反義RNA的原理及其應(yīng)用.ppt(精)

1、反義RNA-反義RNAA( a n t i s e n sle RNA):一 種本身缺乏編碼能力， 但能與特異靶RN A(主要是mR N A)互補的R NA分子，它 可通過配對堿基間氫鍵作用與靶R NA的特 定互補區(qū)域結(jié)合形成雙鏈復(fù)合物，抑制靶RNA的功能，從而調(diào)控基因的正常表達?；驹?反文|RNA技術(shù)的基本原理：利用自然存在 的或人工合成的反義RNA,通過基因重組 技術(shù)反向插入到合適的表達載體形成重組-DN A,然后轉(zhuǎn)染受體細胞，則這一反插二 入的序列就會隨細胞周期產(chǎn)生大量反義R NA,對基因的表達進行調(diào)控， 從而抑制、封閉或破壞靶基因的表達。一、復(fù)制水平 DNA復(fù)制中的作甩一： 一一

2、反義RNA作為D|NA復(fù)制的抑制因子，與引物RN A結(jié)合或作用于引物前體而抑制DNA復(fù)制，從 而降低D N A的復(fù)制效率。Ecoli的c o I e匸 質(zhì)粒復(fù)制的前提是合成適當?shù)腞 NA(RNAH),它自動折疊后與DNA模板結(jié)合形成D NA復(fù)制 的引物，從復(fù)制起始點上游一4基本原理-4 5 b p處開始， 以另一D N A為模板反向轉(zhuǎn)錄的RN AI正好與RNA1 I的結(jié)合， 阻止了正常引物的產(chǎn)生， 從而 干擾復(fù)制的進行。作用機制反義R N A的作用機制主要表現(xiàn)在D N A復(fù) 制、轉(zhuǎn)錄和翻譯3個水平上。二、轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的作用反義R NA與mlRNA 5末端互補結(jié)合，阻斷帽 子結(jié)構(gòu)形成

3、；作用于外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū)， 二阻礙前mRNA剪接；作用于polyA形成位點， 阻礙m RN A的成熟及其向胞漿轉(zhuǎn)運。在crp基 因的ticRNA (transcription i n h i bi t o r y c omp I e me n t a r y RNA)負向自我調(diào)控 中，ticRNA與erp mRNA的5端結(jié)合， 形成類似于R NA聚合酶識別的轉(zhuǎn)錄終止信號的 二級結(jié)構(gòu)，以反式作用對轉(zhuǎn)錄過程本身進行調(diào)控J三、翻譯水平翻譯水平的作用二三三三三二二二 三反義R NA可直接與m R N A的S D序列（含R BS）或 編碼區(qū)（主要是AUG）結(jié)合，從空間上直接阻止核糖 體的正帯結(jié)合或

4、可直接降解靶mR N A.反義R N A與mRNA在SD序列配對形成吻觸復(fù)合體或在互補區(qū)段 結(jié)合形成R NAR N A雙鏈結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控翻譯的進 行。在真核生物細胞中有許多RNA在翻譯水平上表現(xiàn) 反義R N A的功能。如雞胚胎肌漿中存在的富含U的小 分子RNA稱為tcRNA,它們可以與肌球蛋白重鏈的RN A的p o ly A尾雜交而抑制正常的翻洋過程。Audr e y等J齣研兗表明F GFAS R NA在翻譯遣程能有 效地抑制FGF-2在哺乳動物細胞中的表達。反義RNA的重組DNA中只有啟動子及終止子，當轉(zhuǎn)染細胞后，重組DNA能自動表達反義RNA,并且重組DNA自身可以整 合到宿主的基因組D

5、NA中，或作為“附 加體”長期存在。在原核細胞中，反義R NA以針對SD序列效果最好，而在真核細胞中以5端非編碼區(qū)為標靶最有效。反義RNA的應(yīng)用隨著基因組草圖的完成，人們研究的重點己 -轉(zhuǎn)向?qū)蚬δ艿难芯浚戳x核酸技術(shù)無疑 為這項宏偉的工程提供了一種有力的工具。抗病毒作用病毒是對人和動植物危害極大的病原體，然而對 病毒引起的疾病的治療， 冃前尚無特效藥物與方法C反義RNA卻能特異性阻斷病毒基因表達和抑制病 毒的復(fù)制出而激起許多科學(xué)工作者去探索反義R二-NA治療病毒性疾病的有效方法?？共《痉戳xR N-A技術(shù)足將特定的病毒基因反向插人到表達險載體 中，以構(gòu)建反義RNA表達載體，再將重組體導(dǎo)人真

6、核細胞（病毒宿主細哩中表達特異性反義RNA,從-而抑制禱異有害基附的表達或抑制病毒復(fù)制。文 獻報道，運用反義R N A技術(shù)己經(jīng)成功地抑制疤病 毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒（H I V丄等對培 養(yǎng)的組織細胞的侵襲。用針對植物病毒的皮義R N A己培育出具有抗病毒能力的植物。姚志強等針對不同靶位設(shè)計了1 0段互補反義核 酸 （D NA片段）,經(jīng)模型篩選發(fā)現(xiàn)針對S基因起始 區(qū)、SP2增施子帽區(qū)和polyA信號編碼區(qū)的a sONs作用最強尋揭示反調(diào)帝基因轉(zhuǎn)錄/翻譯起 始區(qū)的反義核酸具有明顯的抗病毒作用。Gaborz?（ 1 998）使用內(nèi)源性衣達抗HI V - 1po1vif和enr基氏I,以及3

7、LTR序歹ij的反義RNA方案，構(gòu)建了MuVLTR啟動子逆轉(zhuǎn)錄 病毒重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)錄CD4淋巴細胞系，結(jié)果 表明反義R NA能高效地穩(wěn)定表達，反義e n v R NA能攣有效地抑制HI V-1的復(fù)制，并且反 義p oI R NA使P 2 4抗原減少了1 0 01 00 0禧。另外，國內(nèi)外在應(yīng)用反義R N A技術(shù)堵育抗病（如 豬瘟、抗雞馬立克氏病等） 動物品系方面也取得比 較明顯的進展。反義RNA的抗腫瘤作用腫瘤的發(fā)生是多因素引起的，其中細胞癌基因或/ 和某些病壽瘙基因的異常激活和過度表達是導(dǎo)致 細胞惡變的原因之一。如何控制細胞有害基因的 表達而在基因水平上治療惡性川痢呢？在目前基 因治療的眾多方

8、案屮，反義R NA技術(shù)是最具吸引 力的手段之一。可以設(shè)計出針對腫瘤細胞的癌基 因、突變皐因I非正常衣達呈閃及某些腫瘤相關(guān) 病毒的癌基因反義RNA,以阻斷這些有害基因的 表瓊逖到締腫瘤的目的。許多證據(jù)裁，反義R N A可使腫瘤細胞的表型逆轉(zhuǎn)，形態(tài)變化？增殖速 度減慢，生存期縮短，軟瓊脂中克隆能力下陳及體內(nèi) 成瘤能力減弱等，而不影響細胞生存所必需的其它 基因的表達。 Tr o j a n等利用E B病毒游離體表達載體克隆胰 島素樣仆.氐因子(IGF)反義基因，將此重組體 轉(zhuǎn)染大鼠C 6細胞系，在大鼠模型上實現(xiàn)了膠質(zhì) 母細胞瘤的基因治療和預(yù)防。我國學(xué)者趙曉航等報道互補于Grnyc基因第二 -外顯了及

9、其兩側(cè)序列的反義RNA能特異性誘發(fā) 人食管癌細胞程序性死亡。黃賢明等利用G e t s2、G m y c和Nr as三個癌基因聯(lián)合反義RNA能使人肝癌細胞株S M M C 77 2 1生長速率下降約70 %,軟瓊脂集 落形成能力及裸鼠致瘤能力顯著下降，提示針對多 個癌基因的聯(lián)合反義R NA可能給腫瘤基因治療 提供新的途徑。反義RNA技術(shù)還可用于腸道疾病(Rotba rteta 1，1 988)、心血管疾病、B一地中海貧血、調(diào)節(jié)衰弱心臟中肌細胞的-Ca2泵體內(nèi)平衡u、G蛋白防止高血壓、- 肝纖維化等多種疾病的研究。參君文獻 1張西鋒，沈偉,潘慶杰，白丁平，耿社 快.反義RNA技術(shù)原理及其在疾病治療中的應(yīng) 用J 萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2 00 4,2 1 ( 1 )：2 0 ,21,2 22&