分離工程復習資料整理版

1、1、 生物分離過程的特點：生物物質(zhì)的活性，遇高溫，pH變化，化學藥物時不穩(wěn)定，料液中常有講解目標產(chǎn)物的物質(zhì)（酶），設計合理的分離過程和操作條件，快速分離純化得到高活性的目標產(chǎn)物。與人類生命相關的產(chǎn)物，應除去對人類有害的物質(zhì)，并防止其從外界混入。存在于目標產(chǎn)物相似的分子或異構體，采用多種分離方法或多個分離步驟。整個過程的總回收率YT=Y1+Y2+.Yi回收率低，成本大提高回收率：提高每一步的回收率，減少步驟原料液中目標產(chǎn)物濃度低，需要進行高濃度濃縮，成本高。2、 生物分離技術和原理物理性質(zhì)：力學性質(zhì)（密度、尺寸、形狀） 熱力學性質(zhì)（溶解度、揮發(fā)度、表面活性、相間分配平衡） 傳質(zhì)性質(zhì)（粘度、擴散系

2、數(shù)） 電磁性質(zhì)（電荷特性、電荷分布、等電點、磁性）化學性質(zhì)：化學平衡、反應速率、激光激發(fā)作用生物學性質(zhì)：利用分子識別作用、利用酶反應的立體選擇性3、對于特定的分離方法或分離設備，評價指標包括 分離容量capacity：單位體積的分離設備處理料液或目標產(chǎn)物的體積或質(zhì)量。 分離速度speed：單批次分離所需的時間，或連續(xù)分離過程的進料速度。 分辨率resolution：目標產(chǎn)品的純化效果或雜志的去除能力。4、重力沉降 球形固體顆粒的勻速沉降速度為Vg=dp2（S -L）g / 18L5、如何提高重力沉降？ 在中性鹽的作用下，可使菌體表面雙電層排斥電位降低，利于菌體之間產(chǎn)生凝聚。 向菌體的料液中加入

3、高分子絮凝劑，可使菌體之間產(chǎn)生架橋作用而形成較大的凝聚顆粒。凝聚或絮凝有利于重力沉降，還可以提高過濾速度和質(zhì)量。培養(yǎng)液中含有蛋白質(zhì)時，可使部分蛋白質(zhì)凝聚而同時過濾除去。6、單位質(zhì)量的物質(zhì)所受到的離心力為Fc=r27、差速離心differential centrifugation以菌體細胞的收集或除去為目的的固液離心分離是分級離心操作的一種特殊情況，即為以及分級分離。菌體和細胞一般在500-5000g的離心力下就可以完全沉降。8、區(qū)帶離心zonal centrifugation：差速區(qū)帶離心、平衡區(qū)帶離心需要事先在離心管中用某種低分子溶質(zhì)調(diào)配好密度梯度，在密度梯度上加待處理的料液進行離心分離操作

4、。用于蛋白質(zhì)、核算等生物大分子，處理量小，僅限于實驗室水平。區(qū)別：差速（密度梯度中的最大密度小于待分離的目標產(chǎn)物的密度）平衡（密度梯度比差速的密度梯度高）9、過濾filtration：利用薄片形多孔性介質(zhì)節(jié)流固液懸浮液中的固體粒子，進行固液分離的方法。10、過濾速度：透過速度dQ/dt=Ap/L（Rm+Rc） A過濾面積 p操作壓力 Q濾液體積 L濾液粘度 Rm、Rc介質(zhì)和濾餅的阻力 濾餅阻力是影響過濾速度的主要因素，如何提高過濾速度？ 對濾液進行絮凝或凝聚等預處理，降低濾餅的阻力。 在料液中加入助濾劑，但以菌體細胞為收集目的時，會給之后的操作帶來麻煩。11、細胞破碎主要采用機械破碎法mech

5、anical disruption和化學破碎法chemical disruption（又稱化學滲透chemical permeation），或二者結合。12、高壓勻漿，又稱高壓剪切破碎，其機理：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥左鍵的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放在低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。13、 超聲波破碎的機理：在超聲波的作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎。14、 化學和生物化學滲透酸堿處理：利用酸堿調(diào)節(jié)pH值，提高目標產(chǎn)物溶解度。化學試劑處理：用表面活性劑或有機溶劑處理細胞，可增大細胞壁

6、通透性。變性劑能破壞氫鍵作用，降低胞內(nèi)產(chǎn)物之間的相互作用，使之容易釋放。酶溶：利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。15、 目標產(chǎn)物的選擇性釋放原則：僅破壞或破碎存在目標產(chǎn)物的位置周圍：當目標產(chǎn)物存在于細胞膜附近時，可采用比較溫和的方式。當目標產(chǎn)物存在于細胞質(zhì)內(nèi)時，需采用強烈的機械破碎法。選擇性溶解目標產(chǎn)物：當目標產(chǎn)物處于與細胞膜或細胞壁結合的狀態(tài)時，調(diào)整溶液pH值、離子強度或添加與目標產(chǎn)物具有親和性的試劑，使目標產(chǎn)物容易溶解釋放，溶液性質(zhì)應使其他雜質(zhì)不易溶出。機械法和化學法并用可使操作條件更溫和，在相同的目

7、標產(chǎn)物釋放率的情況下，降低細胞的破碎程度。16、 沉淀precipitation是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)的溶解度降低、生成固體凝聚物的現(xiàn)象。17、 蛋白質(zhì)為什么能穩(wěn)定存在？蛋白質(zhì)周圍的水化層和雙電層?？梢酝ㄟ^降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和雙電層厚度降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀。18、 防止沉淀的方法：19、 Cohn經(jīng)驗方程 lgS=- KsI S蛋白質(zhì)的溶解度；常數(shù)；Ks鹽析常數(shù)；I離子強度 I=1/2 ciZi2 ci 離子i的濃度；Zi電荷數(shù)影響蛋白質(zhì)鹽析的主要因素有無機鹽的種類、濃度、溫度、pH值。一般物質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增大，但在離子強度較高的溶液中，升高溫度有利于某些蛋白

8、質(zhì)的失水，因而溫度升高，蛋白質(zhì)的溶解度下降。在pH值結晶蛋白質(zhì)等電點的溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度最小（值最?。?，所以調(diào)節(jié)溶液pH在等電點附近最利于提高鹽析效果。20、 影響鹽析的因素：反映在方程中就是對和Ks的影響，不同蛋白質(zhì)的值不同，Ks值隨蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的增大或分子不對稱性的增強而增大，即結構不對稱、相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)易于鹽析沉淀。影響因素有無機鹽的種類、濃度、溫度和pH值。21、 （書31頁）在20下，硫酸銨的飽和濃度約為4.05,mol/L（534g/L），硫酸銨的濃度從M1增大到M2所需加入的硫酸銨量為W=534（M2-M1）/（4.05-0.3M2）在0下，飽和硫酸銨溶液濃度為

9、3.825mol/L（505g/L），W=505（M2-M1）/（3.825-0.285M2）22、 等電點沉淀isoelectric precipitation 利用蛋白質(zhì)在pH值等于其等電點的溶液中溶解度下降的原理進行沉淀分級的方法。23、 有機溶劑沉淀（破壞其水化層）：向蛋白質(zhì)溶液中加入病痛或乙醇等水溶性有機溶劑，水的活度降低。24、 水溶性膠團 micelles25、 表面活性劑在水溶液中形成膠團的最低濃度稱為臨界膠團濃度 critical micelle concentration CMC26、 膜分離 membrane separation 是利用具有一定選擇透過性的過濾介質(zhì)進行物

10、質(zhì)的分離純化。27、 膜分離法包括微濾（microfiltration）超濾（ultrafiltration）反滲透（reverse osmosis）透析（dialysis）電滲析（electrodialysis）滲透氣化（pervaporation）28、 滲透：若膜兩側(cè)壓力相同，在濃差的作用下作為溶劑的水分子從介質(zhì)濃度低（水濃度高）的一側(cè)（A側(cè)，純水）向溶質(zhì)濃度高的一側(cè)（B側(cè)，水溶液）透過。29、 反滲透：如果欲使B側(cè)溶液中的溶劑（水）滲透到A側(cè)，在B側(cè)所施加的壓力必須大于此滲透壓。30、 Fick第一定律：在單位時間內(nèi)通過垂直于擴散方向的單位面積的擴散物質(zhì)流量（擴散通量），與流截面處的濃

11、度梯度成正比。 J=-D dc/dx根據(jù)Fick定律，摩爾通量N2=-2 ·2/l D2溶質(zhì)在膜中的擴散系數(shù)31、 超濾：根據(jù)高分子溶質(zhì)之間或高分子與小分子溶質(zhì)之間相對分子質(zhì)量的差別進行分離的方法。32、 透析：利用具有一定孔徑大小、高分子溶質(zhì)不能透過的親水膜將含有高分子溶質(zhì)和其他小分子溶質(zhì)的溶液與純水或緩沖液（稱為透析液）分隔，由于膜兩側(cè)的溶質(zhì)濃度不同，在濃差的作用下，高分子溶液中的小分子溶質(zhì)（如無機鹽）透向透析液，透析液中的水則透向高分子溶液。33、 電滲析原理：利用分子的荷電性質(zhì)和分子大小的差別進行分離的膜分離法，可用于小分子電解質(zhì)的分離和溶液的脫鹽。（右圖） 34、 在膜表面

12、附近濃度高于主體濃度的現(xiàn)象，稱為濃度極化或濃差極化concentration polarization35、 當分離含有菌體、細胞或其他固形成分的料液時，也會在膜表面形成凝膠層，稱為凝膠極化 gel polarization36、 一般將在截留曲線上截留率為0.90（90%）的溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量定義為膜的截留相對分子質(zhì)量 molecular mass cut-off MMCO37、 萃取extraction 利用液體或超臨界流體為溶劑提取原料中目標產(chǎn)物的分離純化操作。38、 反萃取back extraction 調(diào)節(jié)水相條件，將目標產(chǎn)物從有機相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。39、 分配定律，即溶質(zhì)的分配

13、平衡規(guī)律：在恒溫恒壓條件下，溶質(zhì)在互不相溶的兩相中達到分配平衡時，如果其在兩相中的相對分子質(zhì)量相等，則其在兩相中的平衡濃度之比為常數(shù)，稱為分配常數(shù)，A。 A=c2/c140、 分配系數(shù)（分配比）m=c2，t/c1，t c2，t c1，t為溶質(zhì)在相1和相2中的總濃度 m=yt/xt yt xt為在溶質(zhì)的總摩爾分數(shù) m為分配系數(shù)41、 溶劑萃取操作水相物理條件的影響：水相pH值對弱電解質(zhì)分配系數(shù)均具有顯著影響。物理萃取時，弱酸性電解質(zhì)的分配系數(shù)隨pH值降低而增大，而弱堿性電解質(zhì)則正相反。溫度也是影響分配系數(shù)和萃取速率的重要因素。選擇適當?shù)牟僮鳒囟?，有利于目標產(chǎn)物的回收和純化。操作一般在常溫或較低溫

14、度下進行。無機鹽的存在可降低溶質(zhì)在水相中得溶解度，有利于溶質(zhì)向有機相中分配。有機溶劑或稀釋劑的選擇：根據(jù)相似相溶的原理，選擇與目標產(chǎn)物極性相近的有機溶劑為萃取劑，可以得到較大分配系數(shù)。有機溶劑需滿足要求：1、價廉易得；2、與水相不互溶；3、與水相有較大的密度差，黏度小，表面張力適中，容易相分離和相分散；4、容易回收和再利用；5、毒性低，腐蝕性小，閃點低，使用安全；6、不與目標產(chǎn)物反應?；瘜W萃取劑：由于氨基酸和一些極性較大的抗生素的水溶性很強，在有機相中的分配系數(shù)很小甚至為零，利用一般的物理萃取效率很低，需采用化學萃取。乳化現(xiàn)象：乳化即水或有機溶劑以微小液滴形式分散于有機相或水相中的現(xiàn)象。產(chǎn)生乳

15、化后使有機相和水相分層困難，出現(xiàn)兩種夾帶：1、發(fā)酵廢液中夾帶有機溶劑微滴，使目標產(chǎn)物受到損失；2、有機溶劑中夾帶發(fā)酵廢液，給后處理操作帶來困難。產(chǎn)生乳化現(xiàn)象的主要原因是發(fā)酵液中存在蛋白質(zhì)和固體顆粒等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有表面活性劑的作用，使有機溶劑和水的表面張力降低，油或水易于以微小液滴的形式分散于水相或油相中。42、 E=mL/H H、L分別為料液和萃取劑的流量或添加量（書75頁）43、 雙水相系統(tǒng)aqueous two-phase extraction 一些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，形成雙水相系統(tǒng)。44、 （書85頁）曲線稱為雙結點線，雙

16、結點線以下為均相區(qū)，以上為兩相區(qū)。連接雙結點線上兩點的直線為系線（tie line）。當系線長度趨于零時，在圖中雙結點線上的K點，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1，因此K點稱為臨界點（critical point）。45、 雙水相中的分配平衡用c1、c2分別表示平衡狀態(tài)下下相和上相中溶質(zhì)的總濃度（mol/L），則m=c2/c1。生物分子的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)和雙水相系統(tǒng)間的相互作用，主要有靜電作用、疏水作用、生物親合作用。分配系數(shù)是各種相互作用的和。lnm = lnme + lnmh + lnml me mh ml 分別表示靜電作用、疏水作用和生物親合作用對溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻。影響

17、平衡的因素：靜電作用、疏水作用46、 乳狀液膜根據(jù)成膜液體的不同，分為（W/O）/W（水-油-水）和（O/W）/O（油-水-油）兩種，生物分離中主要應用水-油-水型乳狀液膜。47、 液膜萃取機理：單純遷移反萃取相化學反應促進遷移膜相載體運輸48、 反向遷移：供能物質(zhì)與目標溶質(zhì)遷移方向相反49、 同向遷移：供能物質(zhì)與目標溶質(zhì)遷移方向相同50、 反膠團萃取reversed micellar extraction利用表面活性劑在有機相中形成的反膠團，從而在有機相中形成分散的親水微環(huán)境，使生物分子在有機相（萃取相）內(nèi)存在于反膠團的親水微環(huán)境中，消除了生物分子，特別是蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)難于溶解在有機相

18、中或在有機相中發(fā)生不可逆變性的現(xiàn)象。51、 反膠團的溶解作用（書104頁）靜電相互作用空間相互作用52、 （書112-113頁）超臨界流體萃取SCF extraction 利用超臨界流體為萃取劑的萃取操作。53、 影響物質(zhì)在超臨界流體中溶解度的主要因素為溫度和壓力。54、 吸附adsorption是溶質(zhì)從液相或氣相轉(zhuǎn)移到固相的現(xiàn)象。吸附劑adsorbent55、 吸附劑對溶質(zhì)的吸附作用按吸附作用力區(qū)分主要有三類，即物理吸附、化學吸附和離子交換。56、 離子交換劑分陽離子交換劑（cation exchanger）和陰離子交換劑（anion exchanger）。前者對陽離子具有交換能力，活性基團

19、為酸性，后者對陰離子具有交換能力，活性基團為堿性。57、 離子交換基團：強酸性基：磺酸基、磺丙基、膦酸基弱酸性基：羧甲基、羧基強堿性基：三甲氨基、二甲基-羥基乙胺、季氨乙基、三乙胺乙基弱堿性基：二乙氨乙基、二乙氨基、氨基58、 擴散系數(shù)D用Fick定律定義：JA=- D dcA/dxJA溶質(zhì)A的擴散通量；cA溶質(zhì)的濃度；x擴散方向上的距離；D擴散系數(shù)；dcA/dx溶質(zhì)在擴散方向上的濃度梯度。59、 出口處溶質(zhì)濃度開始上升的點稱為穿透點。達到穿透點所用的操作時間稱為穿越時間。（右圖）60、 色譜原理：色譜分離的主體介質(zhì)由互不相溶的流動相（mobile phase）和固定相（stationary

20、phase）組成。色譜就是根據(jù)混合物中的溶質(zhì)在兩相之間分配行為的差別引起的隨流動相移動速度的不同進行分離的方法。分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相上存在的概率大，隨流動相移動的速度小。61、 色譜分類：根據(jù)流動相的相態(tài)：氣相色譜法、液相色譜法、超臨界流體色譜法固定相：固體、液體、以固體為載體的液體薄層生物分離主要采用液相色譜法。根據(jù)固定相或色譜裝置形狀的不同：液相色譜：紙色譜、薄層色譜、柱色譜紙色譜和柱色譜多用于分析目的；柱色譜適用于大量制備分離。根據(jù)操作壓力：低壓、中壓、高壓液相色譜大規(guī)模制備分離最常用低壓和中壓。軸向流色譜、徑向流色譜：相同處理量條件下，大規(guī)模徑向流色譜可或得比軸向流色譜更高的柱效率

21、。因此更適合大規(guī)模分離過程。根據(jù)操作方式不同：洗脫展開、迎頭分析、置換展開（洗脫色譜）置換展開適合大量處理稀溶液，是最常見的色譜分析法。60、 F=（1-c）/c可得色譜柱內(nèi)不同濃度的溶質(zhì)從柱內(nèi)流出所需的洗脫時間。61、 tR=（1+mF） VR=V0（1+mF） VR=V0+m（Vt-V0） 線性分配平衡情況下洗脫峰的洗脫時間或體積計算公式對于優(yōu)惠吸附，因為f(cm)隨cm增大而減小，則溶質(zhì)濃度越高，洗脫時間越短，所以洗脫峰前部出現(xiàn)激波層，而后部明顯拖尾。62、 理論板模型HETP=L/N 理論版當量高度HETP63、 N=16（R/W）2 R 平均洗脫時間 W 底線處切線寬度64、 HET

22、P=A/u+B+Cu ABC是與u無關的常數(shù) u流速65、 分離度（分辨率）resolution 表達兩個洗脫位置相鄰的溶質(zhì)相互分離的程度Rs=2（R2-R1）/（W1+W2）假定洗脫曲線為Gauss分布，分配平衡關系為線性，并且利用兩種溶質(zhì)測得的理論板數(shù)相等，Rs=F（m2-m1）N1/2/2(2+m1F+m2F)66、 凝膠過濾色譜GFC是利用凝膠粒子為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差別進行分離的液相色譜法。67、 VR,B - VR,A = (Vt - V0)(mB - mA) VR,B VR,A 分別為溶質(zhì)AB的洗脫體積68、 凝膠特性參數(shù)：排阻極限分級范圍凝膠粒徑空隙體積溶脹率

23、床體積69、 影響分離的因素：線速度料液體積料液濃度相對分子質(zhì)量與分配系數(shù)的關系凝膠粒徑70、 凝膠過濾色譜的應用：分離純化：GFC可用于相對分子質(zhì)量從幾百到106數(shù)量級的物質(zhì)的分離純化脫鹽：GFC在生物分離領域的另一主要用途是生物大分子溶液的脫鹽，以及除去其中的低相對分子質(zhì)量物質(zhì)。相對分子質(zhì)量的測定：用于未知物質(zhì)的相對分子質(zhì)量測定。71、 離子交換色譜IEC是利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷店溶質(zhì)于離子交換劑之間經(jīng)典相互作用力的差別進行溶質(zhì)分離的洗脫色譜法。72、 線性梯度洗脫法：優(yōu)點：流動相離子強度連續(xù)增大，不出現(xiàn)干擾峰，操作范圍廣。缺點：需要特殊的調(diào)配濃度梯度的設備。73、 逐次洗脫法：優(yōu)

24、點：利用切換不同鹽濃度的流動相溶液進行洗脫，不需要特殊梯度設備，操作簡便。缺點：因為流動相濃度不連續(xù)變化，容易出現(xiàn)干擾峰，此外容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊現(xiàn)象，因此洗脫操作參數(shù)的設計比較困難。74、 實際色譜操作中，若料液組成為止，一般首選線性梯度洗脫法，確定各種組分的分配特色以及色譜操作的條件。75、 疏水相互作用色譜HIC原理：利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫色譜法。76、 反相色譜RPLC：利用表面非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據(jù)溶質(zhì)極性（疏水性）的差別進行分離

25、純化的洗脫色譜法。77、 親和作用：指生物分子間的特異性結合作用。78、 親和作用包括靜電作用、氫鍵、疏水性相互作用、配位鍵、弱共價鍵。79、 親和色譜的固定相是鍵合親和配給的親和吸附介質(zhì)。由于目標產(chǎn)物基于生物親和作用吸附在固定相上，具有高度的選擇性。80、 親和色譜的操作分進料，雜質(zhì)清洗，目標產(chǎn)物洗脫，色譜柱再生。81、 包含體 inclusion body 重組蛋白質(zhì)的高表達常常導致其在胞內(nèi)發(fā)生錯誤折疊和聚集，形成被稱為包含體的聚集體。82、 復性 renaturation83、 結晶 cystallization84、 結晶與沉淀的區(qū)別：結晶（形狀一定的固體粒子，有規(guī)則排列的晶體）沉淀（無規(guī)則排列的、不定型的固體顆粒，夾雜共存的雜質(zhì)鹽和溶劑，純度低于結晶）85、 包和濃度 saturated concentrati