杜仲飲片HPCE指紋圖譜的研究(中藥材)

1、杜仲飲片HPCE指紋圖譜的研究摘要 目的： 建立杜仲飲片HPCE-DAD指紋圖譜分析方法，并對杜仲及其炮制品的指紋譜進(jìn)行比較。方法：采用高效毛細(xì)管電泳法進(jìn)行色譜分離，以60mmol·L 1硼砂-20 mmol·L 1 磷酸二氫鈉-10%甲醇(pH= 10.0)為運(yùn)行緩沖液，分離電壓為20 kV，波長為210nm，以松脂醇二葡萄糖苷為參照物（IS），測定其指紋圖譜，并作模糊聚類法分析和相似度評價(jià)。結(jié)果： 初步建立了以10個(gè)共有峰為特征指紋信息的杜仲飲片HPCE-DAD指紋圖譜；發(fā)現(xiàn)少數(shù)杜仲飲片的指紋圖譜有一定差異，生品與其炮制品的指紋譜中共有峰相對峰面積差異顯著。結(jié)論： 方法

2、準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，可作為杜仲飲片內(nèi)在質(zhì)量評價(jià)的依據(jù)。關(guān)鍵詞 杜仲；高效毛細(xì)管電泳二極管陣列檢測法；指紋圖譜Studies on HPCE-DAD fingerprint of Eucommiae CortexFU Xing-sheng, HAN Le , LIU Xun-hong*, XU Hu , LI Jun-song , CAI Bao-chang，YANG Yan(Nanjing University of Chinese Medicine, Nangjing 210046, China)Abstract Objective: To establish the analytical

3、method for the fingerprint of Eucommiae Cortex by HPCE-DAD and compare the fingerprints of Eucommiae Cortex and its processed products. Method: Based on the mode of high performance capillary electrophoresis，60mmol·L-1 sodium borate-20 mmol·L1 sodium dihydrogen phosphate-10% methanol (pH10

4、.0) was used as buffer solution. The separation voltage was 20 kV and the detection wavelength was set at 210 nm. Pinoresinol diglucoside was used as a reference standard，the chromatographic fingerprint were determined. The data were analyzed by fuzzy cluster and fingerprint similarity evaluation so

5、ftware to compare the similarity of samples. Result: HPCE-DAD fingerprints with 10 common peaks of Eucommiae Cortex were established preliminarily. It was discovered that a small number of samples differed from others. Regarding to the fingerprints of Eucommiae Cortex and its processed products，ther

6、e were obvious differences in the relative areas of common peaks. Conclusion: The method is reliable， accurate and can be used for quality control of Eucommiae Cortex.Key words Eucommiae Cortex；HPCE-DAD；Fingerprint杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎等功效，用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈?zāi)垦！⑷焉锫┭?、胎?dòng)不安

7、等癥1。現(xiàn)代研究表明，松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸和環(huán)烯醚萜苷類為主要活性成分。目前，多采用高效液相色譜法，以松脂醇二葡萄糖苷或綠原酸等含量為質(zhì)控指標(biāo)，分析和評價(jià)杜仲藥材或飲片的質(zhì)量2-6，這種對一種或幾種成分的檢測不足以全面反映藥材的質(zhì)量，也缺乏專屬性。中藥色譜指紋圖譜用于中藥質(zhì)量控制，比目前沿用的方法提供的信息要豐富，高效液相色譜法已應(yīng)用于杜仲的指紋圖譜研究7,8。本文采用高效毛細(xì)管電泳法對杜仲飲片指紋圖譜的構(gòu)建進(jìn)行了探討，并與其炮制品進(jìn)行比較分析，以期為規(guī)范杜仲飲片市場及確保藥材內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性提供較全面的質(zhì)量控制手段。1 儀器與材料G1600-AX高效毛細(xì)管電泳儀（美國Agilen

8、t公司），配惠普化學(xué)工作站、二極管陣列檢測器（DAD）、自動(dòng)進(jìn)樣器；Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；pHS-3C型pH計(jì)（上?？祪x儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。硼砂（南京化學(xué)試劑一廠，分析純），氫氧化鈉（上?；瘜W(xué)試劑有限公司，分析純），磷酸二氫鈉（汕頭金砂化工廠，分析純），甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純），無水乙醇（南京化學(xué)試劑有限公司，分析純），乙酸（南京化學(xué)試劑有限公司，分析純），配制緩沖溶液和供試品溶液所用的水均為重蒸餾水。對照品：松脂醇二葡萄糖苷（pinoresinol diglucoside，批號(hào)：1153

9、7-200501）、桃葉珊瑚苷（aucubin，批號(hào)：111761-200601）、京尼平苷（geniposide，批號(hào)：110749-200714）、綠原酸（chlorogenic acid，批號(hào)：110753-200413）、哈巴苷（harpagide，批號(hào)：111729-200602）均購于中國藥品生物制品檢定所。樣品：杜仲不同產(chǎn)地（批次）樣品編號(hào)見表1。S1S10為杜仲藥材商品，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉訓(xùn)紅教授鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮。S11、S12為S3相對應(yīng)的炮制品，按2010年版中國藥典規(guī)定自制。留樣憑證存放于南京中醫(yī)

10、藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。表1 杜仲樣品編號(hào)樣品產(chǎn)地樣品提供單位批號(hào)S1杜仲湖北南京市中醫(yī)院080811S2杜仲貴州南中醫(yī)藥大百草堂100615S3杜仲四川江蘇省中醫(yī)院20100726S4杜仲四川南京軒德堂中醫(yī)門診部100802S5杜仲四川安徽國鑫中藥飲片有限公司100612S6杜仲四川安徽省亳州市藥材總公司100925S7杜仲江西安徽省亳州市永剛飲片廠20070801S8杜仲四川南京藥業(yè)股份有限公司中藥飲片廠101218S9杜仲四川南中醫(yī)藥大國醫(yī)堂101115S10杜仲江西南京市交通醫(yī)院110201S11炒杜仲四川江蘇省中醫(yī)院20100726S12鹽杜仲四川江蘇省中醫(yī)院20100726

11、2 方法與結(jié)果2.1 電泳條件 未涂漬標(biāo)準(zhǔn)熔融石英毛細(xì)管（64.5 cm´ 75 µm，有效長度56 cm，Agilent科技有限公司）；運(yùn)行緩沖液：60mmol·L1硼砂-20 mmol·L1 磷酸二氫鈉-10%甲醇(pH= 10.0)；檢測波長：210 nm；分離電壓：20 kV；壓力進(jìn)樣：5 kPa×6 s；毛細(xì)管溫度：25 。毛細(xì)管使用前依次用0.1 mmol·L1氫氧化鈉溶液、重蒸餾水和運(yùn)行緩沖液壓力沖洗5、10、5 min，樣品分析間隔用0.1 mmol·L1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液平衡3、5、5 min。上述試

12、劑使用前均經(jīng)0.22m濾膜過濾，并超聲脫氣。2.2 對照品溶液制備 取桃葉珊瑚苷20.00mg、京尼平苷5.13mg、松脂醇二葡萄糖苷10.20mg、哈巴苷19.90mg，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中；取綠原酸10.20mg，精密稱定，置于5mL量瓶中，上述對照品用50%甲醇溶解并定容。制得濃度分別為桃葉珊瑚苷2.000mg·mL-1、京尼平苷0.513mg·mL-1、松脂醇二葡萄糖苷1.020mg·mL-1、哈巴苷1.990 mg·mL-1、綠原酸2.040 mg·mL-1對照品儲(chǔ)備液。精密吸取桃葉珊瑚苷1mL、京尼平苷2mL、松脂醇二

13、葡萄糖苷5mL、哈巴苷1mL、綠原酸1mL置10 mL量瓶中，用50甲醇定容，即得桃葉珊瑚苷0.2000 mg·mL-1、京尼平苷為0.1026 mg·mL-1、松脂醇二葡萄糖苷為0.5100 mg·mL-1、哈巴苷0.1990 mg·mL-1、綠原酸為0.2040 mg·mL-1的混合對照品溶液。2.3 供試品溶液制備 取杜仲藥材適量，剪成碎片，揉成絮狀，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，超聲提取30 min，過濾，用50%甲醇定容于25mL量瓶中，搖勻，過0.22 µm微孔濾膜，作為供試品溶液。2.4

14、 方法學(xué)考察2.4.1 精密度試驗(yàn)：取同一批次供試品（S3）溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定杜仲指紋圖譜，用“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.995，表明供試品進(jìn)樣精密度良好。2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批次供試品（S3）溶液，分別在1、2、4、8、16、24h進(jìn)樣6次，測定指紋圖譜，用“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.992，說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次樣品（S3）粉末6份，平行操作，制備供試品溶液，測定指紋圖譜，用“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件計(jì)算，結(jié)果相似度均大

15、于0.827，表明本法測定的重現(xiàn)性尚好。以上結(jié)果表明指紋圖譜中各色譜峰的相對遷移時(shí)間和峰面積基本一致，相似度較高，符合指紋圖譜研究的的技術(shù)要求。2.5 指紋圖譜的建立： 將供試品溶液分別放入自動(dòng)進(jìn)樣的樣品管中，按選定的測試條件進(jìn)行檢測。同一上述實(shí)驗(yàn)條件下，測定所有供試品HPCE色譜圖。根據(jù)不同批次供試品測定結(jié)果所給出的峰數(shù)、峰值（積分值）和峰位（相對遷移時(shí)間）等相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行分析、比較，制定優(yōu)化的指紋圖譜。（圖1，圖2）圖1 杜仲的HPCE-DAD指紋圖譜1. 桃葉珊瑚苷 2.京尼平苷 3.松脂醇二葡萄糖苷 5.哈巴苷 10.綠原酸圖2 杜仲的三維HPCE-DAD指紋圖譜2.6 指紋圖譜分析2

16、.6.1 共有指紋峰標(biāo)定： 經(jīng)對供試品HPCE色譜圖的分析、比較，杜仲標(biāo)定10個(gè)共有峰作為指紋圖譜的特征峰，1、2、3、5、10號(hào)峰與對照品對照分別鑒定為桃葉珊瑚苷、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、哈巴苷、綠原酸。以3號(hào)峰松脂醇二葡萄糖苷為參照峰，分別求出各共有峰與之相比的值（調(diào)整遷移時(shí)間之比）和各共有峰的相對峰面積（峰面積之比）。（表2）表2 杜仲HPCE-DAD指紋圖譜中共有峰的相對遷移時(shí)間值和相對峰面積峰號(hào)12345678910相對遷移時(shí)間0.88880.94861.00001.30581.53781.60641.68231.75781.80942.0777相對峰面積S10.04210.01

17、601.00000.28340.01450.01140.02280.43260.40730.0294S20.03690.01121.00000.27430.01100.00970.01740.43150.39210.0272S30.04660.01561.00000.31210.01580.01310.02650.46250.43760.0322S40.04720.02001.00000.33470.01530.01650.02790.53360.44280.0358S50.04900.02201.00000.36540.01990.02010.03110.57770.51290.0397S6

18、0.04670.02111.00000.29080.01660.01230.02440.45510.49550.0373S70.03970.01001.00000.26200.00920.00870.01550.41630.41210.0263S80.04710.01751.00000.31010.01100.01420.03070.49310.43140.0341S90.04760.01901.00000.29880.01240.01070.03310.45310.42660.0342S100.04010.01891.00000.26740.01040.01180.01860.41770.4

19、1870.03302.6.2 指紋圖譜的聚類分析：選擇杜仲HPCE指紋圖譜中10個(gè)比較明顯的共有峰，根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，用SPSS軟件中的hierarchical cluster analysis對10個(gè)杜仲樣品進(jìn)行聚類分析，所用聚類方法為average linkage (between groups)，距離公式為square euclidean distance，得不同樣品杜仲的聚類分析圖。（圖3，圖4）圖3 杜仲HPCE-DAD指紋圖譜的聚類分析圖結(jié)果顯示，當(dāng)距離標(biāo)尺在1時(shí)，樣品S1、S2、S7、S10，樣品S3、S9各歸為一類；在2時(shí)，樣品S3、S9與S8歸為一類；在6時(shí)，樣品S1、S2、

20、S7、S10、S3、S9、S8歸為一類；在9時(shí)，樣品S1、S2、S7、S10、S3、S9、S8、S6，樣品S4、S5各歸為一類；當(dāng)距離標(biāo)尺在25時(shí)，所有樣品才歸為一類。圖4 杜仲HPCE-DAD指紋圖譜中共有峰組分含量圖2.6.3 色譜峰的重疊率：以杜仲對照譜圖（R）為基準(zhǔn)，按以下公式計(jì)算待測樣品與對照譜圖共有的峰數(shù)×2/(待測樣品與對照譜圖峰數(shù)和)×100，110號(hào)樣品色譜峰的重疊率依次為：86.50%，87.45%，89.35%，89.75%，89.45%，89.75%，89.50%，89.25%，89.35%，88.50%。2.6.4 相似度評價(jià)：將測試數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥

21、典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件，經(jīng)校正選峰，設(shè)定匹配模式，將色譜峰自動(dòng)匹配，生成對照圖譜（圖5），進(jìn)行色譜峰差異性評價(jià)和整體相似性評價(jià)。各相似度值如下：S1-0.947，S2-0.951，S3-0.970，S4-0.975，S5-0.982，S6-0.981，S7-0.973，S8-0.974，S9-0.972，S10-0.956。結(jié)果表明，杜仲樣品指紋譜相似度較好（>0.94）。圖5 杜仲樣品HPCE指紋圖譜共有模式2.6.5 生品與其炮制品的指紋譜比較： 經(jīng)對杜仲生品（S3）與其炮制品（S11，S12）的指紋圖譜比較、分析，炒杜仲、鹽杜仲均具有杜仲生品的10

22、個(gè)共有峰，但色譜峰的重疊率、n強(qiáng)峰峰面積比值及色譜圖相似度具有一定差異。以杜仲生品譜圖為基準(zhǔn)，計(jì)算炮制品色譜峰的重疊率，炒杜仲為78.6%，鹽杜仲為79.4%；以桃葉珊瑚苷、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、哈巴苷及綠原酸為n強(qiáng)峰，其峰面積比值：生杜仲為0.047: 0.016 : 1 : 0.016: 0.032，炒杜仲為0.041: 0.020 : 1 : 0.010: 0.030，鹽杜仲為0.039: 0.024 : 1 : 0.007: 0.027；以杜仲生品譜圖為基準(zhǔn)，計(jì)算炮制品色譜圖的相似度，炒杜仲0.885，鹽杜仲0.871。(圖6) 圖6 杜仲炮制品HPLC圖譜A.炒杜仲 B.鹽杜仲

23、1.桃葉珊瑚苷 2.京尼平苷 3.松脂醇二葡萄糖苷 4.哈巴苷 5.綠原酸3 討論3.1 電泳條件的優(yōu)化：緩沖液體系、緩沖液濃度及pH值的選擇： 實(shí)驗(yàn)考察了硼砂、硼砂-磷酸二氫鈉和硼砂-磷酸二氫鈉-甲醇3個(gè)體系的緩沖溶液，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定以硼砂-磷酸二氫鈉-甲醇體系為緩沖體系，色譜峰峰形、分離度較好。在此基礎(chǔ)上，對緩沖液濃度及pH值進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，當(dāng)緩沖液濃度為60mmol·L 1硼砂-20 mmol·L 1 磷酸二氫鈉-10%甲醇時(shí)各色譜峰的分離度較好；當(dāng)pH為10.0時(shí)各組分可以達(dá)到基線分離。分離電壓和運(yùn)行溫度的選擇：考察了分離電壓在1625 kV范圍內(nèi)對各組分遷移

24、時(shí)間的影響，結(jié)果表明，當(dāng)分離電壓為20 kV時(shí)樣品及對照品各待測組分仍然可以達(dá)到基線分離且節(jié)省時(shí)間；考察了運(yùn)行溫度在2025 范圍內(nèi)對各組分遷移時(shí)間的影響，結(jié)果表明，當(dāng)運(yùn)行溫度為25 時(shí)樣品的各組分分離效果好，且分析時(shí)間縮短。檢測波長的選擇：采用二極管陣列檢測器對檢測波長進(jìn)行考察，記錄并比較不同波長的色譜圖。結(jié)果在210nm檢測波長下，色譜圖中色譜峰較多，信息豐富。3.2 指紋譜分析：指紋譜分析結(jié)果表明，不同批次杜仲樣品之間既有相關(guān)性，又有區(qū)別。相應(yīng)共有指紋峰均已在色譜圖上體現(xiàn)，色譜峰重疊率、指紋譜相似度較好，但各峰面積有所不同，說明不同來源、不同產(chǎn)地(批次)杜仲飲片其成分含量有一定差異。通過與對照品對照分析，桃葉珊瑚苷、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、哈巴苷及綠原酸可列為杜仲指紋譜共有特征峰中n強(qiáng)峰，其配比關(guān)系為（0.0370.049）:（0.0100.022）: 1 :（0.0090.020）:（0.0260.040），這對評價(jià)杜仲藥材質(zhì)量具有一定意義。杜仲生品與其炮制品的色譜圖比較