基因工程期末復(fù)習(xí)

1、基 因 工 程第一章：1.基因工程：在分子水平上進行的遺傳操作，指將一種或多種生物體的基因或基因組提取出來，或者人工合成的基因，按照人們的愿望進行嚴密的設(shè)計，經(jīng)過體外加工重組，轉(zhuǎn)移到另一種生物體的細胞內(nèi)，使之能在受體細胞遺傳并獲得新的遺傳性狀的技術(shù)。 供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。(工具酶也是必備元件)基本用途：大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)，設(shè)計、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種。2.基因工程研究的主要內(nèi)容：目的基因的分離與制備，DNA片段和載體的連接，外源DNA片段引入受體細胞，選擇目的基因，目的基因表達。3.基因工程的意義：大規(guī)模生產(chǎn)生物分子，設(shè)計構(gòu)建新物種，搜尋、分離和鑒定生物體。

2、發(fā)展前景：農(nóng)林牧漁業(yè)中的應(yīng)用，工業(yè)中的應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。第二章：（結(jié)合課本劃線內(nèi)容）1.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能：識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈，主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵；（發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象：寄主細胞的限制和修飾作用。）hsd R：編碼限制性核酸內(nèi)切酶，hsd M：編碼限制性甲基化酶，hsd S：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達。（限制核酸內(nèi)切酶類型：I型，II型，III型；）2. 屬名 種名 株名Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌d株 先后分離出3種限制酶：HindI HindII HindIII，EcoRI在抗

3、藥性R質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的第一個酶。同尾酶：識別不同的序列，能產(chǎn)生相同的黏性末端的酶；同位酶：不同微生物來源的酶，能識別相同的序列，切割方式相同或不相同。3.II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式：在識別序列的對稱軸上同時切割形成平末端如EcoRV;在識別序列的雙側(cè)末端進行切割，若于對稱軸5端突出的末端如EcoRI;反之產(chǎn)生3端突出的末端如PstI。限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的注意事項：限制性核酸內(nèi)切酶為濃縮酶；濃縮的酶液要用核酸內(nèi)切酶緩沖液稀釋，（不能用水稀釋，以免酶變性）；核酸內(nèi)切酶在含有50%甘油的緩沖液中，于-20度穩(wěn)定保存；反應(yīng)中盡可能少加水，使反應(yīng)體積減到最小；延長反應(yīng)時間，使所需酶量減少。影響限制性

4、核酸內(nèi)切酶活性的因素：DNA樣品的純度；DNA樣品的甲基化程度；核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)；4.DNA連接酶基本性質(zhì)：修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵；修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵；連接多個平頭雙鏈DNA分子。（注意：DNA連接酶所連接的是DNA分子上相鄰核苷酸之間的切口，即Nick鏈接，不能鏈接兩條單鏈DNA或環(huán)化的單鏈DNA分子。） DNA連接酶的種類：T4噬菌體DNA連接酶（最常用）、大腸桿菌DNA連接酶（最常見）、T4噬菌體RNA連接酶。5.DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶 I的基本性質(zhì)：53的DNA聚合酶活性；53的核酸外切酶活性；35的核酸外切酶活性。用途：主要

5、用于雜交探針的制備。切口平移法是目前實驗室中最常用的一種脫氧核糖核酸探針標記法。Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶；Klenow酶仍擁有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5粘性末端；DNA片段的同位素末端標記；cDNA第二鏈的合成；雙脫氧末端終止法測定DNA序列。T4-DNA酶的基本特性：53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性；在無dNTP時，可以從任何3-OH端外切；在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止；在

6、四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位。T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3粘性末端（注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多）；DNA片段的同位素末端標記。反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈；雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈6.核酸酶:單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII），大腸桿菌的核酸外切酶VII反應(yīng)不需要Mg2+。 雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII），大腸桿菌的核酸外切酶 III 特異性地從3 端外切。單、雙鏈核酸外切酶：l 核酸外切酶（ lExo），l核酸外切酶特異性地從5 端外切。 單鏈核酸內(nèi)切

7、酶：S1核酸酶，來自稻谷曲霉菌。基本特性：降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍，降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍，是降解單鏈RNA的核酸內(nèi)切酶，反應(yīng)條件：Zn2+必需，最適pH范圍為4.0 - 4.3，需要NaCl 10 - 300 mM。S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA。單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶，來自艾氏交替單胞菌?；居猛荆赫T發(fā)DNA突變。 核酸修飾酶：末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT），來自小牛胸腺。基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPs。堿性磷酸單酯酶：來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP），來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（

8、BAP）?；居猛荆捍呋怂岱肿拥拿摿鬃饔茫笵NA或RNA的5磷酸變?yōu)?-OH末端，防止載體的自身環(huán)化。T4-PNP（T4噬菌體多核苷酸激酶）的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷，用于探針的末端同位素標記。7.如何防止載體自身環(huán)化作用？答：使用堿性磷酸酶處理，去除其5末端的磷酸基團，這樣載體DNA分子的兩個黏性末端發(fā)生退火互補，失去了鏈接能力，不能形成共價環(huán)化結(jié)構(gòu)，這種分子是不穩(wěn)定的，在連接部位容易解鏈形成開環(huán)的線性分子，通過堿性磷酸酶預(yù)處理線性載體，提高插入片段的用量，可以有效防止載體自身環(huán)化。第三章1.在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫載

9、體?；蚬こ虒d體的要求：在宿主細胞內(nèi)能獨立復(fù)制，有選擇性標記，有一段多克隆位點。，外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制，分子量小，拷貝數(shù)多，容易從宿主細胞中分離純化。載體的種類：質(zhì)粒、單鏈DNA噬菌體M13、 l噬菌體的衍生物 2.質(zhì)粒:是獨立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞中。質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性:分子?。?-200kb）、編碼基因少、環(huán)形狀（雙鏈環(huán)狀DNA）。質(zhì)粒的空間構(gòu)型： 共價閉合環(huán)狀DNA（ccDNA)即SC構(gòu)型， 開環(huán)DNA（ocDNA）即OC構(gòu)型， 線形DNA （lDNA）。同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：sc

10、DNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。質(zhì)粒的基本特征：質(zhì)粒的自主復(fù)制性，質(zhì)粒的不相容性，質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性，攜帶特殊的遺傳標記。（拷貝數(shù)：細胞內(nèi)質(zhì)粒/染色體數(shù)）反應(yīng)質(zhì)粒復(fù)制的強度。質(zhì)粒獨立復(fù)制的三個特性：在宿主細胞內(nèi)，單向，由自主和宿主細胞雙重遺傳控制。質(zhì)粒的類型：（1）接合型質(zhì)粒：如：F質(zhì)粒。除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。在天然條件下，能從一個細胞自行轉(zhuǎn)移到另一個細胞，大部分屬于嚴緊型質(zhì)粒。（2）2. 非接合型質(zhì)粒：如R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）、Col質(zhì)粒。雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個細胞

11、轉(zhuǎn)移到另一個細胞。在天然條件下不能自己轉(zhuǎn)移到另一個細胞中。大部分屬于松弛型質(zhì)粒，符合基因工程的安全要求。注：基因工程中所用的非接合型質(zhì)粒載體缺乏轉(zhuǎn)移所必須的mob基因，所以不能發(fā)生自我轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒的復(fù)制類型：1. 嚴緊型質(zhì)粒：拷貝數(shù)少，只有13份拷貝。2. 松弛型質(zhì)粒：拷貝數(shù)多，有1060份拷貝。3理想質(zhì)粒載體的必備條件：常見可用于基因工程的天然質(zhì)粒有pSC101、CoLEl。第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒是pSC101，是一個嚴緊型質(zhì)粒，每個宿主細胞僅有1-2個拷貝，具有多個限制性核酸內(nèi)切酶的單一酶切位點；另一個天然質(zhì)粒載體是CoLEl，它唯一單酶切位點EcoRI位于大腸桿菌素EI的編碼基因內(nèi)。

12、質(zhì)粒載體必須具備的基本條件：（1）具有復(fù)制起點；（2）具有抗菌素抗性基因；（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點；（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。多克隆位點：指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點的DNA片段?？咕乜剐?氨芐青霉素抗性(殺死生長的細菌)，卡那霉素抗性（殺死細菌），四環(huán)素抗性(殺死生長的細菌)，鏈霉素抗性（殺死細菌），氯霉素抗性（殺死生長的細菌）。3.重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體：（1）pBR322：松弛型復(fù)制、氯霉素可擴增、拷貝數(shù) 50 - 100 / cell、用于基因克隆。（2）pUC18 / 19：拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell、裝有多克隆

13、位點（MCS）正選擇顏色標記 lacZ、用于基因克隆和測序。注：pUC7是最早構(gòu)建的一種PUC質(zhì)粒載體。pGEM-3Z：多拷貝、裝有多克隆位點（MCS）、正選擇顏色標記 lacZ、用于外源基因的高效表達。 克隆載體：指專用于基因或DNA片段無性繁殖的質(zhì)體載體。（名詞解釋）4.容菌周期（裂解周期）：感染細菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。容原性周期：感染細菌后，將自己的DNA整合到細菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化。5.單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13、f1、fd 噬菌體。特點：單鏈DNA；復(fù)制型（RF）是雙

14、鏈環(huán)狀DNA；RF DNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑；不存在包裝限制；可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片 斷的單鏈分子，便于作探針或測序。（1） M13 噬菌體基本特性：寄主；DNA長度：6407bp；DNA提純：容易提取；沒有包裝限制。優(yōu)點：（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2） Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇（3）無包裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。缺點：插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降。人工染色體：酵母人工染色體（YAC）、細菌人工染色體（BAC）、P1派生人工染色體、哺乳動物人工染色體（MAC）。第四章1.基因組DNA提取方法：

15、堿抽提法（最常用）、煮沸法、去污劑裂解法。堿抽提法提取質(zhì)粒DNA原理：閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復(fù)性快，染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟：溶菌；破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性；中和；離心除去沉淀；純化DNA；沉淀DNA。所用的試劑作用： 溶菌酶：能水解菌體細胞壁的肽聚糖中的b-1，4糖苷鍵 葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓EDTA：Mg2+、Ca 2+的螯合劑，抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解NaOH-SDS：NaOH使DNA雙鏈變性，SDS溶解細胞

16、膜蛋白和細胞內(nèi)蛋白，使蛋白質(zhì)變性沉淀 NaAc-HAc緩沖液：用來中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性 乙醇:用于沉淀DNA RNase A:降解RNA渣滓 TE緩沖液: DNA保存液 酚-氯仿: 蛋白變性劑,使蛋白質(zhì)沉淀。2.影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素：受體菌株；質(zhì)?？截悢?shù)；質(zhì)粒大小。(1).細菌基因組DNA的制備:（1）細胞裂解（2）DNA純化（3）沉淀DNA(2) 哺乳動物細胞基因組DNA的抽提:（1）組織粉碎（2）細胞裂解（3）純化DNA（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染。（3）.從植物組織中制備 DNA：（1）組織粉碎（2）細胞裂解（3）純化DNA（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染。-

17、（了解看看）3.DNA的定量和純度測定：核酸在波長260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)的最大吸收峰在280nm。（注:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快， 線性分子次之， 伸展開環(huán)狀最慢）4.瓊脂糖凝膠電泳:瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）,空隙大小決定其分辨分子大小的能力,空隙小，分辨率高，空隙大，分辨率低。聚丙烯酰胺凝膠電泳：優(yōu)點是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。瓊脂糖凝膠電泳：100050000bp。聚丙烯酰胺凝膠電泳：11000bp基因擴增技術(shù)-PCR技術(shù)；通過加熱或變性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA稱

18、為DNA變性；解除變性條件后，變性的單鏈可以重新結(jié)合起來，形成雙鏈，稱DNA復(fù)性。（退火） 應(yīng)用：核酸的基礎(chǔ)研究 、序列分析、轉(zhuǎn)基因檢測。 第五章1.目的基因：準備要分離、改造、擴增或表達的基因?；蚪MDNA片斷化：限制性內(nèi)切酶法、隨機片斷化、機械切割法。化學(xué)合成目的基因：（常用的方法）磷酸二酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法。2.基因文庫：將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細胞中保存和擴增。構(gòu)建基因文庫的載體選用：（常用的載體）l載體系列：容量為 24 kp cosmid載體： 容量為 50 kb YAC：容量為1 Mb?；?/p>

19、文庫構(gòu)建的一般步驟：染色體DNA大片段的制備；載體與基因組DNA大片段的連接；3.基因組文庫的大?。篘=ln(1-p)/ln(1-f) N為重組子數(shù)量；p為所需要的概率；f為分離基因片段與該生物基因組大小的比值。 （了解）4. 構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟：總RNA（total RNA）提??；mRNA的分離純化；cDNA的合成。 cDNA文庫：利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增。cDNA文庫的特點：不含內(nèi)含子序列?？梢栽诩毦兄苯颖磉_。包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建。cDNA文庫的大小:N=ln(1-p)/(1

20、-1/n) N為克隆數(shù)；P為要求的概率；1/n為低豐度mRNA在總RNA中所占的比例。 （了解）第六章1.DNA片段的體外連接：粘性末端的連接、齊平末端（blunt end）的連接、（DNA接頭連接法：DNA連接子法、DNA接頭法）2.DNA體外連接應(yīng)注意的事項：插入片斷與載體的酶切位點互補（注：相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進行非粘性末端連接。用相同的酶切。用同尾酶切。）；DNA插入的方向正確；插入基因的開放閱讀框（ORF）正確；防止載體自身環(huán)化連接。（方法：提高插入片斷的用量；用堿性磷酸酶處理載體。）3.感受態(tài)細胞：受體細胞處于外源DNA的狀態(tài)。 制備原理：一般用0

21、.01-0.05mol/l氯化鈣處理受體細胞，增大細胞的通透性。感受態(tài)大腸桿菌的制備:培養(yǎng)大腸桿菌、OD600至0.3-0.4、On ice 5-10 min、4離心收集菌、On ice 30 min、用冰冷的60mMCaCl2重懸、4離心收集菌、用冰冷的60mMCaCl2重懸、4離心收集菌、用冰冷的60mMCaCl2重懸、分裝、-70 凍存。外源DNA導(dǎo)入細菌的幾種方法:轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)。 轉(zhuǎn)化方法：熱休克法、電轉(zhuǎn)化法。4. 影響轉(zhuǎn)化率的因素：重組質(zhì)粒、感受態(tài)細胞、外源基因?qū)胝婧思毎阂?、?dǎo)入酵母細胞：1. 菌株選擇；2. 酵母的轉(zhuǎn)化方法：（1）利用原生質(zhì)球進行轉(zhuǎn)化、（2）利用Li+鹽進行

22、轉(zhuǎn)化；3.導(dǎo)入植物細胞方法：葉盤法、電擊法；4.導(dǎo)入哺乳動物細胞方法：磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體載體法、顯微注射法。（了解）5.如果在轉(zhuǎn)化實驗中，對照組不該長出菌落的平板長出了菌落，這種現(xiàn)象說明實驗可能存在哪些問題？ 答：倒平板時培養(yǎng)基溫度過高，加入的氨芐青霉素會失效；抗生素添加的量太少，濃度不夠；培養(yǎng)平板滅菌不徹底，存在雜菌污染；培養(yǎng)平板上的部分菌株未轉(zhuǎn)化成功；感受態(tài)細胞受到污染；培養(yǎng)時間過長，可能出現(xiàn)衛(wèi)星菌落等等。6.基因工程上游工程操作技術(shù)：細菌的培養(yǎng)、染色體DNA的提取、凝膠電泳確認、PCR擴增反應(yīng)（提純、再次電泳確認）、PCR產(chǎn)物酶切過夜、PCR/ER產(chǎn)物電泳過程純化。PBBSK/DH5轉(zhuǎn)

23、化子培養(yǎng)、PBBSK質(zhì)粒提取、質(zhì)粒的電泳、PBBSK/ER產(chǎn)物、PBBSK/ER產(chǎn)物電泳。 兩個步驟結(jié)合連接、轉(zhuǎn)化、平板培養(yǎng)、篩選，鑒定重組子1 基因工程操作的三大基本元件是【】I 供體 II 受體 III 載體 IV 抗體 V 配體 I + II + III I + III + IV II + III + IV II + IV + V III + IV + V 2 根據(jù)當今生命科學(xué)理論，基因工程的用途是【 】 I 分離純化基因 II 大量生產(chǎn)生物分子 III 構(gòu)建新型物種 IV 提高基因重組效率 I + II + III I + II + IV I + III + IV II + III +

24、 IV I + II + III + IV 3 基因工程的三大理論基石是【 】 經(jīng)典遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)、微生物學(xué) 分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生化工程學(xué) 動物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué) 生物化學(xué)、生化工程學(xué)、化學(xué)工程學(xué) 生理學(xué)、仿生學(xué)、免疫學(xué) 4 根據(jù)基因工程的定義，下列各名詞中不能替代基因工程的是【 】 基因誘變 分子克隆 DNA重組 遺傳工程 基因無性繁殖 5 基因工程的單元操作順序是【 】 增，轉(zhuǎn)，檢，切，接 切，接，轉(zhuǎn)，增，檢 接，轉(zhuǎn)，增，檢，切 檢，切，接，增，轉(zhuǎn) 切，接，增，轉(zhuǎn)，檢 6 生物工程的上游技術(shù)是【 】 基因工程及分離工程 基因工程及發(fā)酵工程 基因工程及酶工程 基因工程及細胞工程

25、基因工程及蛋白質(zhì)工程 7 基因工程作為一種技術(shù)誕生于【 】 上世紀 50 年代初 上世紀 60 年代初 上世紀 70 年代初 上世紀 80 年代初 上世紀 90 年代初 8 利用基因工程擴增基因是依據(jù)【 】 基因定向重排 強化啟動基因 增強子重組 SD 順序的存在 載體自主復(fù)制 9 第一個由重組大腸桿菌生產(chǎn)的人類蛋白（多肽）藥物是【 】 生長激素（Growth hormone） 胰島素（Insulin） 干擾素（Interferon） 白細胞間溶菌素（Interleukin） 生長激素釋放抑制素（Somatostatin） 10 下列有關(guān)基因的敘述，錯誤的是【 】 蛋白質(zhì)是基因表達的唯一產(chǎn)物

26、基因是 DNA 鏈上具有編碼功能的片段 基因也可以是 RNA 基因突變不一定導(dǎo)致其表達產(chǎn)物改變結(jié)構(gòu) 基因具有方向性。AEBAB A第九章1.重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細胞。 轉(zhuǎn)化子：指導(dǎo)入外源DNA后獲得了新的遺傳標志的細菌細胞。 重組子的篩選方法：直接篩選（DNA鑒定、載體篩選）、間接篩選（翻譯產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）。具體方法：抗藥性標記插入失活、B-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法。B-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法原理：載體上有一段b-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的a片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點。 受體菌基因組中有突變的b-半乳糖苷酶基因（ a片段缺失）。可以被IPTG誘導(dǎo)表達。 載體和

27、受體菌基因組可以互補形成完整有功能的b-半乳糖苷酶。(了解看看)乳糖 半乳糖+ 葡萄糖Xgal 半乳糖 + 5-溴-4-氯靛藍（深藍色） 注：反應(yīng)條件為B-半乳糖苷酶。注：由互補產(chǎn)生的lac+細菌較易識別，它在X-gal的存在下被IPTG誘導(dǎo)形成藍色菌落。假陽性：如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)并且沒有中止密碼。2. 一個攜帶有氨芐青霉素和卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒，被僅在卡那霉素基因中有識別位點的EcoR I消化。消化物與酵母DNA片段連接后轉(zhuǎn)化對氨芐青霉素和卡那霉素兩種抗生素都敏感的E coli菌株。 （1) 利用哪一種抗生素抗性選擇接受了質(zhì)粒的細胞? （2) 怎樣區(qū)分接受了插入酵母DNA的

28、質(zhì)粒的克隆? 答：（1）氨芐青霉素。 （2）轉(zhuǎn)化后涂在只加氨芐青霉素的平板上，將這個平板上的菌落轉(zhuǎn)到加卡那霉素的平板上，將兩個平板對照，選擇只在氨芐青霉素的平板上生長的菌落，即為插入酵母DNA的質(zhì)粒的克隆。3.  以pBR322 DNA作為載體，從四環(huán)素抗性基因區(qū)克隆外源DNA時，可采用環(huán)絲氨酸富集法篩選重組體，說明其基本原理和基本操作過程。答：原理：由于四環(huán)素的作用只是抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，而不是殺死細菌；而氨基酸類似物環(huán)絲氨酸如果摻人蛋白質(zhì)，則是致命的。因此在有四環(huán)素的條件下，環(huán)絲氨酸能夠殺死tetr而不殺死tets的細菌。經(jīng)過環(huán)絲氨酸處理后，存活的細胞中tets型得到很大富集，

29、而經(jīng)過若干次連續(xù)處理，即能獲得在tetr基因內(nèi)含有插人物的質(zhì)粒的細胞?；静僮鳎?1)轉(zhuǎn)化后有三種表型的細菌，其中只有一種是重組體：AprTcs；(2)用重組DNA轉(zhuǎn)化受體菌后，將受體菌培養(yǎng)在加有四環(huán)素和環(huán)絲氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)；此時只有非重組的雙抗性菌可以生長，其他都被抑制；(3)由于有環(huán)絲氨酸的存在，AprTcs表型的菌生長到一定程度就會死亡；(4)由于四環(huán)素只有抑菌而無殺菌作用，此時若解除四環(huán)素(離心洗滌)，加入氨基芐青霉素繼續(xù)培養(yǎng)，則可使重組體大量生長。課件講解：（1）四環(huán)素：抑制細菌生長，但不殺死細菌。（2）氨芐青霉素抗性基因：產(chǎn)生b-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔沟?青霉素

30、指示液（藍灰色）褪色。（3）環(huán)絲氨酸：殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌。4.根據(jù)插入基因的表型選擇原理：1.彌補缺陷：轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷；2. 增加新性狀：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。（了解看看）DNA電泳檢測法:直接電泳檢測法(從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量)、酶切電泳篩選法(比較DNA代數(shù)和長度)。5. PCR擴增檢測法：1. 原理：PCR能在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片斷。2. 過程：（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR（3）電泳PCR產(chǎn)物（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物（5）PCR產(chǎn)物的

31、長度是否與外源基因一致。6.核酸雜交檢測法原理：1.核酸雜交：重組克隆與探針雜交2. 檢測用的探針：與外源DNA插入片斷互補的序列。3. 識別標記：放射性同位素如32P，非放射性同位素如熒光素。7.Southern blotting（Southern印跡雜交法）：用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。定義：將重組子DNA提取出來，用合適的限制性核酸內(nèi)切酶將DNA切割，并進行凝膠電泳分離，然后經(jīng)堿變性，最后同標記的核酸探針進行分子雜交的方法。（1）原位雜交篩選特點：應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。（了解）（2）R-環(huán)檢測法：DNA和RNA雜交，外源基因的mRNA與重組載體雜交。

32、（了解）8. Northern blotting（Northern印跡雜交法）：用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。定義：指從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交的方法。9.免疫化學(xué)檢測法：對表達產(chǎn)物的檢測。蛋白蛋白“雜交。放射性抗體檢測法：抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式；免疫沉淀檢測法：抗原抗體凝集反應(yīng)。10.酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）步驟：（1）固定樣品（2）一抗結(jié)合（3）二抗結(jié)合（4）顯色反應(yīng)（5）比色：在特殊的分光光度儀（酶標儀）上比色，打印出結(jié)果。局限性：準確性稍差11.免疫印跡（western blotting）法：指在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶的方法。

33、第十章1.表達載體：要使克隆基因在宿主細胞中表達，就要將它放入帶有基因表達所需要的各種元件的載體中，這種載體稱為表達載體。2.大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢：全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架；基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善；繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定。劣勢：缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能；缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)；內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白；細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。3.真核基因在大腸桿菌中表達存在的困難有哪些？在大腸桿菌mRNA 核糖體結(jié)合位點上，含有一個翻譯起始密碼子及與16S核糖體RNA3末端堿基互補的序列，即為SD序列；絕大多數(shù)真核生物的mRN

34、A分子，在5末端有帽子結(jié)構(gòu)，3端有A尾巴，而原核生物沒有；許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物需要經(jīng)過翻譯后的加工修飾；外源真核基因所表達的蛋白質(zhì)分子往往能夠被細菌的蛋白酶識別，并被當做異己分子降解掉。原核生物基因表達的特點：只有一種RNA多聚酶；以操縱子為單位；轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行；不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)；調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上；mRNA的核糖體結(jié)合位點。原核表達系統(tǒng)的注意事項：外源基因不能帶有內(nèi)含子；必須用cDNA；不能直接用真核基因組DNA；防止外源基因產(chǎn)物對宿主細胞的毒害。（了解）4.常用的大腸桿菌表達載體：（1）表達載體的一般組成：一般載體+啟動子+核糖體結(jié)合位點+翻譯起始點AUG。

35、（2）大腸桿菌表達載體的組成部分：啟動子：是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。 啟動子必須具備的條件：必須是一種強啟動子；應(yīng)是可誘導(dǎo)型的；這種啟動子應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平。 注：Lac啟動子來源于大腸桿菌的乳糖操縱子。 （了解看下） 翻譯的起始位點：核糖體結(jié)合位點（ RBS）、起始密碼。轉(zhuǎn)錄終止子翻譯終止密碼翻譯增強子 （了解看看）5.幾種類型的原核表達載體：（1）非融合型表達載體：載體表達出的外源基因蛋白質(zhì)不與細菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。如，pKK223-3 載體組成結(jié)構(gòu)： 強啟動子: tac（trp-lac）操縱基因調(diào)節(jié)基因終止子S-D序列和插入位點區(qū)表達

36、誘導(dǎo)物。（2）分泌型表達載體（3）融合蛋白表達載體系統(tǒng)-pGEX系列：表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。 優(yōu)點：便于融合蛋白的分離和純化，可誘導(dǎo)高效表達。（了解）6.外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位：（1）細胞質(zhì)中表達： 優(yōu)點：使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細胞； 缺點：回收的蛋白生物活性差。(2)周質(zhì)中表達優(yōu)點： 容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。（3）胞外表達。7.如何有效地提高外源基因的表達效率？選擇強啟動子序列，如tac 等；調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離；改變起始密碼下面的幾組密碼子；增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性；減輕宿主細胞的代

37、謝負荷。影響外源基因表達效率的因素（或提高外源基因表達效率的方法）：（1）啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響；如，一致順序 即-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離和-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序。（2）轉(zhuǎn)譯起始序列對表達效率的影響；如SD序列；（3）啟動子與外源基因之間的距離；（4）轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對表達效率的影響；（5）載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響；（6）外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達效率的影響。 （了解看看）8.提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性，防止其降解：（1）設(shè)計成融合蛋白（2） 使用突變菌株，保護外源蛋白不被降解（3）表達分泌蛋白。 9.外源基因在真核細胞中的表達：（外源基因：啟動子+MCS+polyA信號+終

38、止子）（一）酵母表達體系：（1） 酵母克隆載體分為：整合型載體(YIp)。特點：轉(zhuǎn)化率低；不能在酵母細胞中自主復(fù)制；整合到酵母的染色體上；不能從酵母細胞中提取載體。復(fù)制型載體(YRp) 。特點：轉(zhuǎn)化率高；可從大腸桿菌和酵母中提取質(zhì)粒；著絲粒質(zhì)粒(YCp)。特點：能穩(wěn)定遺傳，不易從細胞中提取；附加體型載體(YEp)。特點：很高的轉(zhuǎn)化活性，拷貝數(shù)多，比YRP穩(wěn)定。10.酵母轉(zhuǎn)化和表達的一般過程：Lau- 酵母，（酶去壁）原生質(zhì)體，（氯化鈣處理）感受態(tài)，（轉(zhuǎn)化）插入外源基因，酵母載體，（提取）大腸桿菌。酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點：已經(jīng)分離出很強的啟動子，有翻譯后的加工，安全性高。缺點：表達量普遍低，常常發(fā)生質(zhì)粒丟失。第十一章1.Ti質(zhì)粒：是一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，根據(jù)其誘導(dǎo)植物細胞產(chǎn)生冠癭堿種類不同分為章魚堿型、胭脂堿型、農(nóng)桿堿型、農(nóng)桿菌素堿型。根癌