多糖的分離純化及分析

1、多糖的分離純化及分析多糖的分離純化及分析一、多糖的提取方法（一）溶劑提取法1、水提法 水提醇沉法是提取多糖最常用的一種方法.多糖是極性大分子化合物，提取時應(yīng)選擇水、醇等極性強的溶劑.用水作溶劑來提取多糖時，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提滲濾，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最終體積分數(shù)達到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜置5h，多糖的質(zhì)量分數(shù)和得率均較高.2、酸堿提法 有些多糖適合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。有些多糖在堿液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。與酸提類似，堿提中堿的濃度也應(yīng)得到有效控制，因為有些多糖

2、在堿性較強時會水解。3、超臨界流體萃取法超臨界流體萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的提取分離技術(shù).（二）生物酶提取法 酶技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用到有效成份提取中的一項生物技術(shù)，在多糖的提取過程中，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件中分解植物組織，加速多糖的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等的產(chǎn)物，常用的酶有蛋白酶，纖維素酶，果膠酶等。（三）超聲提取法 超聲波是一種高頻率的機械波，其主要原理是利用超聲波產(chǎn)生的“空化作用”對細胞膜的破壞，有利用植物有效成分的釋放，而且超聲波能形成強大的沖擊波或高速射流，有效地減小、消除與水相之間的阻滯層，加大了傳質(zhì)效率，有助于溶質(zhì)的擴散。

3、超聲波提取與傳統(tǒng)的提取方法相比，有提取效率高、時間短、耗能低等優(yōu)點。（四）微波提取 微波是頻率介于300mhz和300ghz之間的非電離電磁波，微波提取的原理是微射線輻射于溶劑并透過細胞壁到達細胞內(nèi)部，由于溶劑及細胞液吸收微波能 細胞內(nèi)部溫度升高，壓力增大，當壓力超過細胞壁的承受能力時，細胞壁破裂，位于細胞內(nèi)部的有效成份從細胞中釋放出來，傳遞轉(zhuǎn)移到溶劑周圍被溶劑溶解。二、多糖的分離純化（一）多糖的分離采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分級的方法可達到純化的目的可按溶解性不同進行分級、按分子大小和形狀分級(如分級沉淀、超濾、分子篩、層析等)，也可按分子所帶基團的性質(zhì)分級1、按溶解性不同分

4、離（1）分步沉淀法分步沉淀法是根據(jù)不同多糖在不同濃度低級醇、酮中具有不同溶解度的性質(zhì)，從小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮進行分步沉淀（2）鹽析法鹽析法是根據(jù)不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而將其分離的一種方法。常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，其中以硫酸銨最佳。2 、按電離性質(zhì)不同分離季胺鹽沉淀法季胺氫氧化物是一類乳化劑，能與酸性多糖形成不溶性化合物季銨絡(luò)合物，此絡(luò)合物在低離子強度的水溶液中不溶解而產(chǎn)生沉淀。若提高多糖液ph值或加入硼砂緩沖液，也可使中性多糖沉淀分離。常用季銨鹽有十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。3 、柱層析法 （1）凝膠柱層析法凝膠柱層析法常用的凝

5、膠有葡聚糖凝膠(sephadex)和瓊脂糖凝膠(sepharose)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，從而使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離。（2）纖維素陰離子交換劑柱層析法纖維素陰離子交換劑柱層析法常用的交換劑為deae一纖維素和ecteola一纖維素，分類硼砂型和堿型兩種，洗脫劑可用不同濃度堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優(yōu)點可吸附雜質(zhì)、純化多糖，并適用于分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙參多糖、太子參多糖等。（3）活性炭柱層析法活性炭吸附量大、效率高，是分離水溶性物質(zhì)的常用吸附劑。柱層析時活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀釋劑，以增加溶液的流速。糖溶液上

6、柱后先用水洗脫無機鹽、單糖等再依次增加乙醇濃度進行洗脫。（4）離子交換柱層析和普通凝膠柱層析聯(lián)用法 有些植物的多糖成分復(fù)雜， 除中性多糖外，還含有糖醛酸等，因此往往兩種不同性質(zhì)的色譜柱聯(lián)用才能得到單一多糖組分。（5）三種層析柱聯(lián)用 采用離子交換葡聚糖凝膠柱、丙烯葡聚糖凝膠柱和葡聚糖凝膠柱三者聯(lián)用，即先進行deaesephadexa柱層析，用蒸餾水洗脫。水洗組分進一步用sephacryls柱層析，得到主要組分再用sephadexg一100柱層析，有時會有較高的得率。4、色譜分離法常用兩種色譜分離方法：一是凝膠柱色譜法，二是離子交換色譜法.5、膜分離法膜分離技術(shù)（mst）是一種高效分離技術(shù)，分離過

7、程以選擇透過性膜作為分離介質(zhì)，通過在膜兩側(cè)施加某種推動力（壓力差、化學位差、電位差等），使原料液中組分有選擇性的通過膜.目前應(yīng)用較多的是超濾和微濾技術(shù).（二）多糖的純化 1、除蛋白：除蛋白質(zhì)時一般選擇能使蛋白質(zhì)沉淀而不使多糖沉淀的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時間短，溫度低，避免多糖降解。sevage法（氯仿：戊醇/丁醇=4：1）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有較好效果但要達到除盡游離蛋白質(zhì)的目的仍需反復(fù)處理。凍融和等電點沉淀除蛋白質(zhì)操作簡單，但多糖液里往往有低濃度的蛋白質(zhì)殘留，應(yīng)與其它方法結(jié)合使用。 2、 脫色：植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑(纖維素、

8、硅藻土、活性炭等)、離子交換柱(deae一纖維素)、氧化劑(h2o2)等脫除。活性炭比表面積大，吸附能力強，在進行當歸多糖的提取時只向多糖液中加入了01左右的活性炭，煮沸后濾過即完成了脫色操作。3、除小分子雜質(zhì)：小分子雜質(zhì)如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進一步脫除，提高純度。傳統(tǒng)的方法是透析法，該法操作簡單、技術(shù)成熟，但周期長，往往需要2一3天。而纖維濾器透析法利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級，這種方式可縮短生產(chǎn)周期，而且條件溫和。三、多糖的分析鑒定 1、含量的測定測定方法：硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子交換色譜法、yaphe法、薄層色譜法、酶法

9、、原子吸收法、hplc法、凝膠電泳法、親和電泳法等.每種方法只對某些多糖的測量效果好.比色法、分光光度法、離子交換色譜法、酶法和電泳法等可同時用于多糖的定性定量分析.2、純度鑒定多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說的多糖純品實質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分.多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、hlpc法等.現(xiàn)在應(yīng)用較多的是hlpc法，旋光度測定也是純度測定的一種方法.3、分子量的測定多糖分子量的測定是研究多糖性質(zhì)的一項重要工作.常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過率法、沉淀法、凝膠電泳法、hplc法、超離心分析法、分子篩色譜法、gpc法、malditofms法.4、結(jié)構(gòu)測定（1）多糖一級結(jié)構(gòu)測定多糖的一級結(jié)構(gòu)分析，主要是分析組成多糖的單糖類型、數(shù)目、連接方式及苷建構(gòu)型.常用化學法和儀器分析法.多糖結(jié)構(gòu)的分析方法很多，迄今沒有一種方法可以單獨完成多糖結(jié)構(gòu)的分析.儀器分析與化學方法