無病毒植物的培養(yǎng)ppt課件

1、第四章 無病毒植物的培育教學(xué)目的和要求教學(xué)目的和要求 (1了解植物病毒的危害和培育無病了解植物病毒的危害和培育無病毒植物的意義。毒植物的意義。2了解和掌握脫除植物病毒的原理了解和掌握脫除植物病毒的原理及方法。及方法。 3了解分別莖尖的培育情況。了解分別莖尖的培育情況。4普通掌握無毒苗木的鑒定方法。普通掌握無毒苗木的鑒定方法。5普通掌握脫毒苗木的保管和利用普通掌握脫毒苗木的保管和利用方法。方法。第一節(jié) 植物病毒的危害和培育無病毒植物的意義病毒之所以致病不是由于耗費(fèi)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)或經(jīng)過毒病毒之所以致病不是由于耗費(fèi)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)或經(jīng)過毒素殺死細(xì)胞，而是利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)占領(lǐng)空間，素殺死細(xì)胞，而是利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)占領(lǐng)空

2、間，干擾細(xì)胞的代謝過程，促使細(xì)胞產(chǎn)生一些對(duì)細(xì)干擾細(xì)胞的代謝過程，促使細(xì)胞產(chǎn)生一些對(duì)細(xì)胞或生物的生命和正常功能有害的異常物質(zhì)和胞或生物的生命和正常功能有害的異常物質(zhì)和條件，這使得植物病毒病的防治較其他植物病條件，這使得植物病毒病的防治較其他植物病害防治更為困難，常給消費(fèi)帶來災(zāi)難的損失，害防治更為困難，常給消費(fèi)帶來災(zāi)難的損失，被稱為被稱為“植物的癌癥。植物的癌癥。一、植物病毒的危害一、植物病毒的危害 植物病毒已超越600種，嚴(yán)重危害著農(nóng)業(yè)消費(fèi)。 在果樹、蔬菜、花卉、林木以及農(nóng)作物上皆有發(fā)現(xiàn)。隨著消費(fèi)栽培時(shí)間的推移，危害越來越嚴(yán)重，發(fā)現(xiàn)的病毒種類也越來越多。病毒調(diào)查危害園藝植物的病毒數(shù)目危害園藝植物

3、的病毒數(shù)目如侵染菊花的病毒和類病毒有如侵染菊花的病毒和類病毒有19種之多種之多 如如 無子病毒無子病毒(CAV) 潛隱病毒潛隱病毒(CLV) B病毒病毒(CVB) 輕斑駁病毒輕斑駁病毒(CMMV) 矮化病毒矮化病毒(CSV) 脈斑駁病毒脈斑駁病毒(CVMV) 退綠斑駁類病毒退綠斑駁類病毒(CCMV)等等 4種對(duì)草莓消費(fèi)呵斥艱苦種對(duì)草莓消費(fèi)呵斥艱苦影響影響: 斑駁病毒斑駁病毒SMoV 草莓黃邊病毒草莓黃邊病毒SMYEV 草莓鑲脈病毒草莓鑲脈病毒SVBV 草莓伸展病毒草莓伸展病毒 SCrV、甘薯根腐病.甘薯葉點(diǎn)病甘薯枯萎病甘薯黑痣病2.病毒的特性及其侵染病毒的特性及其侵染 多植物病毒不經(jīng)種子傳播，

4、多數(shù)以種子繁衍后代的多植物病毒不經(jīng)種子傳播，多數(shù)以種子繁衍后代的植物，可以從輕度罹病植株上采集種子，播種繁植物，可以從輕度罹病植株上采集種子，播種繁衍，不會(huì)將病毒傳至下一代。?；詮?qiáng)的病毒衍，不會(huì)將病毒傳至下一代。?；詮?qiáng)的病毒除外，如豆類病毒除外，如豆類病毒由一種?；詮?qiáng)的蚜蟲傳由一種?；詮?qiáng)的蚜蟲傳播播)可隨著種子傳播。可隨著種子傳播。對(duì)于有性生殖退化，僅能用無性繁衍方法繁衍的植對(duì)于有性生殖退化，僅能用無性繁衍方法繁衍的植物，一旦罹病那么毫無方法。母株一旦染病，病物，一旦罹病那么毫無方法。母株一旦染病，病毒在其細(xì)胞內(nèi)增殖，并經(jīng)過插條、接穗、種薯、毒在其細(xì)胞內(nèi)增殖，并經(jīng)過插條、接穗、種薯、球

5、根、鱗片傳至下一代。球根、鱗片傳至下一代。經(jīng)過昆蟲作為媒介加速傳播。經(jīng)過昆蟲作為媒介加速傳播。.植株脫病毒的意義植株脫病毒的意義 植物組織培育脫病毒技術(shù)是植物細(xì)胞工程的重要組成部分，脫毒種苗的消費(fèi)在提高作物質(zhì)量和產(chǎn)量方面已顯示出極大潛力，良種、新種類的脫毒組培苗的大面積推行和運(yùn)用，有效地處理了因病毒引起的種類退化問題。因此，植物組培脫毒技術(shù)在農(nóng)業(yè)消費(fèi)的科學(xué)化、現(xiàn)代化中具有宏大的運(yùn)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，還可減少農(nóng)藥的施用，改善生態(tài)環(huán)境條件，防止病害的蔓延與分散，該方法已成為農(nóng)業(yè)中運(yùn)用最廣泛的生物技術(shù)。甘薯脫毒甘薯脫毒苗苗脫毒區(qū)第二節(jié) 脫除植物病毒的原理及方法 一、物理學(xué)方法：一、物理學(xué)方法： X射線

6、射線 紫外線紫外線 超短波超短波 高溫高溫 都能使病素鈍化，其中以熱處置最常用。都能使病素鈍化，其中以熱處置最常用。1.熱處置脫除植物病毒的原理熱處置脫除植物病毒的原理病毒是病毒是DNA大分子，病毒進(jìn)入植物細(xì)胞后；隨大分子，病毒進(jìn)入植物細(xì)胞后；隨植物細(xì)胞的植物細(xì)胞的DNA一同復(fù)制。熱處置并不能殺死一同復(fù)制。熱處置并不能殺死病毒，只能鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內(nèi)病毒，只能鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停頓，而失去侵染的才干。增殖減緩或增殖停頓，而失去侵染的才干。 熱處置是一種物理效應(yīng)，與冷處置一樣，它可熱處置是一種物理效應(yīng)，與冷處置一樣，它可以加速植物細(xì)胞的分裂，使植物細(xì)胞在

7、與病毒繁以加速植物細(xì)胞的分裂，使植物細(xì)胞在與病毒繁衍的競(jìng)爭(zhēng)中取勝。衍的競(jìng)爭(zhēng)中取勝。1溫湯浸漬處置法：將剪下的接穗或種溫湯浸漬處置法：將剪下的接穗或種植資料，在植資料，在50左右的溫水中，浸漬左右的溫水中，浸漬3-15分鐘至數(shù)小時(shí)。分鐘至數(shù)小時(shí)。2熱風(fēng)處置法：讓盆載植物在熱風(fēng)處置法：讓盆載植物在35-40高溫下生長(zhǎng)發(fā)育，熱處置空氣溫度應(yīng)逐高溫下生長(zhǎng)發(fā)育，熱處置空氣溫度應(yīng)逐漸升高，然后到達(dá)所需溫度，同時(shí)必需漸升高，然后到達(dá)所需溫度，同時(shí)必需堅(jiān)持一定的濕度和光照，以后可切取處堅(jiān)持一定的濕度和光照，以后可切取處置后新長(zhǎng)出的枝條作接穗和砧木，或?qū)⒅煤笮麻L(zhǎng)出的枝條作接穗和砧木，或?qū)崽幹门c組織培育結(jié)合效果

8、更好。熱處置與組織培育結(jié)合效果更好。熱處置脫毒熱處置脫毒2、愈傷組織熱處置脫毒法、愈傷組織熱處置脫毒法方法：從患病植株上取葉片方法：從患病植株上取葉片(莖片、鱗片、花器亦可莖片、鱗片、花器亦可)進(jìn)展離體培育，誘導(dǎo)構(gòu)成愈傷組織，然后將愈傷進(jìn)展離體培育，誘導(dǎo)構(gòu)成愈傷組織，然后將愈傷組織反復(fù)繼代培育同時(shí)兼用熱處置。組織反復(fù)繼代培育同時(shí)兼用熱處置。 常用途置溫度及處置時(shí)間：常用途置溫度及處置時(shí)間： 溫度：溫度：37-38 時(shí)間：處置時(shí)間：處置2周、周、4周或周或8周周 溫度：溫度：50 時(shí)間：時(shí)間：3-15min。反復(fù)繼代兼熱處置，閱歷一定的時(shí)間反復(fù)繼代兼熱處置，閱歷一定的時(shí)間(繼代次數(shù)需實(shí)繼代次數(shù)需

9、實(shí)驗(yàn)驗(yàn))后，將熱處置過的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培育基后，將熱處置過的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培育基中，誘導(dǎo)器官分化。中，誘導(dǎo)器官分化。果樹作物：桃果樹作物：桃(無黃萎病無黃萎病)、蘋果、蘋果(花葉病花葉病)、葡萄葡萄(扇葉病毒扇葉病毒)、甜橙、香蕉、李子、醋、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、樹莓、紅莓苔子、草莓等。栗、梨、樹莓、紅莓苔子、草莓等。蔬菜作物：馬鈴薯、番茄、菠菜。蔬菜作物：馬鈴薯、番茄、菠菜?；ɑ苤参铮郝L(zhǎng)春花、康乃馨、菊花等?；ɑ苤参铮郝L(zhǎng)春花、康乃馨、菊花等。其他植物：曼陀羅等。其他植物：曼陀羅等。例：煙草愈傷組織兼熱處置鈍化煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)獲得無病毒株效果

10、做法：A：從患病煙草植株上?。簭幕疾煵葜仓晟先?mm葉片培育，在葉片培育，在MS附附加加IAA 2+KT 0.2的培育基上誘導(dǎo)愈傷組織。的培育基上誘導(dǎo)愈傷組織。B：將其中一部分愈傷組織反復(fù)繼代培育，繼代培：將其中一部分愈傷組織反復(fù)繼代培育，繼代培育中分別兼用育中分別兼用25、30和和37溫度熱處置溫度熱處置8周。周。C：將熱處置后的愈傷組織，轉(zhuǎn)到：將熱處置后的愈傷組織，轉(zhuǎn)到MS附加附加IAA 2+KT 2的分化培育基中誘導(dǎo)芽分化。的分化培育基中誘導(dǎo)芽分化。D：將：將1cm長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)移到MS附加附加IAA 2+KT 0.02生生根培育基，誘導(dǎo)根分化。根培育基，誘導(dǎo)根分化。E：完好植株

11、獲得后，移植到無毒土壤栽培并進(jìn)展：完好植株獲得后，移植到無毒土壤栽培并進(jìn)展鑒定。鑒定。 結(jié)果闡明：反復(fù)繼代培育可獲得無病毒株。結(jié)果闡明：反復(fù)繼代培育可獲得無病毒株。3.低溫處置脫出病毒 菊花植株菊花植株-5,4-7.5個(gè)月處置后進(jìn)展莖個(gè)月處置后進(jìn)展莖尖培育尖培育,可以除去矮化病毒可以除去矮化病毒(CSV)和褪綠和褪綠班駁病毒班駁病毒(CCMV),而單獨(dú)的莖尖培育無而單獨(dú)的莖尖培育無此效果。此效果。二、化學(xué)方法二、化學(xué)方法運(yùn)用農(nóng)藥是防治植物真細(xì)菌病害的主要方法，運(yùn)用農(nóng)藥是防治植物真細(xì)菌病害的主要方法，實(shí)際上講，也應(yīng)該是防治病毒的有效途徑。實(shí)際上講，也應(yīng)該是防治病毒的有效途徑。有不少化學(xué)物質(zhì)能抑制

12、病毒復(fù)制，例如孔雀綠、有不少化學(xué)物質(zhì)能抑制病毒復(fù)制，例如孔雀綠、硫尿嘧啶、硫尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、以及某些病毒抑制劑。氮鳥嘌呤、以及某些病毒抑制劑。如如Viraz01e(病毒唑病毒唑)和一些蛋白質(zhì)、核酸合成抑和一些蛋白質(zhì)、核酸合成抑制劑等。由于病毒的復(fù)制和寄主的代謝過程制劑等。由于病毒的復(fù)制和寄主的代謝過程關(guān)系非常親密，因此，要找出既干擾病毒復(fù)關(guān)系非常親密，因此，要找出既干擾病毒復(fù)制，又不影響寄主細(xì)胞正常代謝的藥劑非常制，又不影響寄主細(xì)胞正常代謝的藥劑非常困難。困難。利用這些化合物處置整株植物去病毒的效利用這些化合物處置整株植物去病毒的效果雖不理想，但培育離體的組織、細(xì)胞果雖不理想，但培育離體

13、的組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等卻能夠有良好效果。和原生質(zhì)體等卻能夠有良好效果。如在培育基中參與如在培育基中參與2硫尿嘧啶可以除去煙硫尿嘧啶可以除去煙草愈傷組織中的草愈傷組織中的PVY病毒，參與放線菌病毒，參與放線菌素素D可以抑制原生質(zhì)體中的病毒復(fù)制等?？梢砸种圃|(zhì)體中的病毒復(fù)制等。 鈍化、抑制和去除植物病毒的一些化合物三、生物學(xué)方法1.莖尖培育脫毒莖尖培育脫毒1莖尖培育脫毒的實(shí)際根底莖尖培育脫毒的實(shí)際根底a、病毒在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移是經(jīng)過維營(yíng)束系統(tǒng)、病毒在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移是經(jīng)過維營(yíng)束系統(tǒng)完成的，在分生組織區(qū)域內(nèi)沒有維管束組完成的，在分生組織區(qū)域內(nèi)沒有維管束組織，病毒只能經(jīng)過胞間連絲傳送趕不上細(xì)織，病毒只

14、能經(jīng)過胞間連絲傳送趕不上細(xì)胞的不斷分裂和活潑的生長(zhǎng)速度；胞的不斷分裂和活潑的生長(zhǎng)速度；b、在分裂旺盛的分生組織內(nèi)，病毒的復(fù)制遭、在分裂旺盛的分生組織內(nèi)，病毒的復(fù)制遭到旺盛代謝活動(dòng)的限制；到旺盛代謝活動(dòng)的限制；c、在植物分生區(qū)域內(nèi)，、在植物分生區(qū)域內(nèi)，“病毒鈍化體系的病毒鈍化體系的活性較其他部位的活性高；活性較其他部位的活性高；d、莖尖分生組織內(nèi)高濃度的植物內(nèi)源激素能、莖尖分生組織內(nèi)高濃度的植物內(nèi)源激素能夠會(huì)抑制病毒的增殖。夠會(huì)抑制病毒的增殖。 2莖尖培育脫毒苗的方法莖尖培育脫毒苗的方法在解剖鏡下剝?nèi)∏o尖。思索到脫毒效果及提高成活在解剖鏡下剝?nèi)∏o尖。思索到脫毒效果及提高成活率，普通切取率，普通切

15、取0.20.5mm的莖尖為組織資料進(jìn)展的莖尖為組織資料進(jìn)展培育，不同的植物莖尖對(duì)外源激素的反響不同。培育，不同的植物莖尖對(duì)外源激素的反響不同。莖尖大小莖尖大小:過大時(shí)接種易成活，但脫毒效果差，過小過大時(shí)接種易成活，但脫毒效果差，過小時(shí)難成活，但脫毒效果好。普通以帶有時(shí)難成活，但脫毒效果好。普通以帶有1-2片葉原片葉原基為好，大小為基為好，大小為0.2-0.3mm為宜，超越為宜，超越0.5mm時(shí)，時(shí)，脫毒效果差。脫毒效果差。培育基培育基:只需能使莖尖快速生長(zhǎng)，分化快的培育基均只需能使莖尖快速生長(zhǎng)，分化快的培育基均適于脫毒。普通以適于脫毒。普通以MS較好，添加一定比例的細(xì)胞較好，添加一定比例的細(xì)胞

16、分裂素就行。分裂素就行。馬鈴薯馬鈴薯的芽的芽莖尖的構(gòu)造莖尖的構(gòu)造V i rus el i m i nati onw hy does the m eri st em have l ow / no vi rus t i t re? vi rus spreads pri m ari l y through vascul ar system -thi s i s not devel oped i n the m eri stem m i tosi s and chrom osom e repl i cati on com pete w i th vi rus repl i cati on hi gh

17、auxi n i n m eri stem i nhi bi ts vi rus repl i cati on a vi rus “ i nacti vati ng” system has greatest acti vi ty i n m eri stemTobacco m eri stemvi rus-freeti ssuevi rus parti cl esfound here微莖尖微莖尖普通莖尖普通莖尖馬鈴薯脫馬鈴薯脫毒苗毒苗康乃馨不同莖尖培育與康乃馨斑駁病毒的脫除情況康乃馨不同莖尖培育與康乃馨斑駁病毒的脫除情況(3)莖尖培育法脫除植物病毒的技術(shù)關(guān)鍵莖尖培育法脫除植物病毒的技術(shù)關(guān)鍵同一

18、種病毒在不同植物體內(nèi)分布部位不同。同一種病毒在不同植物體內(nèi)分布部位不同。例：煙草花葉病毒例：煙草花葉病毒(TMV)在如下植物中的熒光反響。在如下植物中的熒光反響。 煙草：煙草：l-4片葉原基中未見片葉原基中未見TMY特異熒光特異熒光 撞羽矮牽牛：一兩片葉原基未見撞羽矮牽牛：一兩片葉原基未見TMV特異熒特異熒 光，而在三四片葉原莖中可見光，而在三四片葉原莖中可見TMV熒光。熒光。 番茄：番茄：1片葉原莖中未見片葉原莖中未見TMV特異熒光。特異熒光。 所以在用莖尖培育脫毒時(shí)，必需仔細(xì)確定病毒在植所以在用莖尖培育脫毒時(shí)，必需仔細(xì)確定病毒在植物莖尖中的分布部位，然后確定培育莖尖的大小物莖尖中的分布部位

19、，然后確定培育莖尖的大小.如：番茄：只能取生長(zhǎng)錐或僅帶一片葉原基的莖如：番茄：只能取生長(zhǎng)錐或僅帶一片葉原基的莖 尖進(jìn)展培育；尖進(jìn)展培育； 撞羽矮牽牛：可取生長(zhǎng)錐或帶一兩片葉原基撞羽矮牽牛：可取生長(zhǎng)錐或帶一兩片葉原基 的莖尖進(jìn)展培育；的莖尖進(jìn)展培育； 煙草：可取帶煙草：可取帶4片葉原基的莖尖進(jìn)展培育。片葉原基的莖尖進(jìn)展培育。 利用莖尖堵養(yǎng)法脫除植物病毒時(shí)，最好找出莖原基利用莖尖堵養(yǎng)法脫除植物病毒時(shí)，最好找出莖原基所帶葉原基的數(shù)目與生長(zhǎng)點(diǎn)所帶葉原基的數(shù)目與生長(zhǎng)點(diǎn)(莖尖莖尖)大小的相關(guān)性，大小的相關(guān)性，這樣在取材時(shí)就方便多了。這樣在取材時(shí)就方便多了。 莖原基莖原基 0.050.08mm 莖原基帶莖原

20、基帶2片葉原基片葉原基 0.10.2mm 莖原基帶莖原基帶4片葉原基片葉原基 0.30.4mm 莖原基帶莖原基帶6片葉原基片葉原基 0.60.8mm不同病毒種類在同一種植物中分布部位不同。甘薯甘薯 斑紋花葉病毒、縮葉花葉病毒：斑紋花葉病毒、縮葉花葉病毒： 分布于分布于1.0- 2.0mm以內(nèi)的莖尖中以內(nèi)的莖尖中 羽毛狀花葉病毒：羽毛狀花葉病毒： 分布于分布于0.3-1.0mm以內(nèi)莖尖中以內(nèi)莖尖中 馬鈴薯馬鈴薯 馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯卷葉病毒、Y病毒：病毒： 分布于分布于1.0-3.0mm以內(nèi)的莖尖中；以內(nèi)的莖尖中； X病毒：分布于病毒：分布于0.2-0.5mm以內(nèi)的莖尖以內(nèi)的莖尖 G病毒：分布

21、于病毒：分布于0.2-0.3mm以內(nèi)的莖尖以內(nèi)的莖尖 S病毒：病毒：0.2mm以下以下 2.愈傷組織培育脫毒愈傷組織培育脫毒植物各部位器官和組織培育去分化誘導(dǎo)產(chǎn)植物各部位器官和組織培育去分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無病毒苗。生芽，長(zhǎng)成小植株，可以得到無病毒苗。闡明病毒顆粒會(huì)在愈傷組織的培育過程中闡明病毒顆粒會(huì)在愈傷組織的培育過程中逐漸消逝。逐漸消逝。愈傷組織脫病毒的機(jī)理愈傷組織脫病毒的機(jī)理 能夠的緣由有：能夠的緣由有： 病毒在植物體內(nèi)不同器官或同一器官的不同組病毒在植物體內(nèi)不同器官或同一器官的不同組織中分布不均勻，由那

22、些無病毒細(xì)胞增殖產(chǎn)生的織中分布不均勻，由那些無病毒細(xì)胞增殖產(chǎn)生的愈傷組織就是獲得無病毒苗的根底。愈傷組織就是獲得無病毒苗的根底。 有些愈傷組織細(xì)胞中病毒濃度較低，在愈傷組有些愈傷組織細(xì)胞中病毒濃度較低，在愈傷組織細(xì)胞快速分裂過程中，病毒的復(fù)制才干衰退或織細(xì)胞快速分裂過程中，病毒的復(fù)制才干衰退或喪失。喪失。 繼代培育的愈傷組織容易產(chǎn)生抗性變異細(xì)胞，繼代培育的愈傷組織容易產(chǎn)生抗性變異細(xì)胞，因此能夠出現(xiàn)不帶病毒的愈傷組織。但經(jīng)愈傷組因此能夠出現(xiàn)不帶病毒的愈傷組織。但經(jīng)愈傷組織產(chǎn)生無病毒苗的脫毒途徑容易產(chǎn)生變異，能夠織產(chǎn)生無病毒苗的脫毒途徑容易產(chǎn)生變異，能夠?qū)е轮仓陠适湓械膬?yōu)良性狀，當(dāng)然也有能夠?qū)?/p>

23、致植株喪失其原有的優(yōu)良性狀，當(dāng)然也有能夠產(chǎn)生有益的變異，但頻率極低。產(chǎn)生有益的變異，但頻率極低。3.莖尖微體嫁接脫毒莖尖微體嫁接脫毒先將砧木種子進(jìn)展外表消毒，以后再接到先將砧木種子進(jìn)展外表消毒，以后再接到1%瓊脂以瓊脂以MS無機(jī)無機(jī)鹽培育基培育發(fā)芽，用苗齡約鹽培育基培育發(fā)芽，用苗齡約2周的幼嫩實(shí)生苗作砧木。周的幼嫩實(shí)生苗作砧木。把實(shí)生苗從試管中取出，在無菌條件下切去頂部，留下把實(shí)生苗從試管中取出，在無菌條件下切去頂部，留下1-1.5cm的上胚軸部分，將子葉和液芽除去，把根切短至的上胚軸部分，將子葉和液芽除去，把根切短至46cm長(zhǎng)。長(zhǎng)。從田間或溫室旺盛生長(zhǎng)的成年樹剪取一小段新梢，經(jīng)消毒后從田間或

24、溫室旺盛生長(zhǎng)的成年樹剪取一小段新梢，經(jīng)消毒后在超凈臺(tái)上用顯微操作法取出僅帶在超凈臺(tái)上用顯微操作法取出僅帶1-3個(gè)葉原基的莖尖約個(gè)葉原基的莖尖約1mm大小作穗用。采用倒大小作穗用。采用倒T字形的程度切口。字形的程度切口。嫁接苗用液體濾低橋培育基培育。成活率嫁接苗用液體濾低橋培育基培育。成活率30%50%，嫁接，嫁接勝利的植株移植到土壤之前至少要有兩片展開的真葉。勝利的植株移植到土壤之前至少要有兩片展開的真葉。 蘋果微體嫁接莖尖大小與脫毒勝利率蘋果微體嫁接莖尖大小與脫毒勝利率蘋果不同取材時(shí)期對(duì)微體嫁接勝利率蘋果不同取材時(shí)期對(duì)微體嫁接勝利率的影響的影響蘋果微體嫁接莖尖大小與脫毒勝利率蘋果微體嫁接莖尖

25、大小與脫毒勝利率試管微體嫁接在果樹方面開展最快 (1)嫁接植物不受與珠心及有性實(shí)生苗相關(guān)嫁接植物不受與珠心及有性實(shí)生苗相關(guān)的幼年階段的影響。的幼年階段的影響。(2)許多栽培種類經(jīng)過嫁接繁衍了許多世代，許多栽培種類經(jīng)過嫁接繁衍了許多世代，因此果樹研討者和種植者關(guān)于這些種類因此果樹研討者和種植者關(guān)于這些種類的自根苗的根冠大小、病蟲害情況以及的自根苗的根冠大小、病蟲害情況以及耐寒性等了解得很少。耐寒性等了解得很少。(3)莖尖組織培育繁衍結(jié)合熱處置可產(chǎn)生無莖尖組織培育繁衍結(jié)合熱處置可產(chǎn)生無病毒植物，因此，許多研討者以為對(duì)通病毒植物，因此，許多研討者以為對(duì)通常采用嫁接繁衍的果樹進(jìn)展試管嫁接是常采用嫁接繁

26、衍的果樹進(jìn)展試管嫁接是很適宜的。很適宜的。(4)試管微體嫁接除了可培育無病毒植株外，試管微體嫁接除了可培育無病毒植株外，還可處理難以生根的園藝植物的生根問還可處理難以生根的園藝植物的生根問題和進(jìn)展嫁接親和力的研討。題和進(jìn)展嫁接親和力的研討。4.珠心胚培育脫毒 柑桔類80%以上的種類具有多胚性,而單胚占的比例很小。柑橘類植物中有不少多胚種類，一顆種子內(nèi)除一個(gè)合子胚外，還有數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)由珠心細(xì)胞構(gòu)成的無性胚，稱做珠心胚。由于病毒通常是經(jīng)維管束的韌皮組織傳播的，而珠心與維管束系統(tǒng)無直接聯(lián)絡(luò)。由珠心組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的植株就可免除病素毒的危害。它與合子胚不同，不是受精的產(chǎn)物，而是由體它與合子胚不同，不是受精

27、的產(chǎn)物，而是由體細(xì)胞產(chǎn)生的，因此具有和母體一樣的遺傳組成；細(xì)胞產(chǎn)生的，因此具有和母體一樣的遺傳組成；與合子胚一樣，在珠心胚和植株之間無維管組與合子胚一樣，在珠心胚和植株之間無維管組織連系，因此即使母體植株感染了病毒，珠心織連系，因此即使母體植株感染了病毒，珠心胚也是無毒的；胚也是無毒的；在自然條件下，珠心胚普通都不能發(fā)育成熟，在自然條件下，珠心胚普通都不能發(fā)育成熟，只需適時(shí)從種子中剝離出來，接種在人工培育只需適時(shí)從種子中剝離出來，接種在人工培育基上，珠心胚才干長(zhǎng)成植株，而這些植株該當(dāng)基上，珠心胚才干長(zhǎng)成植株，而這些植株該當(dāng)是不帶病毒的母體無性系。是不帶病毒的母體無性系。珠心胚具有珠心胚具有3個(gè)

28、特征個(gè)特征5.花藥培育脫毒花藥培育脫毒花藥培育的最初目的，是培育來源于花藥內(nèi)部花粉花藥培育的最初目的，是培育來源于花藥內(nèi)部花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種資粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種資料的來源。料的來源。但經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)闡明花藥培育所得的植株有但經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)闡明花藥培育所得的植株有95%以上以上是能開花結(jié)果的多倍體，而且生長(zhǎng)發(fā)育都優(yōu)于母是能開花結(jié)果的多倍體，而且生長(zhǎng)發(fā)育都優(yōu)于母株。株。已證明，經(jīng)愈傷組織培育出來的花藥植株是不帶病已證明，經(jīng)愈傷組織培育出來的花藥植株是不帶病毒的，借此方法，不僅可快速培育出大量的無毒毒的，借此方法，不僅可快速培育出大量的無毒植株，并可省去病毒鑒

29、定任務(wù)，對(duì)基層消費(fèi)運(yùn)用植株，并可省去病毒鑒定任務(wù)，對(duì)基層消費(fèi)運(yùn)用實(shí)為一舉兩得的事情。實(shí)為一舉兩得的事情。三、分別莖尖的培育情況三、分別莖尖的培育情況第一種：是生長(zhǎng)停頓，接種的組織并有擴(kuò)展，顏第一種：是生長(zhǎng)停頓，接種的組織并有擴(kuò)展，顏色逐漸變褐而枯死，這種情況大多是生長(zhǎng)點(diǎn)在色逐漸變褐而枯死，這種情況大多是生長(zhǎng)點(diǎn)在分別接種過程中受傷而呵斥的；分別接種過程中受傷而呵斥的；第二種：是生長(zhǎng)太慢，莖尖接種后顏色逐漸變綠，第二種：是生長(zhǎng)太慢，莖尖接種后顏色逐漸變綠，但不見增大，最后成綠色小點(diǎn)。這是由于生長(zhǎng)但不見增大，最后成綠色小點(diǎn)。這是由于生長(zhǎng)素濃度偏低，或培育溫度過低所呵斥的，假設(shè)素濃度偏低，或培育溫度過

30、低所呵斥的，假設(shè)立刻轉(zhuǎn)入較高濃度生長(zhǎng)素的培育基中，或提高立刻轉(zhuǎn)入較高濃度生長(zhǎng)素的培育基中，或提高培育溫度，即能促進(jìn)莖尖生長(zhǎng)；培育溫度，即能促進(jìn)莖尖生長(zhǎng)；第三種：是生長(zhǎng)過旺，接種后莖尖明顯增大，約培第三種：是生長(zhǎng)過旺，接種后莖尖明顯增大，約培育一同后即在莖尖基部產(chǎn)生愈傷組織，但不易見育一同后即在莖尖基部產(chǎn)生愈傷組織，但不易見到莖尖的伸長(zhǎng)，組織顏色也較澆。這是由于培育到莖尖的伸長(zhǎng)，組織顏色也較澆。這是由于培育莖生長(zhǎng)素濃度偏高，或光照弱，溫度高而呵斥的。莖生長(zhǎng)素濃度偏高，或光照弱，溫度高而呵斥的。為此應(yīng)將培育資料轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)素濃度較低的培育基為此應(yīng)將培育資料轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)素濃度較低的培育基中，或降低溫度，提高

31、光照強(qiáng)度來處理。否那么中，或降低溫度，提高光照強(qiáng)度來處理。否那么時(shí)間長(zhǎng)了愈傷組織會(huì)表換生長(zhǎng)分化才干；時(shí)間長(zhǎng)了愈傷組織會(huì)表換生長(zhǎng)分化才干；第四種：是生長(zhǎng)正常、在營(yíng)養(yǎng)、激素、溫度、光照第四種：是生長(zhǎng)正常、在營(yíng)養(yǎng)、激素、溫度、光照等各方面條件正常的情況下，接種的莖尖顏色逐等各方面條件正常的情況下，接種的莖尖顏色逐漸變綠，基部逐漸增大，有時(shí)構(gòu)成少量的愈傷組漸變綠，基部逐漸增大，有時(shí)構(gòu)成少量的愈傷組織，莖尖也逐漸伸長(zhǎng)，培育一個(gè)月左右轉(zhuǎn)入無基織，莖尖也逐漸伸長(zhǎng)，培育一個(gè)月左右轉(zhuǎn)入無基素的根本培育基，莖尖繼續(xù)伸長(zhǎng)，并產(chǎn)生根系，素的根本培育基，莖尖繼續(xù)伸長(zhǎng)，并產(chǎn)生根系，最后發(fā)育成完好植株。最后發(fā)育成完好植株。

32、第三節(jié)第三節(jié) 無病毒植株脫毒程序無病毒植株脫毒程序一、資料預(yù)備一、資料預(yù)備1決議植物種類及種類。選用生長(zhǎng)強(qiáng)決議植物種類及種類。選用生長(zhǎng)強(qiáng)壯，遺傳性一致的種類為資料，并探壯，遺傳性一致的種類為資料，并探明該種類除所脫除明該種類除所脫除 的病毒在寄主中的位置。的病毒在寄主中的位置。2了解該植物體內(nèi)所具有的病毒種類了解該植物體內(nèi)所具有的病毒種類及危害的程及危害的程 度。根據(jù)植物所帶病毒種度。根據(jù)植物所帶病毒種類，選擇指示植物類，選擇指示植物(敏感植物敏感植物)。3決議脫除病毒的方法：決議脫除病毒的方法：“莖尖培育莖尖培育還是還是“熱處置還是熱處置還是“微體嫁接。微體嫁接。二、生長(zhǎng)點(diǎn)分別和培育二、生長(zhǎng)

33、點(diǎn)分別和培育(莖尖培育為例莖尖培育為例)1從罹病的植株上切取頂芽或腋芽。從罹病的植株上切取頂芽或腋芽。2資料外表滅菌、決議滅菌藥劑、濃度、時(shí)間。資料外表滅菌、決議滅菌藥劑、濃度、時(shí)間。3根據(jù)病毒在寄主內(nèi)分布位置決議切取莖尖大小。根據(jù)病毒在寄主內(nèi)分布位置決議切取莖尖大小。假設(shè)熱處置，那么決議熱處置的溫度、時(shí)間。假設(shè)熱處置，那么決議熱處置的溫度、時(shí)間。4接種勝利率與莖外形構(gòu)造有關(guān)。接種勝利率與莖外形構(gòu)造有關(guān)。例例 馬鈴薯、百合生長(zhǎng)點(diǎn)呈半圓形較大、好分別。馬鈴薯、百合生長(zhǎng)點(diǎn)呈半圓形較大、好分別。 番薯、矮牽牛、香石竹呈半圓形，也比較好分番薯、矮牽牛、香石竹呈半圓形，也比較好分別。別。 大麗花、菊花生

34、長(zhǎng)點(diǎn)扁平、并被對(duì)生葉原基夾大麗花、菊花生長(zhǎng)點(diǎn)扁平、并被對(duì)生葉原基夾住難分別。住難分別。 草莓，葉原基上生有密集茸毛，生長(zhǎng)點(diǎn)埋在肉草莓，葉原基上生有密集茸毛，生長(zhǎng)點(diǎn)埋在肉質(zhì)凹形槽質(zhì)凹形槽 內(nèi)，不僅難分別且容易污染。內(nèi)，不僅難分別且容易污染。三、無病毒植物的鑒定三、無病毒植物的鑒定經(jīng)過莖尖分生組織培育、熱處置脫毒法、微體嫁經(jīng)過莖尖分生組織培育、熱處置脫毒法、微體嫁接法而培育成的植株，不一定都是無病毒植株。接法而培育成的植株，不一定都是無病毒植株。當(dāng)前用于病毒檢測(cè)的方法有如下當(dāng)前用于病毒檢測(cè)的方法有如下3種：種：血清鑒定法；血清鑒定法；生物鑒定法生物鑒定法(敏感植物或指示植物敏感植物或指示植物)；電

35、子顯微鏡鑒定法。電子顯微鏡鑒定法。采用單一鑒定法并不非?？煽俊Ｌ貏e是對(duì)一些特采用單一鑒定法并不非?？煽俊Ｌ貏e是對(duì)一些特異性病毒，單一鑒定方法可靠性更差。最好三異性病毒，單一鑒定方法可靠性更差。最好三種方法同時(shí)鑒定，可以獲得理想的結(jié)果。種方法同時(shí)鑒定，可以獲得理想的結(jié)果。(一一)指示植物鑒定法指示植物鑒定法1、原理、原理 指示植物法是利用病毒在其它植指示植物法是利用病毒在其它植物上產(chǎn)生的枯斑作為病毒種類鑒物上產(chǎn)生的枯斑作為病毒種類鑒別的規(guī)范，也即枯斑和空斑測(cè)定別的規(guī)范，也即枯斑和空斑測(cè)定法。法。2、指示植物兩種類型、指示植物兩種類型一種是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性病癥，出如今病毒一種是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性病癥

36、，出如今病毒擴(kuò)展到的植物非接合部位，通常沒有部分?jǐn)U展到的植物非接合部位，通常沒有部分明顯病斑；明顯病斑；另一種是只產(chǎn)生部分病斑，常由壞死、褪綠另一種是只產(chǎn)生部分病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)斑構(gòu)成。或環(huán)斑構(gòu)成。常用的指示植物：千日紅、曼陀羅、豇豆、常用的指示植物：千日紅、曼陀羅、豇豆、心葉煙、辣椒、莨菪等。心葉煙、辣椒、莨菪等。 每種病毒都有本人的敏感植物如：每種病毒都有本人的敏感植物如：馬鈴薯病毒的敏感植物：千日紅、黃花煙、心葉馬鈴薯病毒的敏感植物：千日紅、黃花煙、心葉煙、煙、 毛葉曼陀羅；毛葉曼陀羅；大蒜病毒的敏感植物：藜、千日紅；大蒜病毒的敏感植物：藜、千日紅；草莓病毒的敏感植物：威州草莓草莓

37、病毒的敏感植物：威州草莓(從八倍體野生種從八倍體野生種選出選出)、野草莓、野紅草莓等。、野草莓、野紅草莓等。桃紅葉病毒的敏感植物：旱金蓮。桃紅葉病毒的敏感植物：旱金蓮。大麗花病毒的敏感植物：昆落阿藜、莧色藜、心大麗花病毒的敏感植物：昆落阿藜、莧色藜、心葉煙、克里芙蘭煙、矮牽牛、黃瓜。葉煙、克里芙蘭煙、矮牽牛、黃瓜。香石竹病毒的敏感植物：昆落阿藜、莧色藜。香石竹病毒的敏感植物：昆落阿藜、莧色藜。菊花病毒的敏感植物：矮牽牛、豇豆。菊花病毒的敏感植物：矮牽牛、豇豆。3、敏感植物鑒定病毒的方法：、敏感植物鑒定病毒的方法： A、摩擦接種法：、摩擦接種法：取培育植株的葉片榨汁，將其汁用摩擦法接取培育植株的

38、葉片榨汁，將其汁用摩擦法接種到各自的敏感植物上，然后視其病斑有種到各自的敏感植物上，然后視其病斑有無，來判別能否脫除了病毒。無，來判別能否脫除了病毒。接種后如假設(shè)敏感植物葉片表現(xiàn)病斑，可根接種后如假設(shè)敏感植物葉片表現(xiàn)病斑，可根據(jù)病斑類型判別，還有哪種病毒沒有脫除。據(jù)病斑類型判別，還有哪種病毒沒有脫除。 例：馬鈴薯體內(nèi)各種病毒在其敏感植物上表現(xiàn)的例：馬鈴薯體內(nèi)各種病毒在其敏感植物上表現(xiàn)的病癥：病癥：X病毒侵染千日紅病毒侵染千日紅(葉片呈枯斑葉片呈枯斑)；M、S病毒侵染千日紅病毒侵染千日紅(葉片呈突起枯斑葉片呈突起枯斑)；X病毒侵染黃花煙病毒侵染黃花煙(葉片呈花葉葉片呈花葉)；Y病毒侵染黃花煙病毒

39、侵染黃花煙(葉片花葉或條斑或呈明顯脈綠葉片花葉或條斑或呈明顯脈綠帶帶)；X病毒侵染心葉煙病毒侵染心葉煙(葉片呈花葉葉片呈花葉)；Y病毒侵染心葉煙病毒侵染心葉煙(葉片呈條斑葉片呈條斑)；PG帶毒體侵帶毒體侵染心葉煙染心葉煙(葉片呈花葉葉片呈花葉)；M、Y病毒侵染毛葉曼陀羅病毒侵染毛葉曼陀羅(葉片呈枯斑葉片呈枯斑)。植物汁液摩擦接種后，如使千日紅葉片呈枯斑，植物汁液摩擦接種后，如使千日紅葉片呈枯斑，使黃花煙、心葉煙葉片呈花葉證明，該植物體使黃花煙、心葉煙葉片呈花葉證明，該植物體內(nèi)具有馬鈴薯內(nèi)具有馬鈴薯X病毒。病毒。B嫁接法：嫁接法：有些病毒不是經(jīng)過汁液傳播，而是經(jīng)過專有些病毒不是經(jīng)過汁液傳播，而是

40、經(jīng)過專門的介體傳播。如草莓黃化病毒、草莓門的介體傳播。如草莓黃化病毒、草莓叢枝病毒是經(jīng)過一種特殊的蚜蟲為介體叢枝病毒是經(jīng)過一種特殊的蚜蟲為介體進(jìn)展傳播。進(jìn)展傳播。這種病毒的鑒定，需將培育植株的芽嫁接這種病毒的鑒定，需將培育植株的芽嫁接在敏感植物上，根據(jù)敏感植物的病癥表在敏感植物上，根據(jù)敏感植物的病癥表現(xiàn)來判別能否脫除了病毒?，F(xiàn)來判別能否脫除了病毒。木本多年生植物及草莓等無性繁衍的草本木本多年生植物及草莓等無性繁衍的草本植物通常采用嫁接接種的方法植物通常采用嫁接接種的方法以指示植物作砧木，被鑒定植物作接穗，可采用以指示植物作砧木，被鑒定植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法劈

41、接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法為多。為多。如草莓以對(duì)病毒敏感的歐洲草莓野草莓和深如草莓以對(duì)病毒敏感的歐洲草莓野草莓和深紅莓作指示植物，從經(jīng)脫毒得到的植株上僅取紅莓作指示植物，從經(jīng)脫毒得到的植株上僅取成齡葉片頂端一小葉作接穗，葉柄用刀片削成成齡葉片頂端一小葉作接穗，葉柄用刀片削成楔形，削面長(zhǎng)楔形，削面長(zhǎng)810 mm，然后迅速將接穗小葉，然后迅速將接穗小葉的葉柄插入切口，用塑料綁縛接合部，嫁接后的葉柄插入切口，用塑料綁縛接合部，嫁接后4周，假設(shè)帶有病毒，那么在新展開的葉片、周，假設(shè)帶有病毒，那么在新展開的葉片、匍匐莖或老葉上會(huì)出現(xiàn)病征匍匐莖或老葉上會(huì)出現(xiàn)病征 二抗血清鑒定法1、根本原理：、

42、根本原理：當(dāng)動(dòng)物被病毒感染或人工注射異體當(dāng)動(dòng)物被病毒感染或人工注射異體蛋白質(zhì)時(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一蛋白質(zhì)時(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一種特異性丙種球蛋白稱為免疫球種特異性丙種球蛋白稱為免疫球蛋白，即所謂蛋白，即所謂“抗體?？贵w。引起構(gòu)成抗體的物質(zhì)引起構(gòu)成抗體的物質(zhì)(病毒或異體病毒或異體蛋白蛋白)稱為稱為“抗原?？乖?抗原和抗體結(jié)合，表現(xiàn)為很強(qiáng)的特抗原和抗體結(jié)合，表現(xiàn)為很強(qiáng)的特異性。即由一種病毒產(chǎn)生的抗體，異性。即由一種病毒產(chǎn)生的抗體，只能結(jié)合該種病毒?？贵w在特殊細(xì)只能結(jié)合該種病毒。抗體在特殊細(xì)胞內(nèi)構(gòu)成，進(jìn)入血液存在于血清和胞內(nèi)構(gòu)成，進(jìn)入血液存在于血清和體液內(nèi)。體液內(nèi)。 這種含有特異性這種含有特異性“

43、抗體的血清稱為抗體的血清稱為“抗血清。抗原和抗體相結(jié)合的反抗血清?？乖涂贵w相結(jié)合的反響稱為響稱為“血清反響。血清反響。2.病毒抗血清在診斷上的價(jià)值。病毒抗血清在診斷上的價(jià)值。A.病毒抗血清具有高度的?；浴＜从梢环N病毒產(chǎn)生的“抗體，只能結(jié)合該種病毒(抗原)。如由注射(感染)TMV而產(chǎn)生的抗體(免疫球蛋白)，只能檢測(cè)TMV病毒(才能夠發(fā)生血清反響)。B由于“抗血清法具有高度專化性，因此對(duì)于那些受感染而沒有病癥的帶毒植物，也能診斷，故在適用上具有很高的價(jià)值。C由于病毒與“抗血清的“反響量與病毒濃度成正比。只需知道其中一種濃度，可根據(jù)反響量來測(cè)定另一種的濃度。故此可以用來作病毒的定量分析。3.病毒

44、抗血清在診斷上的局限性：病毒抗血清在診斷上的局限性：A.不是一切病毒都能制成抗血清，普通不是一切病毒都能制成抗血清，普通“黃化型黃化型病毒，或嚴(yán)厲由?；岳ハx傳播的病毒。如病毒，或嚴(yán)厲由專化性昆蟲傳播的病毒。如馬鈴薯卷葉病毒極難或不能獲得馬鈴薯卷葉病毒極難或不能獲得“抗血清。抗血清。B病毒在寄主體內(nèi)含量太少，而提純過程中喪病毒在寄主體內(nèi)含量太少，而提純過程中喪失又太多?；蛘咛峒冞^程中，病毒質(zhì)粒喪失了失又太多?；蛘咛峒冞^程中，病毒質(zhì)粒喪失了必備的抗原構(gòu)造。必備的抗原構(gòu)造。C植物體內(nèi)具有單寧物質(zhì)，單寧與病毒結(jié)合，植物體內(nèi)具有單寧物質(zhì)，單寧與病毒結(jié)合，使病毒喪失了抗原性質(zhì)。使病毒喪失了抗原性質(zhì)。4.

45、方法方法 抗血清鑒定首先要進(jìn)展抗原的制備，包括病毒抗血清鑒定首先要進(jìn)展抗原的制備，包括病毒的繁衍、病葉研磨、汁液的廓清、病毒懸浮液的繁衍、病葉研磨、汁液的廓清、病毒懸浮液的提純、病毒的沉淀等過程。只需獲得高純度的提純、病毒的沉淀等過程。只需獲得高純度的抗原，才有能夠獲得高度純真的抗血清。的抗原，才有能夠獲得高度純真的抗血清。 普通采用家兔制備抗植物病毒的抗血清，以普通采用家兔制備抗植物病毒的抗血清，以924個(gè)月大小的家兔為好，注射病毒懸浮液，個(gè)月大小的家兔為好，注射病毒懸浮液，在家兔饑餓在家兔饑餓12 h后采血，再進(jìn)展抗血清的分別后采血，再進(jìn)展抗血清的分別和吸收等過程。血清可分裝在小玻璃瓶中，

46、儲(chǔ)和吸收等過程。血清可分裝在小玻璃瓶中，儲(chǔ)存在存在1520 的冰凍條件下，也可以分裝的冰凍條件下，也可以分裝在安瓶中，冷凍枯燥，然后密封，有效保管。在安瓶中，冷凍枯燥，然后密封，有效保管。 詳細(xì)測(cè)定可采用沉淀反響、凝集反響、詳細(xì)測(cè)定可采用沉淀反響、凝集反響、免疫分散、免疫電泳、熒光抗體技術(shù)和免疫分散、免疫電泳、熒光抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等多種方法。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等多種方法。酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法 (enzyme 1inked immunOsOrbentassay，EL工工SA) 酶聯(lián)免疫吸附法是把抗原酶聯(lián)免疫吸附法是把抗原抗體的免疫抗體的免疫反響與酶的催化反響相互結(jié)合而開展起反響與

47、酶的催化反響相互結(jié)合而開展起來的一種綜合性技術(shù)，它的靈敏度高，來的一種綜合性技術(shù)，它的靈敏度高，特異性強(qiáng)，特別是當(dāng)寄主體內(nèi)病毒濃度特異性強(qiáng)，特別是當(dāng)寄主體內(nèi)病毒濃度很低或同時(shí)存在病毒鈍化物或抑制劑時(shí)，很低或同時(shí)存在病毒鈍化物或抑制劑時(shí)，它的優(yōu)勢(shì)尤為明顯，因此是近年來病毒它的優(yōu)勢(shì)尤為明顯，因此是近年來病毒檢測(cè)方法中開展最快、運(yùn)用最廣的一種檢測(cè)方法中開展最快、運(yùn)用最廣的一種方法。方法。 酶聯(lián)免疫吸附法的原理酶聯(lián)免疫吸附法的原理 利用以酶標(biāo)志的特異抗體來指示抗原利用以酶標(biāo)志的特異抗體來指示抗原抗體的抗體的結(jié)合，從而檢出樣品中的抗原。結(jié)合，從而檢出樣品中的抗原。 詳細(xì)操作程序是：將待檢植物汁液詳細(xì)操作

48、程序是：將待檢植物汁液(抗原抗原)注入注入酶聯(lián)板酶聯(lián)板(聚苯乙烯多孔微量反響板聚苯乙烯多孔微量反響板)中，使抗原中，使抗原吸附于它的孔壁，然后參與以酶標(biāo)志的特異抗吸附于它的孔壁，然后參與以酶標(biāo)志的特異抗體，待抗原與抗體充分反響后，洗去未與抗原體，待抗原與抗體充分反響后，洗去未與抗原結(jié)合的多余酶標(biāo)志抗體，于是在固相載體酶聯(lián)結(jié)合的多余酶標(biāo)志抗體，于是在固相載體酶聯(lián)板外表就只留下以酶標(biāo)志的抗原板外表就只留下以酶標(biāo)志的抗原抗體復(fù)合物?？贵w復(fù)合物。這時(shí)參與酶的無色底物，復(fù)合物上的酶催化底這時(shí)參與酶的無色底物，復(fù)合物上的酶催化底物降解，生成有色產(chǎn)物。這一結(jié)果可用肉眼識(shí)物降解，生成有色產(chǎn)物。這一結(jié)果可用肉眼

49、識(shí)別，也可用分光光度計(jì)對(duì)底物的降解量進(jìn)展測(cè)別，也可用分光光度計(jì)對(duì)底物的降解量進(jìn)展測(cè)定。定。血清鑒定血清鑒定法法血清鑒定的根本方法血清鑒定的根本方法 A.玻璃片凝集法玻璃片凝集法 在清潔玻璃片的一端，用毛細(xì)管滴加在清潔玻璃片的一端，用毛細(xì)管滴加5滴滴稀稀“抗血清，另一端滴加等量對(duì)照血清?？寡澹硪欢说渭拥攘繉?duì)照血清。然后各加滴被檢植物壓榨出的原汁液兩然后各加滴被檢植物壓榨出的原汁液兩滴。用玻璃棒攪勻，在常溫下靜置滴。用玻璃棒攪勻，在常溫下靜置20-50min，然后在，然后在40-60倍顯微鏡下察看。倍顯微鏡下察看。帶病毒的葉綠體發(fā)生典型的凝集景象。帶病毒的葉綠體發(fā)生典型的凝集景象。玻璃片玻璃片

50、凝集法凝集法 B微量凝集實(shí)驗(yàn)微量凝集實(shí)驗(yàn)(MAT) 在培育皿底部，鋪上一層火棉膠或聚乙在培育皿底部，鋪上一層火棉膠或聚乙烯醇縮甲醛薄膜，然后將抗血清滴入薄烯醇縮甲醛薄膜，然后將抗血清滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆蓋一層石蠟?zāi)ど?，再在血清液滴上方覆蓋一層石蠟油。在油。在2025下保溫，下保溫，20-50min后察后察看?？?。 此法優(yōu)點(diǎn)：鑒定時(shí)可以完全防止蒸發(fā)，此法優(yōu)點(diǎn)：鑒定時(shí)可以完全防止蒸發(fā)，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加150次，每培育皿可以鑒定幾十個(gè)樣品。對(duì)次，每培育皿可以鑒定幾十個(gè)樣品。對(duì)某些病毒某些病毒(馬鈴薯馬鈴薯M病毒病毒)引起的細(xì)微病毒引起的細(xì)微病

51、毒凝聚景象均可識(shí)別。凝聚景象均可識(shí)別。 三電子顯微鏡檢查法三電子顯微鏡檢查法采用電子顯微鏡，可以經(jīng)過直接察看，檢查出有無采用電子顯微鏡，可以經(jīng)過直接察看，檢查出有無病毒存在，并可以得知有關(guān)病毒顆粒的大小、外病毒存在，并可以得知有關(guān)病毒顆粒的大小、外形和構(gòu)造形和構(gòu)造,又可以鑒定病毒的種類。這是一種較為又可以鑒定病毒的種類。這是一種較為先進(jìn)的方法，但需一定的設(shè)備和技術(shù)。先進(jìn)的方法，但需一定的設(shè)備和技術(shù)。 病毒病毒 形狀形狀 長(zhǎng)長(zhǎng)(nm) 寬寬nm X 線線 狀狀 515 13 Y 線線 狀狀 730 11 A 線線 狀狀 730 11 S 線線 狀狀 650 1213 M 線線 狀狀 650 12

52、13 靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測(cè)定病毒。靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測(cè)定病毒。 目前運(yùn)用負(fù)染和超薄切片電鏡察看可以診斷和目前運(yùn)用負(fù)染和超薄切片電鏡察看可以診斷和鑒別病毒到屬的程度。鑒別病毒到屬的程度。 1973年，年，Derrick把電鏡與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合，把電鏡與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合，建立了更為靈敏的免疫吸附電鏡技術(shù)，該技術(shù)建立了更為靈敏的免疫吸附電鏡技術(shù)，該技術(shù)已成為植物病毒研討的一個(gè)重要手段。已成為植物病毒研討的一個(gè)重要手段。方法的優(yōu)點(diǎn)方法的優(yōu)點(diǎn)(四四)分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法在植物病毒鑒定中采用的分子生物學(xué)方法主要是檢測(cè)病毒的核酸。普通都具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等

53、特點(diǎn)。核酸雜交技術(shù)的原理:采用帶有放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)志的知序列核酸單鏈作為探針，在一定條件下與靶病毒的核酸單鏈退火構(gòu)成雜交雙鏈。經(jīng)過雜交信號(hào)的檢測(cè)，鑒定樣本中有無相應(yīng)病毒的基因。 19世紀(jì)末以來，許多國(guó)家開場(chǎng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒词兰o(jì)末以來，許多國(guó)家開場(chǎng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒错戫?PCR)技術(shù)檢測(cè)果樹病毒，并獲得很好的效技術(shù)檢測(cè)果樹病毒，并獲得很好的效果。果。 常用的有聚合酶鏈?zhǔn)椒错懗Ｓ玫挠芯酆厦告準(zhǔn)椒错?polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)，即利用知病毒的核苷酸技術(shù)，即利用知病毒的核苷酸序列或同組病毒的類似序列區(qū)域來設(shè)計(jì)引物，序列或同組病毒的類似序列區(qū)域來設(shè)計(jì)引物，將待測(cè)樣品

54、用將待測(cè)樣品用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增技術(shù)體外擴(kuò)增DNA，擴(kuò)增后，擴(kuò)增后的產(chǎn)物可進(jìn)展限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的產(chǎn)物可進(jìn)展限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA RAPD)、擴(kuò)增片、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、變性梯度凝膠電泳、變性梯度凝膠電泳(denaturing grade gel electrophoresis，DGGE)、單鏈構(gòu)

55、象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformation polymorphism，SSCP)、探針交叉雜交等技術(shù)、探針交叉雜交等技術(shù)分析檢測(cè)病毒能否存在。分析檢測(cè)病毒能否存在。由于多數(shù)植物病毒核酸是由于多數(shù)植物病毒核酸是RNA，在進(jìn)展，在進(jìn)展PCR檢測(cè)檢測(cè)前，需以前，需以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，后，再利用病毒核酸特有的序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)展再利用病毒核酸特有的序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)展PCR反響，即可知道在寄主中能否有病毒存在。反響，即可知道在寄主中能否有病毒存在。RNA病毒和類病毒等在寄主體內(nèi)可構(gòu)成雙鏈病毒和類病毒等在寄主體內(nèi)可構(gòu)成雙鏈RNA(dsR

56、NA)，而普通情況下植物體內(nèi)不存在，而普通情況下植物體內(nèi)不存在dsRNA，因此，因此dsRNA分析也可用于植物病毒鑒分析也可用于植物病毒鑒定。定。利用利用DNA雜交和熒光標(biāo)志技術(shù)相結(jié)合雜交和熒光標(biāo)志技術(shù)相結(jié)合的基因芯片技術(shù)也是植物病毒快速的基因芯片技術(shù)也是植物病毒快速檢測(cè)的重要開展方向。檢測(cè)的重要開展方向。在實(shí)踐運(yùn)用中，為了提高檢測(cè)的可靠在實(shí)踐運(yùn)用中，為了提高檢測(cè)的可靠性，往往用幾種方法同時(shí)鑒定。最性，往往用幾種方法同時(shí)鑒定。最后選擇出的無毒苗即可進(jìn)展擴(kuò)增繁后選擇出的無毒苗即可進(jìn)展擴(kuò)增繁衍，用于消費(fèi)。但在無毒種苗的擴(kuò)衍，用于消費(fèi)。但在無毒種苗的擴(kuò)增繁衍和運(yùn)用過程中應(yīng)留意防止再增繁衍和運(yùn)用過程中

57、應(yīng)留意防止再度感染。度感染。植物脫毒苗消費(fèi)運(yùn)用尚不普遍，緣由如下：植物脫毒苗消費(fèi)運(yùn)用尚不普遍，緣由如下：根底研討跟不上，諸如病毒特性與寄主的根底研討跟不上，諸如病毒特性與寄主的關(guān)系，各植物種體內(nèi)都有什么病毒等。關(guān)系，各植物種體內(nèi)都有什么病毒等。脫毒培育后如何快速檢測(cè)。脫毒培育后如何快速檢測(cè)。得到脫毒原種苗后，如何保管得到脫毒原種苗后，如何保管?如何防止如何防止再度侵染等。再度侵染等。四、無毒原種苗的繁衍四、無毒原種苗的繁衍 經(jīng)莖尖培育法，熱處置法、微體嫁接法獲得經(jīng)莖尖培育法，熱處置法、微體嫁接法獲得的無病毒株數(shù)量是很有限的，需擴(kuò)展繁衍才的無病毒株數(shù)量是很有限的，需擴(kuò)展繁衍才干滿足消費(fèi)需求。干滿足消費(fèi)需求。 一方面充分發(fā)揚(yáng)組織培育作用，在室內(nèi)加速一方面充分發(fā)揚(yáng)組織培育作用，在室內(nèi)加速繁衍；另一方面加速田間繁衍。繁衍；另一方面加速田間繁衍。 與此同時(shí)對(duì)脫毒株系進(jìn)展植物學(xué)性狀鑒定，與此同時(shí)對(duì)脫毒株系進(jìn)展植物學(xué)性狀鑒定，遺傳穩(wěn)定性鑒定，并根據(jù)病毒鑒定結(jié)果，淘遺傳穩(wěn)定性鑒定，并根據(jù)病毒鑒