變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)

1、2021-11-191變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)基礎(chǔ)及實(shí)踐變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)基礎(chǔ)及實(shí)踐 2021-11-192 報(bào)告內(nèi)容報(bào)告內(nèi)容一、一、 變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的基本概念變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的基本概念二、二、 具有變態(tài)反應(yīng)原的物質(zhì)具有變態(tài)反應(yīng)原的物質(zhì)三、三、 抗體種類(lèi)及過(guò)敏型抗體種類(lèi)及過(guò)敏型四、四、 變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路五、五、 變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)際變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)際2021-11-193一、一、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的基本概念變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的基本概念1 1、機(jī)體的防御功能、機(jī)體的防御功能 機(jī)體具有防御功能的免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)對(duì)微生物、機(jī)體具有防御功能的免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)對(duì)微生物、化學(xué)物質(zhì)等外來(lái)異物通

2、過(guò)特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞化學(xué)物質(zhì)等外來(lái)異物通過(guò)特異性抗體或致敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行各種防御進(jìn)行各種防御作用作用，但有時(shí)這些防御過(guò)程對(duì)機(jī)體產(chǎn)生，但有時(shí)這些防御過(guò)程對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良的反應(yīng)。不良的反應(yīng)。2 2、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的目的變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的目的 變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)就是研究藥物對(duì)人體是否產(chǎn)生過(guò)變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)就是研究藥物對(duì)人體是否產(chǎn)生過(guò)敏性休克等變態(tài)反應(yīng)原的可能性。研究藥物變態(tài)反應(yīng)敏性休克等變態(tài)反應(yīng)原的可能性。研究藥物變態(tài)反應(yīng)原時(shí)，應(yīng)介紹原時(shí)，應(yīng)介紹致敏原性致敏原性和和攻擊原性攻擊原性兩個(gè)概念，致敏原兩個(gè)概念，致敏原性是指藥物或其分解物刺激機(jī)體的免疫功能而產(chǎn)生抗性是指藥物或其分解物刺激機(jī)體的免疫功能而

3、產(chǎn)生抗體的能力。攻擊原性是指在致敏成立的動(dòng)物再次注射體的能力。攻擊原性是指在致敏成立的動(dòng)物再次注射抗原時(shí)，產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)原性反應(yīng)的能力?？乖瓡r(shí)，產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)原性反應(yīng)的能力。 2021-11-194二、具有變態(tài)反應(yīng)原性的物質(zhì)二、具有變態(tài)反應(yīng)原性的物質(zhì)高分子物質(zhì)高分子物質(zhì): : 蛋白質(zhì)等多數(shù)具有變態(tài)反應(yīng)原性。把這蛋白質(zhì)等多數(shù)具有變態(tài)反應(yīng)原性。把這些物質(zhì)給予動(dòng)物后，可以產(chǎn)生抗體。這種狀態(tài)稱之為些物質(zhì)給予動(dòng)物后，可以產(chǎn)生抗體。這種狀態(tài)稱之為致敏狀態(tài)。一般情況下，蛋白質(zhì)、多聚糖、核酸等高致敏狀態(tài)。一般情況下，蛋白質(zhì)、多聚糖、核酸等高分子化合物具有變態(tài)反應(yīng)原性，當(dāng)機(jī)體識(shí)別這些高分分子化合物具有變態(tài)反應(yīng)原性，

4、當(dāng)機(jī)體識(shí)別這些高分子等異物時(shí)產(chǎn)生抗體。子等異物時(shí)產(chǎn)生抗體。低分子物質(zhì)：低分子物質(zhì)：化學(xué)物質(zhì)等低分子化合物一般不具有變化學(xué)物質(zhì)等低分子化合物一般不具有變態(tài)反應(yīng)原態(tài)反應(yīng)原性性，但當(dāng)這些物質(zhì)與機(jī)體內(nèi)高分子物質(zhì)，但當(dāng)這些物質(zhì)與機(jī)體內(nèi)高分子物質(zhì)( (血清血清白蛋白等蛋白質(zhì)白蛋白等蛋白質(zhì)) )結(jié)合時(shí)，可誘導(dǎo)低分子化合物產(chǎn)生自結(jié)合時(shí)，可誘導(dǎo)低分子化合物產(chǎn)生自身的抗體身的抗體 。具有這種性質(zhì)的低分子化合物稱之為。具有這種性質(zhì)的低分子化合物稱之為半抗半抗原原，青霉素就是一個(gè)典型的例子，在臨床上可以產(chǎn)生青霉素就是一個(gè)典型的例子，在臨床上可以產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏性休克。嚴(yán)重的過(guò)敏性休克。2021-11-195三、三、抗體

5、類(lèi)型及過(guò)敏反應(yīng)型抗體類(lèi)型及過(guò)敏反應(yīng)型抗體的類(lèi)型：抗體的類(lèi)型：IgEIgE 、IgMIgM、IgGIgG。IgEIgE抗體：抗體：產(chǎn)生過(guò)敏性休克稱為產(chǎn)生過(guò)敏性休克稱為型過(guò)敏反應(yīng)型過(guò)敏反應(yīng)IgGIgG及及IgMIgM抗體：抗體：可產(chǎn)生溶血性貧血稱為可產(chǎn)生溶血性貧血稱為型過(guò)型過(guò)敏反應(yīng)及血清病稱為敏反應(yīng)及血清病稱為型過(guò)敏反應(yīng)。型過(guò)敏反應(yīng)。變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)最基本的要求：變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)最基本的要求：當(dāng)藥物給予機(jī)當(dāng)藥物給予機(jī)體后是否產(chǎn)生抗體進(jìn)行研究。體后是否產(chǎn)生抗體進(jìn)行研究。2021-11-196四、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路四、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路（1）1、高分子化合物、高分子化合物 一般情況下，高分

6、子化合物既有致敏原性，又有攻擊一般情況下，高分子化合物既有致敏原性，又有攻擊原性。所以在考察受試物是否具有變態(tài)反應(yīng)原時(shí)，按照表原性。所以在考察受試物是否具有變態(tài)反應(yīng)原時(shí)，按照表1進(jìn)行試驗(yàn)就可以得到正確的評(píng)價(jià)。進(jìn)行試驗(yàn)就可以得到正確的評(píng)價(jià)。 表表1 傳統(tǒng)的變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)設(shè)計(jì)傳統(tǒng)的變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)設(shè)計(jì) 組別組別 致敏致敏 攻擊攻擊 受試物組受試物組 受試物受試物 受試物受試物 陰性對(duì)照組陰性對(duì)照組 溶媒溶媒 受試物受試物 陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組 陽(yáng)性對(duì)照物陽(yáng)性對(duì)照物 陽(yáng)性對(duì)照物陽(yáng)性對(duì)照物2021-11-197四、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路四、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路（2）2 2、低分子化合物、低

7、分子化合物 化學(xué)物質(zhì)等低分子化合物一般不具有變態(tài)反應(yīng)原化學(xué)物質(zhì)等低分子化合物一般不具有變態(tài)反應(yīng)原性性，但當(dāng)這，但當(dāng)這些物質(zhì)與機(jī)體內(nèi)高分子物質(zhì)些物質(zhì)與機(jī)體內(nèi)高分子物質(zhì)( (血清白蛋白等蛋白質(zhì)血清白蛋白等蛋白質(zhì)) )結(jié)合時(shí)，可誘結(jié)合時(shí)，可誘導(dǎo)低分子化合物產(chǎn)生自身的抗體導(dǎo)低分子化合物產(chǎn)生自身的抗體 。 表表2 2 低分子化合物低分子化合物變態(tài)反應(yīng)原性變態(tài)反應(yīng)原性的設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì) 組別組別 致敏致敏 攻擊攻擊 受試物組受試物組 受試物受試物 受試物受試物 受試物受試物- -蛋白結(jié)合物蛋白結(jié)合物 受試物受試物- -蛋白蛋白 受試物受試物- -蛋白蛋白 受試物受試物 結(jié)合物組結(jié)合物組 結(jié)合物結(jié)合物 受試物受試

8、物- -蛋白結(jié)合物蛋白結(jié)合物 陰性對(duì)照組陰性對(duì)照組 溶媒溶媒 受試物受試物 受試物受試物- -蛋白結(jié)合物蛋白結(jié)合物 陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組 陽(yáng)性對(duì)照組物陽(yáng)性對(duì)照組物 陽(yáng)性對(duì)照物陽(yáng)性對(duì)照物 2021-11-198四、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路四、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路（3） 分子量大小的界線：分子量大小的界線：一般以一般以20k為界線。為界線。全抗原及半抗原：全抗原及半抗原：高分子化合物一般稱全抗原，高分子化合物一般稱全抗原，低分子化合物一般稱半抗原。低分子化合物一般稱半抗原。載體蛋白載體蛋白(carrier protein) ：低分子化合物與牛血低分子化合物與牛血清白蛋白清白蛋白(BSA)的

9、結(jié)合物給予動(dòng)物后使致敏成立，的結(jié)合物給予動(dòng)物后使致敏成立，再給予抗原攻擊時(shí)，使攻擊成立，蛋白質(zhì)叫做再給予抗原攻擊時(shí)，使攻擊成立，蛋白質(zhì)叫做載體蛋白載體蛋白，復(fù)合物復(fù)合物(conjuste) ：受試物與蛋白質(zhì)的結(jié)合物叫做受試物與蛋白質(zhì)的結(jié)合物叫做復(fù)合物。復(fù)合物。2021-11-199四、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路四、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路（4） 表表3 生物技術(shù)藥物生物技術(shù)藥物變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì) 組別組別 致敏致敏 攻擊攻擊 受試物組受試物組 受試物受試物 受試物受試物 不純物不純物 陰性對(duì)照組陰性對(duì)照組 溶媒溶媒 受試物受試物 不純物不純物 不純物組不純物組 不純

10、物不純物 受試物受試物 不純物不純物2021-11-1910四、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路四、變態(tài)反應(yīng)原性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路（5）生物技術(shù)藥物生物技術(shù)藥物變態(tài)反應(yīng)原性的幾種情況變態(tài)反應(yīng)原性的幾種情況 1、人原性：氨基酸序列與人類(lèi)相同，并不純物可控。、人原性：氨基酸序列與人類(lèi)相同，并不純物可控。 一般不要求該試驗(yàn)。一般不要求該試驗(yàn)。 2、非人原性（改構(gòu)、融合蛋白等）要求該試驗(yàn)。、非人原性（改構(gòu)、融合蛋白等）要求該試驗(yàn)。 3、不純物：生物技術(shù)藥物在制造過(guò)程中易混入雜質(zhì)，疫苗、不純物：生物技術(shù)藥物在制造過(guò)程中易混入雜質(zhì)，疫苗多數(shù)是利用遺傳學(xué)基因重組方法，例如用酵母或大腸桿菌多數(shù)是利用遺傳學(xué)基因重組方法，

11、例如用酵母或大腸桿菌制造的生物技術(shù)藥物。在這些藥物的最終產(chǎn)品中可能混入制造的生物技術(shù)藥物。在這些藥物的最終產(chǎn)品中可能混入由酵母和大腸桿菌帶來(lái)的不純物質(zhì)，這些不純物多數(shù)含有由酵母和大腸桿菌帶來(lái)的不純物質(zhì)，這些不純物多數(shù)含有蛋白質(zhì)，是引起變態(tài)反應(yīng)原性反應(yīng)的重要原因。因此也要蛋白質(zhì)，是引起變態(tài)反應(yīng)原性反應(yīng)的重要原因。因此也要求該試驗(yàn)。求該試驗(yàn)。 2021-11-1911五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（1 1）1 、主動(dòng)性全身過(guò)敏反應(yīng)試驗(yàn)、主動(dòng)性全身過(guò)敏反應(yīng)試驗(yàn) (Active Systemic Anaphylaxis, 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱ASA) 常用豚鼠，檢測(cè)常用豚鼠，檢測(cè)IgE抗體?？贵w

12、。反應(yīng)原理反應(yīng)原理 1. 由抗原致敏產(chǎn)生由抗原致敏產(chǎn)生IgE抗體?？贵w。 2. IgE抗體與肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合?？贵w與肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合。 3. 細(xì)胞表面的細(xì)胞表面的IgE抗體與抗體與(攻擊攻擊)抗原的結(jié)合?？乖慕Y(jié)合。 4. 伴隨著脫顆粒的過(guò)程釋放化學(xué)介質(zhì)。伴隨著脫顆粒的過(guò)程釋放化學(xué)介質(zhì)。 5. 化學(xué)介質(zhì)引起的變態(tài)反應(yīng)原性反應(yīng)?；瘜W(xué)介質(zhì)引起的變態(tài)反應(yīng)原性反應(yīng)。2021-11-1912五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（2 2） ASA試驗(yàn)的基本設(shè)計(jì)試驗(yàn)的基本設(shè)計(jì) *靜注后觀察全身癥狀靜注后觀察全身癥狀 致敏致敏(sc or ip) 攻擊攻擊(iv) 2021-1

13、1-1913五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（3 3） ASA 陽(yáng)性反應(yīng)癥狀陽(yáng)性反應(yīng)癥狀- 無(wú)癥狀無(wú)癥狀無(wú)癥狀無(wú)癥狀+ 不安、哆嗦、搔鼻、打噴嚏、排尿、脫便不安、哆嗦、搔鼻、打噴嚏、排尿、脫便及及呼吸急促。呼吸急促。+ 除以上各癥狀外，還有呼吸困難和運(yùn)動(dòng)障礙。除以上各癥狀外，還有呼吸困難和運(yùn)動(dòng)障礙。+ 除以上各癥狀外，呼吸衰竭，直至痙攣，但可恢復(fù)。除以上各癥狀外，呼吸衰竭，直至痙攣，但可恢復(fù)。+ 死亡。死亡。ASA 陽(yáng)性反應(yīng)原因陽(yáng)性反應(yīng)原因 由于化學(xué)介質(zhì)的釋放，支氣管、腸、膀胱等處的平滑肌收縮導(dǎo)致由于化學(xué)介質(zhì)的釋放，支氣管、腸、膀胱等處的平滑肌收縮導(dǎo)致呼吸困難、非自主排尿、排糞

14、，并伴隨嚴(yán)重的肺氣腫等。呼吸困難、非自主排尿、排糞，并伴隨嚴(yán)重的肺氣腫等。注意：攻擊抗原經(jīng)皮下、腹腔等非靜脈給藥時(shí)，癥狀出現(xiàn)及死亡時(shí)間注意：攻擊抗原經(jīng)皮下、腹腔等非靜脈給藥時(shí)，癥狀出現(xiàn)及死亡時(shí)間明顯延長(zhǎng)，多數(shù)因臟器充血導(dǎo)致低血壓而死亡，給癥狀觀察帶來(lái)不明顯延長(zhǎng)，多數(shù)因臟器充血導(dǎo)致低血壓而死亡，給癥狀觀察帶來(lái)不便。便。 2021-11-1914五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（4 4）2、 被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng) ( Passive Cutaneous Anaphylaxis, 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱ASA) 常用豚鼠、小鼠、大常用豚鼠、小鼠、大 鼠，檢測(cè)鼠，檢測(cè)IgE、IgG抗體。

15、抗體。反應(yīng)原理反應(yīng)原理 該反應(yīng)是評(píng)價(jià)抗體滴度的一種方法。把致敏動(dòng)物（內(nèi)該反應(yīng)是評(píng)價(jià)抗體滴度的一種方法。把致敏動(dòng)物（內(nèi)含大量的含大量的 IgE、IgG抗體）抗體與局部皮膚肥大細(xì)胞的抗體）抗體與局部皮膚肥大細(xì)胞的Fc受體結(jié)合，使其被動(dòng)致敏。當(dāng)致敏抗原攻擊時(shí)，引受體結(jié)合，使其被動(dòng)致敏。當(dāng)致敏抗原攻擊時(shí)，引起局部肥大細(xì)胞釋放過(guò)敏介質(zhì)，使局部血管的通透性增起局部肥大細(xì)胞釋放過(guò)敏介質(zhì)，使局部血管的通透性增加，注入的染料在該皮膚處滲出著色。加，注入的染料在該皮膚處滲出著色。2021-11-1915五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（5 5）PCA試驗(yàn)的基本設(shè)計(jì)試驗(yàn)的基本設(shè)計(jì) 致敏時(shí)間致敏時(shí)間

16、* 觀察靜注后皮膚產(chǎn)生的蘭色斑觀察靜注后皮膚產(chǎn)生的蘭色斑致敏致敏(sc or ip) 采血采血(心臟心臟) 攻擊攻擊(iv+色素色素) 被動(dòng)致敏被動(dòng)致敏(皮內(nèi)皮內(nèi)) 2021-11-1916五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（6 6） 由于由于IgE 和和IgG抗體對(duì)動(dòng)物皮膚的親和性不同，抗體出現(xiàn)抗體對(duì)動(dòng)物皮膚的親和性不同，抗體出現(xiàn)的時(shí)間也不一致。下表所示致敏動(dòng)物、被動(dòng)致敏動(dòng)物及的時(shí)間也不一致。下表所示致敏動(dòng)物、被動(dòng)致敏動(dòng)物及被動(dòng)致敏后各種抗體的檢出情況。被動(dòng)致敏后各種抗體的檢出情況。 PCA反應(yīng)形式和被檢出抗體的種類(lèi)反應(yīng)形式和被檢出抗體的種類(lèi) 致敏動(dòng)物致敏動(dòng)物 被動(dòng)致敏動(dòng)物被動(dòng)

17、致敏動(dòng)物 致敏時(shí)間致敏時(shí)間* 被檢出的抗體被檢出的抗體 豚鼠豚鼠 豚鼠豚鼠 4hr IgG1 豚鼠豚鼠 豚鼠豚鼠 48hr-8 days IgE 小鼠小鼠 大鼠大鼠 24hr-48 hr IgE 小鼠小鼠 小鼠小鼠 1hr IgG1、2a、2b 小鼠小鼠 豚鼠豚鼠 3hr IgG2a *：皮下注射后到靜注抗原攻擊時(shí)間皮下注射后到靜注抗原攻擊時(shí)間2021-11-1917五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（7 7） PCA反應(yīng)觀察及評(píng)價(jià)：反應(yīng)觀察及評(píng)價(jià)： 攻擊抗原注射數(shù)分鐘后，皮膚表面就能看到攻擊抗原注射數(shù)分鐘后，皮膚表面就能看到漏出的蘭色斑點(diǎn)，漏出的蘭色斑點(diǎn)，30分鐘后，放血處死動(dòng)

18、物，將分鐘后，放血處死動(dòng)物，將背部的表皮剝離，從皮膚內(nèi)側(cè)測(cè)量色斑的長(zhǎng)經(jīng)和背部的表皮剝離，從皮膚內(nèi)側(cè)測(cè)量色斑的長(zhǎng)經(jīng)和短經(jīng)，平均值在短經(jīng)，平均值在5mm以上時(shí)判斷為陽(yáng)性反應(yīng)。評(píng)以上時(shí)判斷為陽(yáng)性反應(yīng)。評(píng)價(jià)有兩種方法，一種是呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋倍價(jià)有兩種方法，一種是呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)的抗體價(jià)為指標(biāo)。另一種是固定的血清稀釋倍數(shù)的抗體價(jià)為指標(biāo)。另一種是固定的血清稀釋倍數(shù)后以色斑的大小為指標(biāo)。需要了解正確的抗體數(shù)后以色斑的大小為指標(biāo)。需要了解正確的抗體價(jià)應(yīng)選擇前者。否則可以選擇后者。價(jià)應(yīng)選擇前者。否則可以選擇后者。2021-11-1918五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（8 8） 同種

19、同種PCA反應(yīng)反應(yīng)(homologous PCA)：豚鼠與豚鼠同種之間所豚鼠與豚鼠同種之間所進(jìn)行的進(jìn)行的PCA反應(yīng)稱反應(yīng)稱，如豚鼠，如豚鼠-豚鼠豚鼠4hr-PCA試驗(yàn)。試驗(yàn)。異種異種PCA反應(yīng)反應(yīng)(heterologous PCA)：小鼠和大鼠這樣異種間小鼠和大鼠這樣異種間所進(jìn)行的所進(jìn)行的PCA反應(yīng)叫稱反應(yīng)叫稱，如小鼠，如小鼠-大鼠大鼠24hr-PCA試試驗(yàn)。驗(yàn)。伊文思蘭染料伊文思蘭染料(Evans blue)：為使局部的免疫能夠定量化，為使局部的免疫能夠定量化，通常加入濃度為通常加入濃度為0.5-1%及容量與攻擊抗原相同的伊文思及容量與攻擊抗原相同的伊文思蘭染料蘭染料。攻擊途徑：攻擊途徑：P

20、CA、ASA反應(yīng)均要求攻擊抗原能迅速到達(dá)全反應(yīng)均要求攻擊抗原能迅速到達(dá)全身的各部位，必須是靜脈給藥。身的各部位，必須是靜脈給藥。PCA(福氏完全佐劑福氏完全佐劑)：為了加強(qiáng)抗原的致敏，通常選擇與為了加強(qiáng)抗原的致敏，通常選擇與抗原抗原一起給藥。一起給藥。2021-11-1919五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（9 9） ASA與與PCA兩實(shí)驗(yàn)結(jié)合設(shè)計(jì)法：兩實(shí)驗(yàn)結(jié)合設(shè)計(jì)法：致敏致敏(sc or ip) 攻擊攻擊(iv)完成完成ASA反應(yīng)反應(yīng) 采血采血（心臟）（心臟）進(jìn)行進(jìn)行PCA反應(yīng)反應(yīng) 2021-11-1920五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（1010） 3、抗體

21、滴度的測(cè)定、抗體滴度的測(cè)定 (Enzyme-linked immunosorbent assay) 抗體和抗原的定性和定量用高靈敏性的放射免疫測(cè)定抗體和抗原的定性和定量用高靈敏性的放射免疫測(cè)定法法(Radioimmunoassay RIA)。反應(yīng)原理反應(yīng)原理 將抗原吸附在固定相將抗原吸附在固定相(Microplate)上，被固定的抗原與上，被固定的抗原與特異性抗體結(jié)合，根據(jù)第二抗體酶水解底物的量進(jìn)行定特異性抗體結(jié)合，根據(jù)第二抗體酶水解底物的量進(jìn)行定性和定量方法。性和定量方法。2021-11-1921五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐五、變態(tài)反應(yīng)原試驗(yàn)的實(shí)踐（1111）方法簡(jiǎn)述：方法簡(jiǎn)述： 固定抗原固定抗

22、原測(cè)定材料的添加測(cè)定材料的添加洗洗 滌滌測(cè)定吸收度測(cè)定吸收度酶基質(zhì)的添加酶基質(zhì)的添加酶標(biāo)酶標(biāo)抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)洗洗 滌滌保保 護(hù)護(hù)2021-11-1922固定抗原固定抗原 ELISA法使用的平皿多數(shù)是用聚苯已烯或法使用的平皿多數(shù)是用聚苯已烯或氫氧化乙烯樹(shù)脂制成的，有市售品。對(duì)于蛋氫氧化乙烯樹(shù)脂制成的，有市售品。對(duì)于蛋白質(zhì)抗原來(lái)說(shuō)，用碳酸氫鈉緩沖液或者用磷白質(zhì)抗原來(lái)說(shuō)，用碳酸氫鈉緩沖液或者用磷酸生理鹽水緩沖液稀釋成酸生理鹽水緩沖液稀釋成5ug/ml左右時(shí)容易左右時(shí)容易被固定相吸附。被固定相吸附。 被固定處理的抗原液被固定處理的抗原液100ul加入平皿后加入平皿后4放置一夜或者室溫下放置放置一夜或者

23、室溫下放置3小時(shí)。小時(shí)。2021-11-1923保保 護(hù)護(hù) 平皿固定處理后，在平皿表面還有未被吸平皿固定處理后，在平皿表面還有未被吸附的抗原，這些抗原容易與無(wú)關(guān)的蛋白反應(yīng)附的抗原，這些抗原容易與無(wú)關(guān)的蛋白反應(yīng)產(chǎn)生非特異性抗體，因此，應(yīng)采取措施防止產(chǎn)生非特異性抗體，因此，應(yīng)采取措施防止非特異性抗體的吸附。具體用明膠或非特異性抗體的吸附。具體用明膠或Bovine serum albumin溶解在碳酸和磷酸生理鹽水使溶解在碳酸和磷酸生理鹽水使之配成之配成0.1-1% 的溶液，以的溶液，以1.5-2倍的量加入抗倍的量加入抗原液以后，在室溫下放置原液以后，在室溫下放置3小時(shí)以上起到保護(hù)小時(shí)以上起到保護(hù)作

24、用，保護(hù)結(jié)束后將洗凈干燥，在陰冷處保作用，保護(hù)結(jié)束后將洗凈干燥，在陰冷處保存數(shù)月或一年都可以使用。存數(shù)月或一年都可以使用。2021-11-1924添加被檢血清添加被檢血清(抗血清抗血清) 與固定后的抗原發(fā)生反應(yīng)可以獲得抗血清與固定后的抗原發(fā)生反應(yīng)可以獲得抗血清抗體，抗血清用抗體，抗血清用0.5%Tween20/PBS或者或者1%BSA/PBS稀釋以后，每平皿加入稀釋以后，每平皿加入100ul，室溫或者專(zhuān)門(mén)的恒溫箱室溫或者專(zhuān)門(mén)的恒溫箱(37)中，反應(yīng)中，反應(yīng)1小時(shí)小時(shí)以上。以上。2021-11-1925洗凈操作洗凈操作1 目的是洗掉與抗原抗體反應(yīng)無(wú)關(guān)的非特異目的是洗掉與抗原抗體反應(yīng)無(wú)關(guān)的非特異性

25、抗體，平皿中加入洗凈液后，吸收、去除性抗體，平皿中加入洗凈液后，吸收、去除的操作重復(fù)的操作重復(fù)3次。次。 2021-11-1926二次抗體反應(yīng)二次抗體反應(yīng)1 檢測(cè)抗體是否具有特異性，添加用酶標(biāo)記檢測(cè)抗體是否具有特異性，添加用酶標(biāo)記抗體，室溫下至少反應(yīng)抗體，室溫下至少反應(yīng)1小時(shí)可以得到結(jié)果。小時(shí)可以得到結(jié)果。酶標(biāo)記所用的酶一般采用酶標(biāo)記所用的酶一般采用Peroxidase(POX)、Alkaline phosphatase(ALP),從靈敏度來(lái)看，從靈敏度來(lái)看，ALP是是POX的的10-400倍，但價(jià)格很高。用酶倍，但價(jià)格很高。用酶標(biāo)記抗體的預(yù)備實(shí)驗(yàn)，非特異性的顯色很少，標(biāo)記抗體的預(yù)備實(shí)驗(yàn)，非特

26、異性的顯色很少，事先稀釋后，能夠檢測(cè)出非特異性抗體，市事先稀釋后，能夠檢測(cè)出非特異性抗體，市場(chǎng)上出售的標(biāo)記抗體種類(lèi)很多，靈活地對(duì)它場(chǎng)上出售的標(biāo)記抗體種類(lèi)很多，靈活地對(duì)它們進(jìn)行運(yùn)用，將會(huì)對(duì)工作帶來(lái)方便。們進(jìn)行運(yùn)用，將會(huì)對(duì)工作帶來(lái)方便。2021-11-1927 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) 二次抗體反應(yīng)結(jié)束以后，用二次抗體反應(yīng)結(jié)束以后，用PBS-Tween清洗清洗3次，加入作用于酶次，加入作用于酶(標(biāo)記時(shí)用標(biāo)記時(shí)用)的顯色物質(zhì)的顯色物質(zhì)100ul，在室溫下反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)15分鐘以后，加入反應(yīng)分鐘以后，加入反應(yīng)停止液停止液(1-2NH2SO4)100ul。 2021-11-1928吸光度的測(cè)定吸光度的測(cè)定1

27、 1 各受試樣品的吸光度用專(zhuān)門(mén)的測(cè)定裝置各受試樣品的吸光度用專(zhuān)門(mén)的測(cè)定裝置(ELISA reader, Microplate reader)來(lái)測(cè)定，來(lái)測(cè)定，使用上述基質(zhì)，再用硫酸停止反應(yīng)的測(cè)定使用上述基質(zhì)，再用硫酸停止反應(yīng)的測(cè)定波長(zhǎng)是波長(zhǎng)是490nm.2021-11-1929免疫毒理非臨床安全性評(píng)價(jià)現(xiàn)狀（1）1）免疫毒理從不良反應(yīng)表現(xiàn)形式角度分包括免疫抑制、自身免疫、抗原性、過(guò)敏反應(yīng)、免疫刺激。2）為什么要注意該問(wèn)題，免疫毒性是藥品安全性的重要問(wèn)題，（1）免疫抑制對(duì)已有免疫功能損害、患慢性病可能出現(xiàn)免疫功能低下、營(yíng)養(yǎng)不良的病人及免疫功能尚未成熟的兒童的影響都是值得高度重視的（2）藥物所致過(guò)敏反應(yīng)和自身免疫疾病已上市藥物從市場(chǎng)撤出的主要原因。（3）藥物（分子量10000KD的蛋白類(lèi)、肽、聚合物和分子量的低分子化合物如青霉素和磺胺的代謝產(chǎn)物或作為半抗原）的抗原性直接影響藥物的生物活性（抗體中和作用影響藥效、毒性、代謝），尤其是較長(zhǎng)時(shí)間給藥時(shí)；也可產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。（4）近年來(lái)免疫免疫調(diào)節(jié)劑的大劑量和過(guò)長(zhǎng)時(shí)間使用已表現(xiàn)出對(duì)免疫功能的損害，而免疫刺激劑二性霉素B表現(xiàn)出刺激巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子的作用，硫代磷酸寡脫氧核苷酸刺激IgG和Ig