蛋白質純化技術 - Lite

1、蛋白質的分離純化與鑒定蛋白質的分離純化與鑒定Isolation, Purification and Identification of Protein分子生物學圣經分子生物學圣經分子克隆實驗指南分子克隆實驗指南為什么要純化蛋白質？為什么要純化蛋白質？理論意義：理論意義：深入研究某種蛋白質的功能深入研究某種蛋白質的功能以及作用機制，如信號通路中的蛋白以及作用機制，如信號通路中的蛋白質質應用價值應用價值-蛋白質工程蛋白質工程 醫(yī)藥、工業(yè)、科研醫(yī)藥、工業(yè)、科研 作為藥物靶點作為藥物靶點蛋白質是生命功能的執(zhí)行者蛋白質是生命功能的執(zhí)行者蛋白質工程中進行蛋白質純化的必要性蛋白質工程中進行蛋白質純化的必要性

2、 首先，需要單一的蛋白質作為實驗材料，首先，需要單一的蛋白質作為實驗材料，研究其結構與功能研究其結構與功能； 其次，其次，對蛋白質進行修飾改造對蛋白質進行修飾改造時需要單時需要單一的蛋白質作為原材料；一的蛋白質作為原材料； 最后，為了生產性能更優(yōu)良的蛋白質，最后，為了生產性能更優(yōu)良的蛋白質，需要對設計改造過的蛋白質進行大量純需要對設計改造過的蛋白質進行大量純化，從而化，從而開發(fā)出相關產品開發(fā)出相關產品。本章概要本章概要蛋白質純化方法蛋白質純化方法蛋白質純化原則蛋白質純化原則純化步驟純化步驟蛋白質的鑒定蛋白質的鑒定一、蛋白純化方法一、蛋白純化方法蛋白質純化的根據(jù)：蛋白質純化的根據(jù)： 不同的蛋白質

3、，理化性質不同。不同的蛋白質，理化性質不同。理化性質不同的原因：理化性質不同的原因： 氨基酸的數(shù)目和序列不同。氨基酸的數(shù)目和序列不同。1.與蛋白質分離純化相關的理化特性與蛋白質分離純化相關的理化特性分子大小分子大小分子形狀分子形狀帶電特性帶電特性溶解特性溶解特性與配體特異性結合不同與配體特異性結合不同吸附性質吸附性質變性和復性變性和復性1.1分子大小分子大小蛋白質分子大小主要取決于：蛋白質分子大小主要取決于： 蛋白質肽鏈的數(shù)目蛋白質肽鏈的數(shù)目 每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。幾百幾百百萬百萬 Da常用方法常用方法 透析透析 超濾超濾 凝膠過濾凝膠過濾 離心離心 透析透析(d

4、ialysis)利用利用透析袋透析袋把大把大分子蛋白質與小分子蛋白質與小分子化合物分開分子化合物分開的方法。的方法。 超濾法超濾法 應用應用正壓或離心力正壓或離心力使蛋白質溶液透過使蛋白質溶液透過有一定截留分子量有一定截留分子量的超濾膜的超濾膜，達到濃，達到濃縮蛋白質溶液的目縮蛋白質溶液的目的。的。 超濾法超濾法 應用應用正壓或離心力正壓或離心力使蛋白質溶液透過使蛋白質溶液透過有一定截留分子量有一定截留分子量的超濾膜的超濾膜，達到濃，達到濃縮蛋白質溶液的目縮蛋白質溶液的目的。的。凝膠過濾凝膠過濾 是按照天然蛋白質是按照天然蛋白質相對分子相對分子質量大小質量大小進行分離的技術，又稱進行分離的技術

5、，又稱為為分子篩層析或排阻層析分子篩層析或排阻層析。 超速離心超速離心離心離心（centrifugation）：利用機械的快速：利用機械的快速旋轉所產生的離心力，將不同密度的物旋轉所產生的離心力，將不同密度的物質分離開來的方法。質分離開來的方法。 超速離心法超速離心法 (ultracentrifugation)：60萬萬 g ， 6萬萬8萬萬 r/min?？捎脕頊y定蛋白質分子?？捎脕頊y定蛋白質分子量。量。超速離心超速離心1.2分子形狀分子形狀形狀形狀 蛋白質在蛋白質在離心離心通過溶液時，或通過通過溶液時，或通過膜膜、凝凝膠過濾填料顆粒膠過濾填料顆?；蚧螂娪灸z電泳凝膠中時，都會受中時，都會受到

6、分子形狀的影響。到分子形狀的影響。方法方法 梯度離心梯度離心 電泳電泳1.3電荷電荷原理原理蛋白質的凈電荷與蛋白質蛋白質的凈電荷與蛋白質等電點等電點pI以以及及環(huán)境環(huán)境pH值值有關（有關（pHpI，），）方法方法電泳電泳離子交換層析離子交換層析1.4溶解度溶解度原理原理 蛋白質分子表面蛋白質分子表面親水性和疏水性帶電基團親水性和疏水性帶電基團不同不同，因此在溶劑中的溶解度不同。，因此在溶劑中的溶解度不同。 通過通過改變改變pH、離子強度離子強度或或加入有機試劑加入有機試劑，促進蛋白質分子的凝聚進而形成沉淀。促進蛋白質分子的凝聚進而形成沉淀。方法：沉淀法方法：沉淀法 鹽析法（鹽析法（eg. 硫酸

7、銨）硫酸銨） 有機溶劑沉淀法（有機溶劑沉淀法（eg. 丙酮）丙酮） 等電點沉淀法等電點沉淀法 蛋白質在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出，蛋白質在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出，稱為稱為鹽析。鹽析。 鹽析原理：鹽析原理： 高濃度鹽離子破壞蛋白質高濃度鹽離子破壞蛋白質分子表面的水化分子表面的水化膜膜，影響蛋白質，影響蛋白質分子表面所帶電荷分子表面所帶電荷，從而，從而引起蛋白質沉淀，但通常不會引起蛋白質引起蛋白質沉淀，但通常不會引起蛋白質的變性。的變性。鹽析法鹽析法1.5配體特異性結合配體特異性結合 原理原理 生物大分子的某些特定結構區(qū)域能夠生物大分子的某些特定結構區(qū)域能夠特異性識特異性識別其他分子別其他

8、分子并并可逆結合可逆結合，生物分子間的這種結，生物分子間的這種結合能力稱為合能力稱為親和力親和力。 方法方法 將具有親和力的兩個分子中的一個固定在不溶將具有親和力的兩個分子中的一個固定在不溶性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性基質上，利用分子間親和力的特異性和可逆性對另一個分子進行分離純化。性對另一個分子進行分離純化。 分類分類 免疫親和層析免疫親和層析 生物親和層析生物親和層析 金屬螯合親和層析金屬螯合親和層析1.6吸附性質吸附性質 原理原理 蛋白質可吸附在不同材料的表面，如金屬、蛋白質可吸附在不同材料的表面，如金屬、陶瓷、塑料等。陶瓷、塑料等。 方法方法 疏水層析疏水層析1.7變性和

9、復性變性和復性 原理原理 變性：變性：蛋白質在一定的理化條件下會失去原有蛋白質在一定的理化條件下會失去原有的空間結構、生物學功能及部分理化特性。的空間結構、生物學功能及部分理化特性。 復性：復性：當變性條件去除后恢復原有的空間結構當變性條件去除后恢復原有的空間結構及生物學功能。及生物學功能。 方法方法 如，利用尿素的變性和復性方法，從包涵體中如，利用尿素的變性和復性方法，從包涵體中純化原核表達蛋白純化原核表達蛋白2. 分離方法分離方法在實驗操作上，分為：在實驗操作上，分為：沉淀法沉淀法離心法離心法電泳法電泳法超濾法超濾法相分配法相分配法層析法層析法* *不可能有一套統(tǒng)一的方法適用于分離純不可能

10、有一套統(tǒng)一的方法適用于分離純化所有的蛋白質，化所有的蛋白質，* *但每一種蛋白質但每一種蛋白質可能可能都有一套適合的分都有一套適合的分離純化程序，離純化程序，* *而且所用的主要技術手段都基本相同。而且所用的主要技術手段都基本相同。Note二、蛋白質純化的總原則和純化步驟二、蛋白質純化的總原則和純化步驟總原則總原則以合理的效率、速度、收率和純度，以合理的效率、速度、收率和純度，將目標蛋白從細胞的全部其他成分，將目標蛋白從細胞的全部其他成分，特別是從雜蛋白中分離出來，特別是從雜蛋白中分離出來，同時仍保留其生物學活性和化學完整同時仍保留其生物學活性和化學完整性。性。二、蛋白質純化的總原則和純化步驟

11、二、蛋白質純化的總原則和純化步驟步驟步驟選擇實驗材料，實驗材料預處理選擇實驗材料，實驗材料預處理蛋白質的提取蛋白質的提取蛋白質的粗分級蛋白質的粗分級蛋白質的細分級蛋白質的細分級蛋白質的鑒定蛋白質的鑒定 蛋白質純化的前期準備蛋白質純化的前期準備 關于蛋白質我們已知什么？關于蛋白質我們已知什么？最好的來源？最好的來源？蛋白質純度要求？活性要求？蛋白質純度要求？活性要求？純化蛋白的量？純化蛋白的量？如何進行鑒定？如何進行鑒定？純化時間長短？純化時間長短？最終花費？最終花費？純化方案？純化方案？1、選擇實驗材料及預處理、選擇實驗材料及預處理選擇實驗材料選擇實驗材料 物種的選擇物種的選擇 組織的選擇組織

12、的選擇實驗材料預處理實驗材料預處理 液體材料液體材料過濾過濾離心離心 固體材料固體材料洗滌：自來水洗滌：自來水蒸餾水蒸餾水提取緩沖液提取緩沖液材料破碎：材料破碎：材料破碎材料破碎機械剪碎機械剪碎研磨研磨反復凍融法反復凍融法超聲破碎法超聲破碎法高壓勻漿法高壓勻漿法酶解法酶解法2、蛋白質的提取、蛋白質的提取提取分離原則提取分離原則 盡可能多地提取目的蛋白，同時避免活性盡可能多地提取目的蛋白，同時避免活性丟失丟失（溫度過高、（溫度過高、 pH、有機試劑、金屬、有機試劑、金屬離子、蛋白酶等因素）離子、蛋白酶等因素） 選擇合適的選擇合適的pH、選擇合適的離子強度、選擇合適的離子強度2、蛋白質的提取、蛋白

13、質的提取 提取液成分的確定提取液成分的確定 pH 緩沖液：緩沖液：Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, 檸檬檸檬酸酸-檸檬酸鈉檸檬酸鈉 離子：離子：動物動物 NaCl, 植物植物KCl 還原劑還原劑:DTT 蛋白酶抑制劑：蛋白酶抑制劑：EDTA, PMSF 金屬離子螯合劑金屬離子螯合劑: EDTA, EGTA去污劑去污劑:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20甘油甘油 溫度溫度 043、蛋白質的粗分級（粗提）、蛋白質的粗分級（粗提） 使用蛋白質提取緩沖液提取實驗材料后，使用蛋白質提取緩沖液提取實驗材料后，蛋白提取液中目標蛋白質的濃度往往較低，蛋

14、白提取液中目標蛋白質的濃度往往較低，采取一些簡單的方法采取一些簡單的方法使目標蛋白質濃縮，使目標蛋白質濃縮，同時去除大量的雜質同時去除大量的雜質。 常用的實驗技術：常用的實驗技術：沉淀法（鹽析、有機溶沉淀法（鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀）、超速離心、透析、劑沉淀、等電點沉淀）、超速離心、透析、超濾超濾4、蛋白質的細分級、蛋白質的細分級 粗分級只是使蛋白質得到濃縮和初步分離粗分級只是使蛋白質得到濃縮和初步分離純化，多數(shù)情況下純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質分子大還要根據(jù)蛋白質分子大小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電狀況進一步純化狀況進一步純化。 常用的實驗技

15、術：常用的實驗技術：層析層析4.1. 層析層析（ chromatography ）固定相：凝膠固定相：凝膠流動相：緩沖液流動相：緩沖液原理：原理：BioGelA agaroseBioGel P acrylamideSephadex glucose (dextrose)Sepharose agaroseSephacryl glucose + acrylamideSephacel cellulose 層析裝置層析裝置（Chromatographic equipment）蠕動泵蠕動泵層析柱層析柱檢測器檢測器記錄儀記錄儀部分收集器部分收集器 4.1. 層析層析（ chromatography ） 分子

16、篩層析分子篩層析（ Gel filtration ） 離子交換層析離子交換層析（ Ion exchange ） 疏水作用層析疏水作用層析（ Hydrophobic interaction ） 親和層析親和層析（ Affinity ）4.1.1 分子篩層析分子篩層析 （Gel filtration） 原理原理 也稱為凝膠過濾、排阻層析。是以也稱為凝膠過濾、排阻層析。是以多孔凝膠多孔凝膠材材料為支持物，當?shù)鞍踪|溶液流經此支持物時，料為支持物，當?shù)鞍踪|溶液流經此支持物時，分子大小不同分子大小不同的蛋白質所受到的的蛋白質所受到的阻滯作用不同阻滯作用不同而而先后流出先后流出，從而達到分離純化的目的。，從

17、而達到分離純化的目的。 凝膠介質凝膠介質 葡聚糖葡聚糖 （glucose） 瓊脂糖瓊脂糖 （agarose） 聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（acrylamide） 纖維素（纖維素（cellulose）分子篩層析分子篩層析Gel filtration chromatographyHydrophilicNo spontaneous binding to proteins.Chemically and physically stableRigid to allow a high linear flow-rate親水親水對蛋白質親和力低對蛋白質親和力低物理化學性質穩(wěn)定物理化學性質穩(wěn)定流速穩(wěn)定流速穩(wěn)定分子篩層

18、析分子篩層析Gel filtration chromatography分子篩層析分子篩層析Gel filtration chromatography分子篩層析分子篩層析Gel filtration chromatography4.1.2 離子交換層析離子交換層析（ Ion exchange ）原理原理 在一定的在一定的pH條件下，不同的蛋白質帶有條件下，不同的蛋白質帶有的的電荷的種類和數(shù)量不同電荷的種類和數(shù)量不同，因此它們，因此它們與帶與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。 利用蛋白質和帶電凝膠之間作用力的差別，利用蛋白質和帶電凝膠之間作用力的差別，把蛋白質分開

19、的層析方法。把蛋白質分開的層析方法。4.1.2 離子交換層析離子交換層析（ Ion exchange ）種類種類 陽離子交換柱陽離子交換柱：凝膠帶負電荷，蛋白質帶：凝膠帶負電荷，蛋白質帶正電荷正電荷 陰離子交換柱陰離子交換柱：凝膠帶正電荷，蛋白質帶：凝膠帶正電荷，蛋白質帶負電荷負電荷介質介質 惰性支持物惰性支持物：瓊脂糖，葡聚糖：瓊脂糖，葡聚糖 帶電基團帶電基團：羧甲基：羧甲基帶負電；二乙基氨帶負電；二乙基氨基基帶正電帶正電 平衡離子平衡離子： 負電基團：負電基團：H+或或Na+ 正電基團：正電基團：OH-或或Cl-離子交換層析離子交換層析（ Ion exchange ）陽離子交換：陽離子交換

20、：陰離子陰離子 先，先，陽離子陽離子 后后陰離子交換：陰離子交換：陽離子陽離子 先，先，陰離子陰離子 后后4.1.3 親和層析親和層析（Affinity chromatography）原理原理 利用利用蛋白質與配體專一性識別并結合蛋白質與配體專一性識別并結合的特的特性而分離蛋白質的一種層析方法。性而分離蛋白質的一種層析方法。 將配體固定于支持物上，當混合樣品流過將配體固定于支持物上，當混合樣品流過此支持物時，此支持物時，只有目標蛋白能與配體專一只有目標蛋白能與配體專一性結合性結合。先用緩沖液洗脫雜蛋白，然后改。先用緩沖液洗脫雜蛋白，然后改變洗脫條件，將目標蛋白洗脫下來。變洗脫條件，將目標蛋白洗

21、脫下來。親和層析親和層析（Affinity chromatography）His-親合示意圖（親合示意圖（金屬螯合層析金屬螯合層析） 鎳柱（鎳柱（Ni-NTA）4.1.4 疏水作用層析疏水作用層析 原理原理 蛋白質表面疏水基團與介質疏蛋白質表面疏水基團與介質疏水配體的可逆相互作用水配體的可逆相互作用 方法方法 高離子強度下待分離的樣品吸高離子強度下待分離的樣品吸附在疏水介質上，然后降低離附在疏水介質上，然后降低離子強度選擇性將樣品解吸，子強度選擇性將樣品解吸，疏疏水弱的物質先洗脫，疏水強的水弱的物質先洗脫，疏水強的物質后洗脫物質后洗脫。4.2.電泳電泳（ Electrophoresis ） 電

22、泳就是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電泳就是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動。電性相反的電極移動。蛋白質常用電泳技術蛋白質常用電泳技術 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 等電聚焦電泳等電聚焦電泳（ Isoelectric focusing- IEF） 雙向電泳雙向電泳（ Two Dimensional Electrophoresis ）4.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS： 1、覆蓋蛋白質表面電荷，消除電荷差異、覆蓋蛋白質表面電荷，消除電荷差異 2、改變蛋白質分子構象，消

23、除形狀差異、改變蛋白質分子構象，消除形狀差異電泳法測目標蛋白的分子量電泳法測目標蛋白的分子量4.2.2不連續(xù)不連續(xù)PAGE分離蛋白質的原理分離蛋白質的原理 在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，所帶電荷、分子大小在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，所帶電荷、分子大小和形狀不同的蛋白質在凝膠中能夠被分離。和形狀不同的蛋白質在凝膠中能夠被分離。 原理原理 電荷效應電荷效應 濃縮效應濃縮效應快慢離子效應快慢離子效應凝膠濃度差效應凝膠濃度差效應 分子篩效應分子篩效應4.2.3 等電聚焦電泳等電聚焦電泳（Isoelectric focusingIEF）等電聚焦等電聚焦（Isoelectric focusing）4.2.4 雙向電泳雙向電

24、泳 第一向：等電聚焦第一向：等電聚焦 （pI） 第二向：第二向：SDS-PAGE (MW) 雙向電泳技術是雙向電泳技術是蛋白質組學蛋白質組學研究中蛋白質多研究中蛋白質多肽鏈分離純化和鑒定的主要實驗技術之一。肽鏈分離純化和鑒定的主要實驗技術之一。Isoelectric focusingSDS gel electrophoresisTwo Dimensional Electrophoresis of E. coli Proteins - more than 2,000 proteins were visualized蛋白質純化策略蛋白質純化策略方案設計篇方案設計篇Proteinpurificati

25、onstrategy三、純化方案設計原則三、純化方案設計原則確定純化目標確定純化目標purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性to simplify technique selection and optimisation確定活性測定方法確定活性測定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time,

26、 combine steps logically確定純化目標確定純化目標三、純化方案設計原則三、純化方案設計原則確定目標確定目標purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性to simplify technique selection and optimisation確定活性測定方法確定活性測定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yi

27、eld and increase time, combine steps logically三、純化方案設計原則三、純化方案設計原則確定目標確定目標purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性to simplify technique selection and optimisation確定活性測定方法確定活性測定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps

28、 reduce yield and increase time, combine steps logically 嚴格依據(jù)目標蛋白質的嚴格依據(jù)目標蛋白質的特殊生物學性質特殊生物學性質，來，來設計活性檢測方案設計活性檢測方案 常見檢測方法常見檢測方法: 酶學檢測酶學檢測 enzymatic assays. 配體檢測配體檢測 ligand-binding assays 免疫檢測免疫檢測 immunological assays活性測定方法的要求：快速、簡便、特異和定量活性測定方法的要求：快速、簡便、特異和定量確定活性檢測方法確定活性檢測方法三、純化方案設計原則三、純化方案設計原則確定目標確定目標p

29、urity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性充分了解目的蛋白及主要雜質的理化特性to simplify technique selection and optimisation確定活性測定方法確定活性測定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟 純化

30、步驟越多，樣品損失越大（產量、活性）純化步驟越多，樣品損失越大（產量、活性） 減少每步操作時間減少每步操作時間 to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing recovery 減少添加物減少添加物 additives may need to be removed in an extra purification step or may interfere with activity assays 早期除去降解物（如蛋白酶）早期除去降解物（如蛋白酶） for example, proteases 每步使用不同的純化

31、方法每步使用不同的純化方法 to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobicity, ligand specificity)KEEP IT SIMPLE!盡量減少純化步驟盡量減少純化步驟四、蛋白質的鑒定四、蛋白質的鑒定 1. 濃度測定：濃度測定：凱氏定氮法、紫外吸收法凱氏定氮法、紫外吸收法 2. 純度測定：純度測定：電泳法電泳法 3. 特性測定：特性測定： 蛋白質分子質量與等電點的測定蛋白質分子質量與等電點的測定 氨基酸組成及順序分析氨基酸組成及順序分析 蛋白質結晶與結構分析蛋白質結晶與結構分析 蛋白質活性及功能測定蛋白質活性及功能測定1 濃度測定濃度測定凱氏定氮法凱氏定氮法紫外吸收法紫外吸收法分光光度法分光光度法考馬斯亮藍法考馬斯亮藍法1 濃度測定濃度測定凱氏定氮法：凱氏定氮法： 蛋白質平均含氮量為蛋白質平均含氮量為16，首先測定氮的，首先測定氮的含量，進而估算蛋白質的含量。含量