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1、利用小孢子培養(yǎng)為技術(shù)核心的十字花科蔬菜優(yōu)異材料創(chuàng)新 1項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)1.1 項(xiàng)目的意義眾所周知:北方的大白菜、南方的青菜、全國(guó)的甘藍(lán)和蘿卜、出口的青花菜、我省的花椰菜、榨菜、雪菜等十字花科蔬菜,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中、在種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中、在人們?nèi)粘I钪?、在增加農(nóng)民收入中有著舉足輕重的地位;尤其在世界經(jīng)濟(jì)一體化趨勢(shì)的今天,這些十字花科蔬菜更凸現(xiàn)了我國(guó)之可貴的傳統(tǒng)特色。在我國(guó)社會(huì)快速發(fā)展的今天,行業(yè)人士無(wú)不深感:進(jìn)入新世紀(jì),我國(guó)蔬菜新品種數(shù)量雖呈對(duì)數(shù)式增加,而具市場(chǎng)潛力和應(yīng)用前景的突破性品種卻鳳毛麟角,目前主要蔬菜商業(yè)品種的遺傳相似性越來(lái)越高,在兵臨城下的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)面前我國(guó)蔬菜種業(yè)呈嚴(yán)峻形勢(shì),這給我國(guó)蔬菜育

2、種提出了“快速、突破、創(chuàng)新”之要求,而實(shí)現(xiàn)新品種突破的關(guān)鍵在于優(yōu)異材料的創(chuàng)新。近年來(lái)快速發(fā)展起來(lái)的十字花科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)的結(jié)合是優(yōu)異材料快速創(chuàng)新的有途徑之一,它只需12年即可純化遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的特異種質(zhì)資源、純化國(guó)內(nèi)外引進(jìn)的優(yōu)良育種材料、純化優(yōu)良性狀聚合后的種質(zhì),而有效獲得大量不同性狀的DH純系,通過(guò)鑒定與篩選進(jìn)而得到優(yōu)異的材料,用于培育新品種,對(duì)由多基因控制的特異性狀的篩選也能實(shí)現(xiàn)一步到位。迄今,本課題組擁有大白菜、青菜、甘藍(lán)、青花菜、花椰菜、榨菜、雪菜等十字花科蔬菜種質(zhì)1500余份;在其遠(yuǎn)緣雜交、國(guó)內(nèi)外優(yōu)良品種的分離、多個(gè)優(yōu)良性狀的聚合等方面做了大量的工作;在其游離小孢

3、子培養(yǎng)方面投入了大量精力,其技術(shù)基本成熟,現(xiàn)已成功培育出一些大白菜、甘藍(lán)、青花菜、花椰菜的DH系,其中部分優(yōu)異的DH系已應(yīng)用于新品種的選育之中。該項(xiàng)目的實(shí)施將為我省十字花科蔬菜種質(zhì)資源的挖掘、育種技術(shù)的提升和材料創(chuàng)新等方面做出有益的探索;將為十字花科蔬菜新品種的選育打下良好的基礎(chǔ);將為我國(guó)十字花科蔬菜優(yōu)異材料的創(chuàng)新和新品種的選育走上“突破”“創(chuàng)新”“快速”發(fā)展軌道做出大的貢獻(xiàn);對(duì)填補(bǔ)我國(guó)十字花科蔬菜優(yōu)異材料短缺、提升我省蔬菜育種技術(shù)水平、提高我省蔬菜育種地位、拉動(dòng)我省種籽行業(yè)的知名度和競(jìng)爭(zhēng)力、促進(jìn)我省蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、增加農(nóng)民收入、推動(dòng)我省農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展以及我省自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)走出國(guó)門等方面都具重要

4、意義。1.2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展研究現(xiàn)狀優(yōu)異材料是構(gòu)成優(yōu)異品種的基礎(chǔ),優(yōu)異材料的創(chuàng)新一直被國(guó)內(nèi)外育種工作者高度重視。1982年,Lichter首次報(bào)道甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)形成植株。隨后,這一技術(shù)不斷加以改進(jìn)。加拿大、英國(guó)、德國(guó)、日本均有報(bào)道,其中以加拿大所做工作最多,成果最為突出。到目前為止,我國(guó)已經(jīng)利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)得到了大量的油菜小孢子植株,在大白菜中利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得了大批純合自交不親和系。此外,游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在小白菜、甘藍(lán)、花椰菜、紅菜薹、青花菜等十字花科蔬菜方面也有報(bào)道。(1)利用小孢子培養(yǎng)育成的十字花科蔬菜新材料及新品種目前,游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)正在十字花科作物育種中發(fā)揮著重大作

5、用。1998年河南農(nóng)科院已經(jīng)利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)先后育成豫白菜7號(hào)、豫園50等多個(gè)大白菜新品種。1998年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳玉萍等借鑒大白菜小孢子的培養(yǎng)獲得單倍體、再經(jīng)加倍獲得二倍體純系的方法,進(jìn)行了包心芥菜品種游離小孢子技術(shù)的研究。1999年北京市蔬菜研究中心利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)育成了優(yōu)質(zhì)大白菜新品種桔紅心1號(hào),而且還利用大白菜的小孢子胚狀體獲得了抗除草劑轉(zhuǎn)基因植株。2005年北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心利用游離小孢子培養(yǎng)結(jié)合苗期人工接種抗病性鑒定技術(shù)育成中熟青麻葉類型京翠70號(hào)大白菜一代雜種。天津的科研單位也正在利用小孢子技術(shù)進(jìn)行自交系的純化工作。(2) 利用遠(yuǎn)緣雜交、小孢子培養(yǎng)進(jìn)行十字花科蔬

6、菜新種質(zhì)創(chuàng)新2006年福州市蔬菜研究所陳文輝等進(jìn)行了甘藍(lán)和青花菜雜種小孢子培養(yǎng)研究。(3)利用小孢子培養(yǎng)篩選十字花科蔬菜各種抗性的突變體利用培養(yǎng)物的突變能夠產(chǎn)生抗病、抗鹽、抗除草劑的高產(chǎn)植株。Ahmad L等用UV紫外線處理大白菜分離小孢子獲得抗根腐病突變體。2005年北京市農(nóng)林科學(xué)院曹鳴慶等曾將大白菜黑斑病毒素加入培養(yǎng)基,結(jié)果從誘導(dǎo)得到的小孢子胚中篩選出了對(duì)黑斑病表現(xiàn)一定程度抗性的大白菜小孢子植株。發(fā)展趨勢(shì)雖然小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種工作和基礎(chǔ)研究中有了很多應(yīng)用,對(duì)作物改良和種質(zhì)創(chuàng)新具有十分重要的地位和意義,并隨著小孢子培養(yǎng)技術(shù)及其各種育種方法的日益成熟,越來(lái)越被眾多跨國(guó)種子公司和育種工作者作為

7、實(shí)用生物技術(shù)所接納并采用。但是,小孢子培養(yǎng)技術(shù)有一些機(jī)制還不清楚。誘導(dǎo)頻率不高、物種及基因型間存在差異,是目前實(shí)際應(yīng)用中的一大障礙。小孢子培養(yǎng)的啟動(dòng)僅是在猜測(cè)、探討中。今后發(fā)展的趨勢(shì):在逐漸實(shí)現(xiàn)小孢子培養(yǎng)技術(shù)實(shí)用化的過(guò)程中,深入研究小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制、激發(fā)機(jī)制、自然加倍機(jī)制以及與之相對(duì)應(yīng)的生理生化、遺傳因素;將小孢子培養(yǎng)技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合。1.3主要參考文獻(xiàn)許勇,丁海鳳. 蔬菜優(yōu)異種質(zhì)挖掘與創(chuàng)新是推動(dòng)我國(guó)蔬菜種業(yè)進(jìn)步的有效途徑. 中國(guó)蔬菜,2005(7):18-21葛亞明, 陳利萍. 植物細(xì)胞工程在十字花科作物種質(zhì)創(chuàng)新中的研究進(jìn)展. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2004,

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15、hang FL & Takahata Y. Microspore mutagenesis and in vitro selection for resistance to soft rot disease in Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis). Breeding Science, 1999, 49: 161-166.2 項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題。2.1研究?jī)?nèi)容在本課題組現(xiàn)有的較為成熟的十字花科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上,有計(jì)劃、有目標(biāo)地較大規(guī)模地開(kāi)展其游離小孢子培養(yǎng),以快速育成多

16、個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和育其種應(yīng)用前景的十字花科蔬菜優(yōu)異育種材料,實(shí)現(xiàn)生物技術(shù)的實(shí)用化是本項(xiàng)目研究的主要目標(biāo);圍繞其目標(biāo),擬進(jìn)行以下主要研究?jī)?nèi)容:(1)聚合雜交、構(gòu)建核心種質(zhì)根據(jù)青菜(小白菜)、大白菜、包心菜(結(jié)球甘藍(lán))、青花菜、花椰菜、榨菜、雪菜等不同十字花科蔬菜目前和長(zhǎng)遠(yuǎn)的育種目標(biāo)所需,結(jié)合多年積累的育種經(jīng)驗(yàn),在抗病性、抗逆性、品質(zhì)、商品性、耐寒性、耐熱性、耐抽薹性、適應(yīng)性等方面進(jìn)行有目標(biāo)的聚合雜交,構(gòu)建核心種質(zhì),以此預(yù)期培養(yǎng)出符合其不同育種需求的優(yōu)異育種材料。(2)規(guī)?;坞x小孢子培養(yǎng)利用本課題組現(xiàn)有的較為成熟的青菜(小白菜)、大白菜、包心菜(結(jié)球甘藍(lán))、青花菜、花椰菜、榨菜、雪菜等不同十字

17、花科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系,有規(guī)模地進(jìn)行其游離小孢子培養(yǎng),預(yù)期培養(yǎng)出大量的DH植株。(3)大量DH植株的系統(tǒng)鑒定對(duì)培養(yǎng)出的大量DH植株,根據(jù)其不同的育種要求,進(jìn)行其特征特性的系統(tǒng)鑒定,特別是抗病性(多抗)、抗逆性、品質(zhì)、商品性、耐寒性、耐熱性、耐抽薹性、適應(yīng)性等特異性鑒定。(4)優(yōu)異材料的評(píng)估與篩選在大量DH材料系統(tǒng)鑒定的基礎(chǔ)上,根據(jù)不同的育種目標(biāo),結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際與多年的育種經(jīng)驗(yàn)(包括配合力測(cè)定),對(duì)其進(jìn)行評(píng)估與篩選,以獲得優(yōu)異材料。(5)培養(yǎng)技術(shù)體系的改良與完善結(jié)合項(xiàng)目實(shí)施,對(duì)上述不同蔬菜的培養(yǎng)技術(shù)體系進(jìn)行改良與完善,特別是榨菜、雪菜及包心菜培養(yǎng)技術(shù)體系進(jìn)行的改良與完善性研究,以提高其培養(yǎng)

18、效率。2.2研究目標(biāo)升華傳統(tǒng)的十字花科蔬菜育種技術(shù);實(shí)現(xiàn)生物技術(shù)的實(shí)用化;在較短的時(shí)間內(nèi),利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)育成具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和應(yīng)用前景的十字花科蔬菜優(yōu)異育種材料。2、具體指標(biāo)(1)育成優(yōu)異的十字花科蔬菜育種材料共計(jì)30份。其中:青菜(小白菜)4份、大白菜9份、包心菜(結(jié)球甘藍(lán))4份、青花菜3份、花椰菜6份、榨菜2份、雪菜2份。這些材料要求:是DH系,育性正常,在抗病性、抗逆性、商品性、品質(zhì)、耐寒性、耐熱性、耐抽薹性、適應(yīng)性等方面優(yōu)異性突出,在育種(或生產(chǎn)上)可迅速利用。(2)形成較為完善的青菜(小白菜)、大白菜、包心菜(結(jié)球甘藍(lán))、青花菜、花椰菜、榨菜、雪菜等7種十字花科蔬菜游離小孢子

19、培養(yǎng)技術(shù)的實(shí)用化體系。(3)發(fā)表游離小孢子培養(yǎng)及其材料創(chuàng)新的相關(guān)論文3篇。3、應(yīng)用或產(chǎn)業(yè)化前景開(kāi)展“以游離小孢子培養(yǎng)為技術(shù)核心的十字花科蔬菜優(yōu)異材料創(chuàng)新”項(xiàng)目研究,對(duì)于開(kāi)發(fā)利用符合我省消費(fèi)習(xí)慣的優(yōu)良的地方品種,對(duì)于研發(fā)十字花科蔬菜特、異、優(yōu)、新的種質(zhì)資源,對(duì)于篩選各種抗性突變體育種材料,對(duì)于育成符合市場(chǎng)需求的十字花科蔬菜突破性優(yōu)良新品種,對(duì)于促進(jìn)我省蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展等方面具有廣闊的應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化前景。2.3擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題(1)聚合雜交、構(gòu)建核心種質(zhì)結(jié)合多年積累的育種經(jīng)驗(yàn),在抗病性、抗逆性、品質(zhì)、商品性、耐寒性、耐熱性、耐抽薹性、適應(yīng)性等方面進(jìn)行有目標(biāo)的聚合雜交,構(gòu)建核心種質(zhì),以此預(yù)期培養(yǎng)出符合其不

20、同育種需求的優(yōu)異育種材料。(2)規(guī)模化游離小孢子培養(yǎng)利用本課題組現(xiàn)有的較為成熟不同十字花科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系,有規(guī)模地進(jìn)行其游離小孢子培養(yǎng),預(yù)期培養(yǎng)出大量的DH植株。(3)大量DH植株的系統(tǒng)鑒定對(duì)培養(yǎng)出的大量DH植株進(jìn)行其特征特性的系統(tǒng)鑒定。(4)優(yōu)異材料的評(píng)估與篩選在大量DH材料系統(tǒng)鑒定的基礎(chǔ)上,根據(jù)不同的育種目標(biāo),結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際與多年的育種經(jīng)驗(yàn)(包括配合力測(cè)定),對(duì)其進(jìn)行評(píng)估與篩選,以獲得優(yōu)異材料。(5)培養(yǎng)技術(shù)體系的改良與完善結(jié)合項(xiàng)目實(shí)施,對(duì)上述不同蔬菜的培養(yǎng)技術(shù)體系進(jìn)行改良與完善,特別是榨菜、雪菜及包心菜培養(yǎng)技術(shù)體系進(jìn)行的改良與完善性研究,以提高其培養(yǎng)效率。3擬采取的研究方案及可

21、行性分析。本項(xiàng)目以目標(biāo)種質(zhì)的廣泛搜集與優(yōu)良性狀的聚合為起點(diǎn),以游離小孢子培養(yǎng)為材料純化的主要手段,在實(shí)現(xiàn)大量DH植株的基礎(chǔ)上,結(jié)合常規(guī)選育與鑒定方法,實(shí)現(xiàn)耐抽薹、耐熱、抗病、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)異目標(biāo)材料的創(chuàng)新;具體實(shí)施將本著充分利用現(xiàn)有資源、充分利用現(xiàn)有技術(shù)積累、創(chuàng)新與傳統(tǒng)相結(jié)合、研究與應(yīng)用相結(jié)合、生物技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)相結(jié)合的原則;采取內(nèi)容、時(shí)間、空間互動(dòng)的研究策略,確保在較短時(shí)間內(nèi),完成關(guān)鍵技術(shù)研究、優(yōu)異材料創(chuàng)新等項(xiàng)目任務(wù)。技術(shù)路線圖挖掘各類原始種質(zhì)的聚合雜交、構(gòu)建各類核心種質(zhì)性狀鑒定UV誘變技術(shù)規(guī)?;坞x小孢子培養(yǎng)單核靠邊期花蕾分離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的改良與完善高溫處理NLN液培(25)再生植株的春化與越

22、夏技術(shù)的改良與完善 DH純系綜合評(píng)估技術(shù)的改良與完善優(yōu)異突變體的篩選技術(shù)的改良與完善固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綜合性狀鑒定技術(shù)的改良與完善加倍 DH植株綜合性狀的系統(tǒng)鑒定DH純系的綜合評(píng)估與篩選各種創(chuàng)新性優(yōu)異育種材料七種蔬菜的游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系4本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處4.1項(xiàng)目特色(1)游離小孢子培養(yǎng)高成胚率技術(shù);(2)小孢子抗病、耐鹽堿突變體的篩選技術(shù);(3)游離小孢子再生植株的春化、越夏及正常結(jié)籽技術(shù);(4)品質(zhì)、抗熱性等綜合性狀的鑒定技術(shù)。4.2項(xiàng)目創(chuàng)新之處本項(xiàng)目以目標(biāo)種質(zhì)的廣泛搜集與優(yōu)良性狀的聚合為起點(diǎn),以游離小孢子培養(yǎng)為材料純化的主要手段,在實(shí)現(xiàn)大量DH植株的基礎(chǔ)上,結(jié)合常規(guī)選育與鑒定方法,

23、實(shí)現(xiàn)耐抽薹、耐熱、抗病、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)異目標(biāo)材料的創(chuàng)新。從種質(zhì)的收集到鑒定、從目標(biāo)性狀的聚合到小孢子DH系培養(yǎng)、從DH植株的鑒定到優(yōu)異性綜合評(píng)估均由項(xiàng)目組科技人員自主完成,項(xiàng)目科研屬原始創(chuàng)新。5年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果項(xiàng)目計(jì)劃2010年1月至2012年12月實(shí)施,其年度計(jì)劃是:起始年月進(jìn) 度 目 標(biāo)2010-01-01至2010-12-311、項(xiàng)目組織實(shí)施、工作準(zhǔn)備。(細(xì)化方案、挖掘種質(zhì)、改善設(shè)備等)2、聚合雜交、構(gòu)建各類核心培養(yǎng)材料。(鑒定、雜交、培植等)3、游離小孢子培養(yǎng)及誘變。(培養(yǎng)、UV誘變、技術(shù)改良與完善等)2011-01-01至2011-12-311、游離小孢子培養(yǎng)。(培養(yǎng)、技術(shù)改良與

24、完善等)2、DH材料的鑒定。(特征特性鑒定、育性鑒定等)3、優(yōu)異育種材料的篩選。(重要優(yōu)異材料的篩選及繁殖)2012-01-01至2012-12-311、技術(shù)關(guān)鍵的攻關(guān),完善培養(yǎng)技術(shù)體系。(重點(diǎn)是榨菜、雪菜)2、項(xiàng)目總結(jié)、驗(yàn)收。6研究基礎(chǔ)與工作條件1、項(xiàng)目申請(qǐng)單位多年一直開(kāi)展十字花科蔬菜新品種的選育工作,曾承擔(dān)過(guò)浙江省“八五”、“九五”、“十五”大白菜、小白菜、青菜、蘿卜等新品種的選育與推廣項(xiàng)目。先后選育成一批在生產(chǎn)上有重要栽培價(jià)值的十字花科蔬菜新品種,創(chuàng)造了明顯的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益,曾獲浙江省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)和國(guó)家科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)。目前正以抗病、豐產(chǎn)為基礎(chǔ),開(kāi)展優(yōu)質(zhì)型、生態(tài)型、加工型、出口型為目標(biāo)的新

25、品種選育工作。2、項(xiàng)目申請(qǐng)課題組現(xiàn)擁有十字花科蔬菜種質(zhì)資源1500余份,其中:大白菜800余份、青菜200余份、甘藍(lán)100余份、青花菜100余份、花椰菜200余份、榨菜20余份、雪菜30余份、其它50余份;并在其遠(yuǎn)緣雜交、國(guó)內(nèi)外優(yōu)良品種的分離、多個(gè)優(yōu)良性狀的聚合等方面做了大量的種質(zhì)儲(chǔ)備工作,這為順利完成本申請(qǐng)項(xiàng)目提供了良好的物質(zhì)條件。3、項(xiàng)目申請(qǐng)重點(diǎn)實(shí)施的游離小孢子培養(yǎng),將在依托單位的省蔬菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,該實(shí)驗(yàn)室擁有實(shí)施本項(xiàng)目所需的主要儀器設(shè)備,包括LI-6400便攜式光合儀、FACSCalibur 流式細(xì)孢儀、分光光度計(jì)、HPLC、無(wú)菌過(guò)濾器、超凈工作臺(tái)、MQ超純水裝置、制冰機(jī)、大容量離心機(jī)、人工氣候室、光溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、冰箱冰柜、大功率搖床、大容量滅菌鍋、分析天平、倒置顯微鏡、微機(jī)與統(tǒng)計(jì)分析軟件以及其它常規(guī)儀器等;和人工氣候箱、恒溫組培室、無(wú)菌操作室、可控溫室、連棟大棚、試驗(yàn)地等配套設(shè)

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