完整版WesternBlot免疫印跡法實(shí)驗(yàn)方法步驟

1、Western Blot(免疫卬跡法)實(shí)驗(yàn)方法步驟發(fā)布日期：2008-8-25熱門指數(shù)：4360Western Blot(免疫印跡法)主耍包括以下4個(gè)廉本步9軋n樣品制備n電泳分離n蛋白的般轉(zhuǎn)移n免疫朵交與顯色一一蛋口臉測涪液和試劑n 1X璘酸鹽緩沖液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCI: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40:1% :Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCI: 150 mM :EDTA: 1 mM :PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml e

2、ach :Na3VO4:1 mM ;NaF: 1 mMn 1XSDS樣品緩沖液62.5 mM Tris-HCI (pH 6.8 于 25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v 渙酚藍(lán)n 轉(zhuǎn)移緩沖液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸，20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris 緩沖鹽 UBS)準(zhǔn)備 1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCI;用 1NHCI 調(diào) pH 為 7.6n 脫脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T緩沖液1XTBS, 0.1%Tween-20)TBS/T封閉緩

3、沖液(n1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% w/v 脫脂奶粉或 BSAn 抗的稀釋1XTBS, 0.1% Tween-20力【I 5% BSA (多抗)或5%脫脂奶粉(單抗)Note: 一股來說,BSA被推薦用于多克隆抗體脫脂奶粉用于單克隆抗體.這樣可得到較高的倍噪比?？贵w的稀釋度參 考抗體說明書或根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定.n 預(yù)染的蛋口質(zhì)Marker.可用芳監(jiān)測轉(zhuǎn)膜的效率樣品制備原始樣詁可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋口.以下為定性檢測目的蛋Cl時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法. 其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)1 培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。2. 棄培養(yǎng)基.用1XPBS漂洗細(xì)胞2次.去盡殘

4、留培養(yǎng)基。2 plate, 500-1000 ul/M)100 ul/w 或 75 cm.刮落細(xì)胞.轉(zhuǎn)樣品緩沖液 3加入 1X SDS(6well plate,移到Ep管。注意：冰上操作，4. 超聲10-15秒阿切DNA以誠低樣品粘性。5點(diǎn)沸樣品5 minutes6.離心12000g,5min.取上淸。7電泳分離：上樣 15uk20 ul 至 SDS-PAGE 膠(10cm x 10cm)電泳.72 flask）裂cells/100 mm dish/150 cm如耍定雖檢測某蛋口的表達(dá)水平應(yīng)用RIPA裂解液（1 ml per 10解細(xì)胞收集裂解液至離心管中.在振蕩器上泯勻4伽in. 14000

5、g離心伽in （46 棄沉淀，用Bradford法或 其它蛋白質(zhì)測定方法測定上清中蛋 以調(diào)整上禪體積和I樣此進(jìn)行Western雜交時(shí)還需、 ；照，通常用 beta-actin,注意：一般上樣20-30 ug己足夠.如待檢蛋門為低豐度蛋G可加大上樣雖至100 ug.但電泳條帶易拖電可制備 亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測方法。電泳分離（翁照SDS-PAGE電泳方法轉(zhuǎn)膜朵交膜的選擇是決定Western blot M的垂耍壞節(jié)：應(yīng)根據(jù)雜交方案.彼轉(zhuǎn)移蛋口的待性以及分子大小等因索.選擇介 適材質(zhì).孔徑和規(guī)格的朵交膜用于Western blot的膜主要有兩種:硝酸纖維素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印

6、 跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物.在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下.大弱數(shù)帶負(fù)電荷的蛋口質(zhì)會(huì)與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的 結(jié)合在一起.但在非離子型的去污劑作用下.結(jié)合的蛋門還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋門分子址大小.選擇不冋孔徑的NC朕。因?yàn)殡S若膜孔徑的不斷蔽小膜對(duì)低分子址蛋口的 結(jié)合就越牢固通常用0.45mm和0,2um兩種規(guī)格的NC販 大于20kD的蛋白可用0.45 p m的膜.小T20kD的蛋 白就騏用0.2um的膜了.如用0.45um的膜就會(huì)發(fā)生"Blowthrough"的現(xiàn)紀(jì)PVDF膜靈敏度.分辨率和蛋口親和 力比常規(guī)的膜耍臥 非常適合于低分子址蛋口的檢測，但PVDF膜在使用

7、Z前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。蛋口質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主耍有葫種：憎式漫轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易.轉(zhuǎn)移效率高：而后者適用T大膠的蛋口轉(zhuǎn)移. 所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。注意：如檢測小分子蛋口.可省賂此步.因小分子蛋口容易擴(kuò)故出膠：2. 依據(jù)膠的大小眄取膜和沌紙6片放入轉(zhuǎn)，10minll|j PVDF膜需用純甲豚浸泡飽和35秒鐘。3. 裝配轉(zhuǎn)移溯治：海綿？3層濾紙?膠？膜?3層濾紙?海綿每從放好后用試管趕去氣泡。切記：膠放于負(fù)極面 （黑色面）.4. 將轉(zhuǎn)移IfijK r冰浴中放入三明治（黑色面對(duì)黑色面人加轉(zhuǎn)移緩沖液插上電極.100V. 1h

8、（電流約為0.3A）。 注總：應(yīng)再次檢査三明治和電極是否裝配正確電源是否接通°5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后.切斷電源，取出朵交膜spongeWhatmanfilter81*haUraspongewhitE COblaGk （）免疫朵交與昭色1用25 ml TBS洗膜5min,室蟲搖動(dòng)。2. 置膜于25 ml封閉緩沖液中1h,室溫.揺動(dòng)。3. 15mlTBS/T 洗 3 次 <5min/T）o4加入合適稀釋度的一抗.室溫娜育12h或4 C過夜.緩慢揺動(dòng)&5. 15 ml TBS/T 洗3次（5min/T）。6. 加入合適稀釋度的Itt性磷酸的（AP）或規(guī)很過氣化陽（HRP）標(biāo)記的二抗

9、.室溫孵育1h緩慢搖動(dòng)。）< mirVT5 次（3洗TBS/Tml 15 . 7.8. 15 ml TBS 洗 1 次。9. 蛋白檢測（顯色法或發(fā)光法.按相賊試劑說明操作）。注意事項(xiàng)：1. 操作中戴手套,不要用手融膜。2. PVDF膜在甲醇中浸泡時(shí)間不耍超過5杪。3. 如臉測小F 20kD的蛋口應(yīng)用0.2 u m的膜.并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。4. 某些抗廉和抗體町被Tween-20洗脫.此時(shí)可用1.0% BSA代替Tween20°5. 關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBSorPBS:能和某些抗原相互作用.掩濫抗體結(jié)合能力：0.3-3%BSAin PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。6. 如用0.1%