質(zhì)時，其光強(qiáng)度隨吸

7、收光介質(zhì)的濃度濃度的增加呈指數(shù)減少。的增加呈指數(shù)減少。 i1/i0=e-k2c i i0 0 : :入射光強(qiáng)度；入射光強(qiáng)度； i i : :透射光強(qiáng)度；透射光強(qiáng)度；l l ：介質(zhì)厚度：介質(zhì)厚度 c c ：介質(zhì)濃度：介質(zhì)濃度如何定量？如何定量？ lambert-beer定律定律* * * *14 3.lambert - beer定律定律* 154.4.計算計算* * * *（1 1）標(biāo)準(zhǔn)管法標(biāo)準(zhǔn)管法（標(biāo)準(zhǔn)比較法）（標(biāo)準(zhǔn)比較法） 實際測定過程中，用一實際測定過程中，用一已知濃度已知濃度的測定物按測的測定物按測定管同樣處理顯色，讀出吸光度，再根據(jù)前式計算。定管同樣處理顯色，讀出吸光度，再根據(jù)前式計算

8、。 a標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)= =標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)c標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)l標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) a樣品樣品= =樣品樣品c樣品樣品l樣品樣品 a：吸光度；：吸光度； ：摩爾吸光度；：摩爾吸光度； c：溶液濃度；：溶液濃度； l：液層厚度：液層厚度16 因標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液中溶質(zhì)為同一物質(zhì)，因標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液中溶質(zhì)為同一物質(zhì)， 樣品樣品= 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) 因盛標(biāo)準(zhǔn)液和測定液的比色杯徑長相同因盛標(biāo)準(zhǔn)液和測定液的比色杯徑長相同 l樣品樣品=l標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) 故上二式可寫成：故上二式可寫成： a標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)/a樣品樣品= 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)c標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)l標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)/樣品樣品c樣品樣品l樣品樣品 c樣品樣品=a樣品樣品/a標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) c標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)17（2 2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 繪制

9、標(biāo)準(zhǔn)曲線：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制配制一系列已知不同濃度一系列已知不同濃度的測定物溶液，按測定管同樣方法的測定物溶液，按測定管同樣方法處理顯色，分別讀取各管吸光度。以溶液濃度為橫座標(biāo)，吸處理顯色，分別讀取各管吸光度。以溶液濃度為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)，在方格座標(biāo)紙上作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。光度為縱座標(biāo)，在方格座標(biāo)紙上作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。獲取樣品的濃度：根據(jù)測得樣品的吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲取樣品的濃度：根據(jù)測得樣品的吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得測定物的濃度。獲得測定物的濃度。 濃度吸光度18標(biāo)準(zhǔn)曲線使用注意事項標(biāo)準(zhǔn)曲線使用注意事項v標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在測定濃度的一半到二倍之間。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在測定濃度的一半到二倍之間。v吸光

10、度在吸光度在0.051.0范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。v所作標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供短期使用。所作標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供短期使用。v標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測定管測定應(yīng)在同一臺儀器上進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測定管測定應(yīng)在同一臺儀器上進(jìn)行，避免誤差產(chǎn)生。避免誤差產(chǎn)生。195應(yīng)用中注意的問題應(yīng)用中注意的問題* * * *v lambert-beers law的偏離：該定律只適應(yīng)于一定濃度的偏離：該定律只適應(yīng)于一定濃度范圍，范圍，a宜在宜在0.051.0之間之間；v 選擇波長：選擇波長：最大吸收波長最大吸收波長； a.靈敏；靈敏；b.避免雜質(zhì)干擾避免雜質(zhì)干擾v 參比溶液（空白管）參比溶液（空白管）：消除背景效應(yīng)，：消除背景效應(yīng)，應(yīng)包含除待測溶應(yīng)包

11、含除待測溶質(zhì)以外所有的成分。質(zhì)以外所有的成分。20 空白管：空白管： 測量過程中，因比色皿本身和溶劑也會產(chǎn)生一定的測量過程中，因比色皿本身和溶劑也會產(chǎn)生一定的光吸收，故設(shè)置一個光吸收，故設(shè)置一個空白管空白管，即其中除了待測溶質(zhì)以外，即其中除了待測溶質(zhì)以外，其它的成分完全相同。其它的成分完全相同。 測量時，首先以空白管對準(zhǔn)光路對儀器測量時，首先以空白管對準(zhǔn)光路對儀器調(diào)零調(diào)零，既消，既消除比色皿本身對光的吸收，又消除了非待測物對光的吸除比色皿本身對光的吸收，又消除了非待測物對光的吸收，所測值即為待測物造成的光吸收。收，所測值即為待測物造成的光吸收。21n 分光光度計分光光度計(spectropho

12、tometer)一基本部件一基本部件單色器光源狹縫吸收池檢測系統(tǒng)、測量裝置鎢燈氫燈棱鏡光柵比色皿/比色池2223 二 、分光光度計使用步驟（示教）分光光度計使用步驟（示教） 三、使用時注意事項三、使用時注意事項* * * 1. 波長波長選擇。選擇。 2. 機(jī)器機(jī)器預(yù)熱預(yù)熱。 3. 不測量時，應(yīng)使樣品室蓋處于開啟狀態(tài)不測量時，應(yīng)使樣品室蓋處于開啟狀態(tài)，否，否則會使光電管疲勞。則會使光電管疲勞。 4. 不應(yīng)把成有不應(yīng)把成有腐蝕性液體腐蝕性液體的比色皿放在儀器表的比色皿放在儀器表面。面。24 5. 比色皿使用注意事項比色皿使用注意事項* * * *v 由于紫外光不能透過玻璃比色皿，由于紫外光不能透過

13、玻璃比色皿，紫外光區(qū)紫外光區(qū)測測量時要量時要用石英比色皿用石英比色皿。v 同組使用的比色皿必須配套（規(guī)格、新舊程度同組使用的比色皿必須配套（規(guī)格、新舊程度一致）。一致）。v 比色皿有比色皿有2 2光面與光面與2 2毛面，光學(xué)表面對準(zhǔn)光路，毛面，光學(xué)表面對準(zhǔn)光路，不能有任何污損，不能有任何污損，否則會引起光吸收的增加。否則會引起光吸收的增加。25v 比色皿中所盛溶液比色皿中所盛溶液不能太少不能太少，也，也不能太多不能太多，一，一般所盛液體約占全部容積的般所盛液體約占全部容積的2/32/3。v 腐蝕性溶液不得長期盛放在比色皿中。腐蝕性溶液不得長期盛放在比色皿中。v 每次使用后每次使用后, ,應(yīng)立即

14、倒空或以吸液泵吸干，然后應(yīng)立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水沖洗比色皿用水沖洗比色皿3 34 4次。次。 * * 本次實驗，考馬斯亮藍(lán)可使玻璃比色皿著本次實驗，考馬斯亮藍(lán)可使玻璃比色皿著色，酒精浸泡后清洗。色，酒精浸泡后清洗。26蛋白質(zhì)定量分析實驗蛋白質(zhì)定量分析實驗 實驗一實驗一 雙縮脲法雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量 （p50p50） 實驗三實驗三 考馬斯亮蘭結(jié)合法考馬斯亮蘭結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量（測定蛋白質(zhì)含量（p52p52） 實驗四實驗四 紫外分光光度法紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量 （p53p53）27 實驗一實驗一 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量【基本原理

15、基本原理】 蛋白質(zhì)分子中含有許多蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)類似肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)類似，在堿性在堿性溶液中能與銅離子結(jié)合成溶液中能與銅離子結(jié)合成紫色紫色的化合物的化合物（稱雙縮脲反應(yīng)）。（稱雙縮脲反應(yīng)）。 在一定濃度范圍，在一定濃度范圍，顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可故可用比色法測定蛋白質(zhì)的含量。用比色法測定蛋白質(zhì)的含量。 含有兩個以上肽鍵的物質(zhì)才有此反應(yīng)，故氨基酸無此反應(yīng)。含有兩個以上肽鍵的物質(zhì)才有此反應(yīng)，故氨基酸無此反應(yīng)。 雙縮脲法的靈敏度為雙縮脲法的靈敏度為1-20mg1-20mg。28試試 劑劑 （mlml） 1 1 2 2 3 3 4 4 5

16、 5 6 6標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.10.10.30.30.50.50.70.70.90.9生理鹽水生理鹽水0.90.90.70.70.50.50.30.30.10.11.01.0雙縮脲試劑雙縮脲試劑4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0 2 2混合混合后，于后，于3737水浴水浴中放置中放置1515分鐘，在分鐘，在540nm540nm波長波長下比色，以下比色，以 第第6 6管管調(diào)零，測得各管的吸光度值。以各管的吸光度值為縱調(diào)零，測得各管的吸光度值。以各管的吸光度值為縱 座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪成曲線。座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪成曲線。29（二）

17、樣品測定：（二）樣品測定： 取樣品取樣品0.1ml0.1ml，加生理鹽水，加生理鹽水0.9m10.9m1，再加雙縮脲試劑，再加雙縮脲試劑4m14m1，于，于3737水浴中放置水浴中放置1515分鐘，測其吸光度，根據(jù)吸光度值分鐘，測其吸光度，根據(jù)吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算得出查標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算得出樣品中蛋白質(zhì)的濃度。樣品中蛋白質(zhì)的濃度。 注意：注意：v雙縮脲法的靈敏度為雙縮脲法的靈敏度為1-20mg1-20mg，取蛋白標(biāo)準(zhǔn)液時注意濃度。，取蛋白標(biāo)準(zhǔn)液時注意濃度。v實驗時，實驗時， 樣品管可與標(biāo)準(zhǔn)管同時處理樣品管可與標(biāo)準(zhǔn)管同時處理30【基本原理基本原理】 考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭g-250存在著兩種不同的

18、顏色形式，紅色和藍(lán)存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)可通過范德華力結(jié)合，與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色色。它和蛋白質(zhì)可通過范德華力結(jié)合，與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，最大吸收峰從由紅色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，最大吸收峰從465nm變成變成595nm，能過測，能過測定定595nm處的光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。處的光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，靈敏度高，1-5g；測定速度快；干擾物質(zhì)少。；測定速度快；干擾物質(zhì)少。 311取試管取試管3 3支，編號按下表操作支，編號按下表操作 試試 劑（劑（mlml） 空白空白 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)本標(biāo)本 生理鹽水生理鹽水 0.1 0

19、.1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(50ug(50ugml) 0.1 ml) 0.1 樣樣 品品 0.1 0.1 考馬斯亮藍(lán)試劑考馬斯亮藍(lán)試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.02.2.混勻，放置混勻，放置5 5分鐘，在波長分鐘，在波長595nm595nm處，以空白管調(diào)處，以空白管調(diào)“0 0”，測測定各管的吸光度。定各管的吸光度。【操作步驟操作步驟】323. 計算計算 a標(biāo)本標(biāo)本/a標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) 50 （g/ml） = 樣品中蛋白質(zhì)的含量樣品中蛋白質(zhì)的含量（g/ml） 注意：注意：蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度50 g/ml33實驗四實驗四 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含

20、量【基本原理基本原理】 由于蛋白質(zhì)分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族由于蛋白質(zhì)分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收氨基酸，因而蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在高峰在280nm280nm波長波長處。由于各種蛋白質(zhì)所含芳香族氨處。由于各種蛋白質(zhì)所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波長范圍內(nèi)，吸收峰基酸的量相差很少，因此在此波長范圍內(nèi)，吸收峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系，可作定量測定。的光密度值與其濃度成正比關(guān)系，可作定量測定。 靈敏度：靈敏度：50-10050-100g g34【操作步驟操作步驟】（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（一）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 1. 1.取試管取試管6 6支，編號，按下表操作。支，編號，按下表操作。 試劑（試劑（mlml） 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 生理鹽水生理鹽水 3.5 3.0 2.5