分子生物學(xué)常用技術(shù)

1、目目 錄錄常用分子生物學(xué)技術(shù)常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用的原理及應(yīng)用the popular technology in molecular biology: principle and application目目 錄錄第第 一一 節(jié)節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)molecular hybridization & blotting technology目目 錄錄核酸分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 在在dna復(fù)性過程中，如果把不同復(fù)性過程中，如果把不同dna單鏈單鏈分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把dna與與rna放

2、在一放在一起，只要在起，只要在dna或或rna的單鏈分子之間有一定的單鏈分子之間有一定的的堿基配對(duì)堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成成雜化雙鏈雜化雙鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理目目 錄錄復(fù)性復(fù)性rnadna目目 錄錄（一）印跡技術(shù)（一）印跡技術(shù)（二）探針技術(shù)（二）探針技術(shù) 探針探針 (probe) 一小段用同位素、生物素或熒光染料一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在苷酸，與固定在nc膜上的核苷酸結(jié)合，判膜上的核苷酸結(jié)

3、合，判斷是否有同源的核酸分子存在。斷是否有同源的核酸分子存在。 目目 錄錄二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）（一）dna印跡技術(shù)印跡技術(shù) (southern blotting) 用于基因組用于基因組dna、重組質(zhì)粒和噬菌體、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。的分析。（二）（二）rna印跡技術(shù)印跡技術(shù) (northern blotting) 用于用于rna的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析（三）蛋白質(zhì)的印跡分析 (western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。 目目 錄錄n直接法：優(yōu)點(diǎn)： 1.快速（一種抗體）

4、 2.沒有二抗交叉反應(yīng)引起的非 特異性條帶缺點(diǎn)： 1.免疫反應(yīng)性降低 2.無信號(hào)二級(jí)放大 3.抗體標(biāo)記費(fèi)時(shí)昂貴目目 錄錄n間接法：優(yōu)點(diǎn)：1.信號(hào)放大， 2.靈敏度高（多個(gè)二抗結(jié)合 位點(diǎn)）3.多種標(biāo)記的二抗可供選擇 4.免疫特異性不受標(biāo)記影響5.可選擇不同的marker缺點(diǎn)：1.有交叉反應(yīng)引起的非特異 性條帶2.額外的二抗孵育以及條件 優(yōu)化目目 錄錄y yy yhrphrphrphrphrphrpsupersignalsupersignal 底物與二抗底物與二抗hrphrp反應(yīng)發(fā)光反應(yīng)發(fā)光5supersignalhrphrp標(biāo)記二抗與一抗蛋白復(fù)標(biāo)記二抗與一抗蛋白復(fù)合物結(jié)合合物結(jié)合42漂洗和封閉漂

5、洗和封閉1電泳分離，轉(zhuǎn)膜，固定蛋白于膜上電泳分離，轉(zhuǎn)膜，固定蛋白于膜上3一抗與蛋白結(jié)合一抗與蛋白結(jié)合 ( (小鼠單抗小鼠單抗 或兔多抗或兔多抗) )目目 錄錄 其他其他斑點(diǎn)印跡斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)dna點(diǎn)陣點(diǎn)陣 (dna array) dna芯片技術(shù)芯片技術(shù) (dna chip)目目 錄錄第第 二二 節(jié)節(jié) 聚聚 合合 酶酶 鏈鏈 反反 應(yīng)應(yīng)polymerase chain reaction5 primer 15 primer 2cycle 2cycle 15 5 5 5 5 5 template dna5 5

6、5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 錄錄cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板dna的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬倍以上。萬倍以上。目目 錄錄目目 錄錄n模板模板dnan 特異性引物特異性引物n耐熱耐熱dna聚合酶聚合酶n dntpsn mg2+ 二、二、pcrpcr體系基本組成成分體系基本組成成分目目 錄錄三、三、pcr的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95c延伸延伸72c退火退火tm-5c目目 錄錄（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺。ǘ┗虻捏w外突變（二）基因的體外突變（

7、三）（三）dna和和rna的微量分析的微量分析（四）（四）dna序列測(cè)定序列測(cè)定（五）基因突變分析（五）基因突變分析四、四、pcr的主要用途的主要用途目目 錄錄三、幾種重要的三、幾種重要的pcr衍生技術(shù)衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄（一）反轉(zhuǎn)錄pcr技術(shù)技術(shù)（二）原位（二）原位pcr技術(shù)技術(shù)（三）實(shí)時(shí)（三）實(shí)時(shí)pcr技術(shù)技術(shù)實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)pcrpcr技術(shù)原理技術(shù)原理目目 錄錄目目 錄錄三、三、dna自動(dòng)測(cè)序自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)dna序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行種雙脫氧核苷酸，然后

8、進(jìn)行sanger測(cè)序反應(yīng)，反測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小通過四種激光激發(fā)不同大小dna片段上的熒光片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定熒光信號(hào)，并依此確定dna堿基的排列順序。堿基的排列順序。 目目 錄錄dna自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例目目 錄錄目目 錄錄基基 因因 文文 庫(kù)庫(kù)gene library第第 四四 節(jié)節(jié)目目 錄錄基因組基因組dna文庫(kù)文庫(kù) (genomic dna library)cdna文庫(kù)文庫(kù) (cdna lib

9、rary) 基因文庫(kù)基因文庫(kù) (gene library)是指一個(gè)包含了某一生物體全部是指一個(gè)包含了某一生物體全部dnadna序列序列的克隆群體。的克隆群體。目目 錄錄基因組基因組dna文庫(kù)文庫(kù)目目 錄錄目目 錄錄第第 六六 節(jié)節(jié)遺傳修飾動(dòng)物模型的建立遺傳修飾動(dòng)物模型的建立及應(yīng)用及應(yīng)用the establishment and application of heredity-modified animal model 目目 錄錄轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物子卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)

10、物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。宮，使之發(fā)育成個(gè)體。 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入的目的基因被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物( (transgenic animal)目的基因的受體動(dòng)物目的基因的受體動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)目目 錄錄目目 錄錄核轉(zhuǎn)移技術(shù)核轉(zhuǎn)移技術(shù) 即即動(dòng)物整體克隆技術(shù)動(dòng)物整體克隆技術(shù)，將動(dòng)物體細(xì)胞，將動(dòng)物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的受精卵內(nèi)，核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆( (clone)。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)目目 錄錄基因剔除技術(shù)基因剔除技術(shù)也稱也稱基因靶向基因靶向( (gene targeting) )滅活，滅活，

11、有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。有目的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)三、基因剔除技術(shù)目目 錄錄四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動(dòng)物模型建立動(dòng)物模型 單基因決定疾病模型單基因決定疾病模型 基因剔除基因剔除獲得性突變獲得性突變(gain-of-function mutation) 多基因決定疾病模型多基因決定疾病模型目目 錄錄第第 七七 節(jié)節(jié) 生生 物物 芯芯 片片 技技 術(shù)術(shù)biological chip technology目目 錄錄dna芯片芯片(dna chip) cdna芯片芯片(cdna chip)是指將許多特定的是指

12、將許多特定的dna片段或片段或cdna片片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上面積的支持物上 。一、基因芯片一、基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(

13、protein chip)目目 錄錄第第 八八 節(jié)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)research technology of interaction of protein目目 錄錄蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括者。幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括dnadna的復(fù)制的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。 蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性目目 錄錄酵母雙雜交酵母雙雜交各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選等等噬菌體顯示系統(tǒng)篩選等等常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)目目 錄錄熒光共振能量轉(zhuǎn)換技