實驗室污染防治實用教案

1、PCR污染污染(wrn)的監(jiān)測的監(jiān)測 PCR強大擴增能力+檢測(jin c)的敏感性經(jīng)30個周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性，尤其對定量造成很大的問題NTC (No Template Control): 必須設(shè)置一個不含模板DNA但含有PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應(yīng)，這一對照管須在準備好所有其他PCR以后才進行吸加。 第1頁/共15頁第一頁，共15頁。常見常見(chn jin)的的PCR contamination 常規(guī)(chnggu)PCR 熒光定量PCRNTC432176598NTC第2頁/共15頁第二頁，共15頁。引起引起PCR污染污染(w

2、rn)的原因的原因模板間交叉( jioch)污染容器被污染模板放置時, 由于密封不嚴溢于容器外容器外粘有模板而造成相互間交叉( jioch)污染模板吸取過程中, 因氣溶膠（aerosol）或其他原因引起移液器污染，從而導(dǎo)致交叉( jioch)污染第3頁/共15頁第三頁，共15頁。引起引起(ynq)PCR污染的原因污染的原因 PCR試劑污染 PCR 試劑配制過程中, 移液器、容器、水等原因造成試劑被PCR 核酸(h sun)模板污染。第4頁/共15頁第四頁，共15頁。引起引起PCR污染污染(wrn)的原因的原因 PCR產(chǎn)物污染-最主要最常見 PCR 產(chǎn)物拷貝量大，極微量的PCR產(chǎn)物污染, 就可形

3、成(xngchng)假陽性。 移液器吸取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，同一支移液器去準備PCR mix PCR產(chǎn)物的氣溶膠污染： 一個氣溶膠顆粒可能含幾萬個拷貝氣溶膠（aerosol）：懸浮于氣體介質(zhì)中粒徑一般為 0.001m1000m的固體、液體微小粒子形成的膠溶狀態(tài)散體系?？諝馀c液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠, 在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)(fnyng)管, 開蓋時、吸樣時及移液器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠第5頁/共15頁第五頁，共15頁。引起引起PCR污染污染(wrn)的原因的原因 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染 克隆質(zhì)粒濃度高, 另外在純化(chn hu)過程中需用較多的用具及試劑, 其污染可能性也很大第6

4、頁/共15頁第六頁，共15頁。防止防止(fngzh)PCR污染污染首要原則永遠要設(shè)置NTC對照 如果不能在污染出現(xiàn)的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導(dǎo)致嚴重的后果：一大段時間的數(shù)據(jù)不可(bk)信準備PCR的移液器要專用 千萬不能用吸取PCR產(chǎn)物/克隆質(zhì)粒的移液器去準備PCR 體系第7頁/共15頁第七頁，共15頁。防止防止(fngzh)PCR污染污染空間： 合理分隔實驗區(qū)域:將樣品的處理、配制(pizh)PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)進行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴格分開。 理想狀態(tài)： 各個區(qū)域?qū)嶒炗闷芳耙埔浩鲗Ｓ?，實驗前?yīng)將該區(qū)域用紫外線消毒，破壞殘留的DNA或

5、RNA。第8頁/共15頁第八頁，共15頁。防止防止(fngzh)PCR污染污染操作一旦進入吸加PCR試劑(shj)的專用場所并開始工作，就應(yīng)戴上一副新手套，并應(yīng)勤于更換。準備專供自己使用的PCR試劑(shj)，分裝為小份。不要與樣品存放在一起。選擇質(zhì)量好的Eppendorf管-密封性好且開管不需要太大力氣打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。實驗結(jié)束后及時清理臺面第9頁/共15頁第九頁，共15頁。防止(fngzh)PCR污染移液器操作(cozu)由于操作(cozu)時不慎將模板吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣時要十分小心。1）準備P

6、CR的移液器專用2）吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成噴霧，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。3）最好在加完所有其他反應(yīng)成分后才吸加模板。4）推薦在準備PCR過程中使用濾芯槍頭第10頁/共15頁第十頁，共15頁。 選用含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶 Uracil-N-Glycosylase)的試劑，有助于防止PCR產(chǎn)物引起的污染。 UNG：50攝氏度，2分鐘，作用于含有dU的DNA雙鏈或單鏈 然后開始PCR反應(yīng)(fnyng)的預(yù)變性步驟，同時UNG失活防止(fngzh)PCR污染對于(duy)不含dU的PCR產(chǎn)物無效第11頁/共15頁第十一頁，共15頁。出現(xiàn)出現(xiàn)(chxin)污染后

7、解決辦法污染后解決辦法更換試劑 更換新的試劑和水，用確保無污染的移液器分裝備用清潔所有可能的污染源：實驗臺面、小離心機、冰箱門把手等等 1）實驗臺面、超凈工作臺用現(xiàn)配的3%雙氧水或10%次氯酸鈉溶液擦拭清潔。 2）或者用10%漂白粉溶液擦拭 3) 紫外光照射，照射距離應(yīng)不超過90 cm，照射時間最好過夜。實驗過程中更加小心，采用(ciyng)前面提到的各種防止污染的辦法第12頁/共15頁第十二頁，共15頁。參考文獻參考文獻 Kwok S ,Higuchi R. Avoiding false positives with PCRJ . Nature ,1989 ,339 (6221) :237 - 238. Mifflin T.E. Setting Up a PCR Laboratory. CSH Protocols; 2007; doi:10.1101/pdb.top14 第13頁/共15頁第十三頁，共